Sürücü yolları için seyir elde hedefe yönelik tedavi direnci: ilaca dirençli Subclone üretimi ve duyarlılık Gene Knock-down tarafından geri yükleme

Özet

Bu kanser yönetimi yüksek karşılanmamış bir tıbbi ihtiyaç olduğu hedeflenen terapötik ajanlar, Edinsel direnç mekanizmaları araştıran bir zaman ve cost effective vitro protokoldür.

Özet

Son yirmi yılda hedefe yönelik tedavi tıbbi Onkoloji sitotoksik ilaçların bir kayma gördüm. Hedeflenen terapötik ajanlar daha etkileyici klinik etkinliğinin ve geleneksel tedaviler daha simge durumuna küçültülmüş olumsuz etkileri göstermiştir rağmen ilaç direnci kendi yararları için ana sınırlama haline gelmiştir. Preklinik/tüp bebek/içinde vivo modelleri çeşitli klinik pratikte hedeflenen acentelere Edinsel direnç esas olarak iki stratejileri kullanarak geliştirilmiştir: genotip Edinsel direnç ve II) tüp bebek modelleme i) genetik manipülasyon / içinde vivo dayanıklı modeller yelpazesi. Mevcut çalışma, birleştirici bir çerçeve temel mekanizmaları hedeflenen terapötik ajanlar, ilaca dirençli hücresel subclones nesilden açıklaması için başlangıç için Edinsel direnç sorumlu soruşturma için Önerdiğimiz duyarlılık için engelleyici geri yüklemek için kullanılan yordamlar susturmak. Bu basit zaman ve cost effective yaklaşım yaygın olarak uygulanabilir ve kolayca farklı tümör histotypes diğer hedefli tedavi ilaçlara direnç mekanizmaları incelemek için uzun olabilir.

Giriş

Moleküler ve hücre biyolojisi çok önemli keşifler üzerinde takip, bir dizi yeni sentezlenmiş antikanser molekülleri seçmeli olarak tümör türleri geniş bir dizi oncogenic sinyal yollar hedeflemek için geliştirilmiştir. Özellikle, Onkoloji benzersiz özellikleri ile hedeflenen terapötik ajanlar iki kategoriye, yani sentetik kimyasal maddeler ve birleşimler ve rekombinant monoklonal antikorlar, klinik başarı ve önemli ölçüde değişmiş kanser bakımında elde ettik bilinmektedir son yıllarda^1,2,3.

Yine de, onların etkileyici ilk tepki rağmen tedavi, kanser hastalarının çoğunluğu ilaç direnci tüm hedeflenen terapötik ajanlar, Monoklonal antikor ve kinaz inhibitörleri ile geliştirdik. Sonuç olarak, ilaç direnci, klasik Anti-kanser ilaçlar⁴için büyük engel hala gelişmekte olan hedefli tedaviler^5,6için büyük bir mücadele var.

Hedefe yönelik tedavi direnci içsel olabilir (örneğin, birincil) veya (örneğin, ikincil) satın aldı. Yanıt-e doğru ilaç tedavisi⁷bir süre sonra ikincil direnç oluşur, ancak iç direnci tedaviye, yanıt de novo eksikliği açıklar. İkinci veya distal şifreli anatomik nişler içinde yer alan küçük tabur toplu ilkel tümör içindeki tümör hücreleri salgınları neden olduğu, % 90'a kadar sergileyen direnç birine veya daha fazlasına terapötik ajanlar hedef. Moleküler mekanizmalar hedefe yönelik tedavi için bir direnç geliştirme ağırlıklı olarak temel hedef gen mutasyonlarının ve hala tam⁸çok uzak olan anlayıştır diğer yanlısı hayatta kalma sinyal yolları gereksiz aktivasyonu neden.

Bu çalışmada, biz vitro mekanizmaları hedeflenen terapötik ajanlar, ilaca dirençli hücresel subclones nesilden damping açıklamaya başlayarak Edinsel direnç araştırmak için bir zaman ve cost effective yaklaşım önerdi duyarlılık engelleyici, test ve çalışma hipotezler doğrulama için kullanılan çok önemli bir aracı geri yüklemek için kullanılan yordamlar. Özellikle, bizim yaklaşım, mide kanseri, direnç mekanizmaları trastuzumab (örneğin, Herceptin), bir insanlaşmış Monoklonal antikor HER2 protein⁹ekstrasellüler etki alanı hedefleme için araştırmaya kullanıldı. Trastuzumab + kemoterapi yaygın HER2-pozitif metastatik meme kanseri için Standart birinci basamak tedavi olarak kabul edilir. Bu anti-HER2 gösterilen son preklinik çalışmalar sayesinde tedaviler önemli etkinliği içinde her iki vitro var ve in vivo HER2-pozitif mide kanseri^10,11modelleri, moleküler uyuşturucu HER2 hedefleme olmuştur kapsamlı klinik çalışmalar incelendiğinde, bazıları Gastroözofageal kanser^12,13,14,15olan hastalar üzerinde hala devam etmektedir.

Bu çalışmalar benzer şekilde ne için hedeflenen diğer tedavi inhibitörleri görülmektedir trastuzumab¹⁶, direnç karşılaşan hastaların artan sayıda vurgulamıştık. Özellikle, trastuzumab yanıt oranı % 47, ve ortalama genel sağkalım trastuzumab + kemoterapi hastalar için sadece 2,7 ay kemoterapi yalnız¹⁷hastalar için daha uzun oldu. Bu birincil trastuzumab direnç yaygın olmakla birlikte, ikincil trastuzumab direnç kaçınılmaz olduğunu ileri sürdü. Bu nedenle, içi tumoral genetik heterojenite bu neoplazi¹⁸göz önüne alındığında daha da sorunlu olan mide Kanserinde HER2 hedefli tedavi direnci neden mekanizmaları netleştirmek için acil bir ihtiyaç vardır.

Buna ek olarak, trastuzumab mide Kanserinde direnç mekanizmaları güvenilir preklinik modelleri temsilcisi bu durumun elde zorluk nedeniyle, kısmen açıklamak zor kanıtlamıştır. Oshima ve ark. trastuzumab dayanıklı mide kanseri hücre hatları, küçük bir kalıntı Periton metastaz tekrarlanan bir kültürünün trastuzumab¹⁹ile tedavi sonrası oluşan bir vivo içinde seçim yöntemi bildirdi. Ancak, bir muhafaza, belirli hayvan işleme uzmanlık ve hayvan Etik Kurulu onayı ihtiyacı zaman ve maliyet alıcı yöntemi yapmak için katkıda bulunmuştur. Biz bu çalışmada tarif yaklaşım basit ve yaygın olarak uygulanabilir ve kolayca farklı tümör histotypes²⁰tedavi diğer ilaçlara direnç mekanizmaları incelemek için uzun olabilir.

Protokol

Not: Bu protokol özellikle trastuzumab HER pozitif mide kanseri hücre hatları için Edinsel direnç yatan mekanizmaları analizi için ayarlandı. Bütün Laboratuvar Cihazları gerekli Malzemeler tablorapor edilir.

1. nesil hedefli tedavi dayanıklı Subclones

Not: Bu en kritik ve gerçeğini farklı hücre hatları farklı hassasiyetleri için hedeflenmiş tedavi inhibitörü bağımsız olarak kendi tümör histotype ya da ilaç konsantrasyonu sergileyebilirler nedeniyle adım protokolündeki standartlaştırmak zor olduğunu kullanılan.

1. Kültür ncı N87 cep RPMI Orta olarak 37 ° C'de monolayer fetal buzağı serum (% 10) ve glutamin (2 mM, % 1), takıma giriş ve 25 cm² kültür şişeler tohum.
2. Her şişeye 10 µg/mL trastuzumab kültür ortamında başlangıç dozu ekleyin. Büyüyen yeniden başlatana kadar başlangıç dozu için hücreleri göstermek.
   Not: Hedefe yönelik tedavi inhibitörü başlangıç dozunun 10 kat onun plazma en yüksek konsantrasyonu düşük olmalıdır. Plazma en yüksek konsantrasyonu genellikle birden fazla doz standart tedavisinin ardından hastanın kanında tespit ilaç konsantrasyonu en yüksek düzeyidir. Bu değer farmakokinetik üzerine çalışmalar alınabilir.
3. Hücre büyümesini trypan mavi dışlama yöntemi ile izlemek; (genellikle bir süre 2-3 hafta sonra) hücre büyümesini devam zaman trastuzumab 10 kat daha yüksek doz konsantrasyon için hücreleri göstermek.
4. Yüksek ilaç konsantrasyonu (en az 2.5 - 4'e katlanmış plazma pik yüksek) varlığı rağmen (yaklaşık 2 hafta sonra) büyüyen hücreler tutmak kadar hücreleri trastuzumab (üzerinden 100 µg/mL 400 µg/ml) yavaş yavaş artan bir doz için göstermek.
5. Aşağıdakinin her değişiminde hedef terapi inhibitörü kültür orta yoğunlukta hedefe yönelik tedavi direnç düzeyini değerlendirmek için klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar tahlil gerçekleştirmek ve göreli direnç IC₅₀ Endeksi (RR IC₅₀) aşağıdaki gibi tanımlayın.
   1. 24 çok iyi kültür plakaları 500 hücrelerde tohum.
      Not: 5 kuyu her koşul kümesi için hazırlanmalıdır.
   2. Hücreleri artan hedef terapi inhibitörü (trastuzumab) konsantrasyonları için 100 µg/mL 400 µg/mL kadar--dan göstermek.
   3. Hücreleri bir CO₂ kuluçka 37 ° C'de 15 gün kuluçkaya.
   4. Kuluçka sonra tamir ve örnekler aşağıdaki gibi leke.
      1. 10 mL 1 x PBS ile orta ve durulama hücre kaldırma. 1 x PBS kaldırın ve 2-3 mL fiksasyon çözeltisi (Asetik asit: metanol, 1:7, (vol/vol)) ekleyin. Fiksasyon çözüm kaldırın ve % 0,5 kristal violet çözüm ekleyin. 2 h için oda sıcaklığında kuluçkaya
      2. Kristal violet çözüm bir pipet ile alıyorum tarafından dikkatli bir şekilde çıkarın ve plakaları herhangi bir kristal violet çözüm artıkları durulama için musluk suyundaki batırmayın. Oda sıcaklığında 2 güne kadar kuruması.
   5. 50'den fazla hücre (4 X büyütme) ters bir mikroskop kullanarak koloniler sayılır.
      Not: İki bağımsız gözlemciler bunun için ihtiyaç vardır.
   6. RR IC₅₀ ŞA₅₀ değeri hedef terapi dayanıklı subclone hücre ve orijinal/saf hücre değeri arasındaki oran olarak hesaplayın.

2. doğrulama protokolü aday için tedavi direnci gen (R-gen) hedef

Not: gen ekspresyonu karakterizasyonu sonra imzalar ile ilişkili hedef terapi ve herhangi bir aday gen için Edinsel direnç gibi sürücü direnç üzerinden araştırılır: a) RT-PCR ve b) Western blot analizi.

1. Gerçek zamanlı RT-PCR
   1. Toplam RNA asit guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform karışımı kullanarak hücre satırlarından ayıklamak ( Tablo malzemelerigörmek).
   2. Rastgele hexamer primerler kullanılarak ters transkripsiyon (RT) reaksiyonları gerçekleştirmek ve termal cycler aşağıdaki gibi ayarlayın: 5 min, RT 20 dk 46 ° C'de ve RT inactivation 95 ° c için 1 dakika için 25 ° C'de priming.
   3. 20 µL tepki için toplam RNA'ın kullanım 400 ng. Örnek için aşağıdaki gibi tepki karışım hazırlamak: 7 µL RNase free H₂O 2 µL cDNA (10 ng/µL), hedef özgü sonda floresan etiketli x 1 µL 20 ve 10 µL 2 x karışımı içeren arabellek, dNTPs ve DNA polimeraz (bkz: Malzemeler tablo).
   4. Her iyi plakasına 20 µL tepki karışımı ekleyin ve aşağıdaki programı çalıştır: sahne 10 dk (1 dönüşü); 95 ° C'de 2 min için 50 ° C'de tutan o zaman 40 devredir 95 ° C'de 15 s ve 60 ° c için 1 dakika.
2. Batı leke
   1. 2 mL % 0.05 tripsin/EDTA çözeltisi ekleyip 2-3 dk tripsin çalışmak için izin hücre süspansiyonlar kurtarmak.
   2. Tripsin (örneğin, orta tripsin her 1 mL için 2 mL) etkisiz hale getirmek ve 1200 x g 5 dakika süreyle de atma süpernatant ve yıkama soğuk 1 x PBS hücrelerle santrifüj kapasitesi için orta içeren % 10 fetal sığır serum 2 cilt ekleyin.
   3. 1200 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Hücre Pelet lizis arabelleği ile resuspend ve 30 dk için 4 ° C'de bir rocker üzerinde kuluçkaya.
      1. Lizis arabellek hücreler (örneğin, 1 x 10⁶ hücreler için 100 µL); sayısına bağlıdır her zaman taze lizis arabellek hazırlamak emin olun. 1 mL lizis arabellek hazırlık (buz izinde) için: 975 µL M kullanın-memeli lysate arabellek, 15 µL fosfataz ve proteaz inhibitörleri ve 10 µL 100 µM PMSF inhibitörleri başına.
   4. Hücre lysate Santrifüjü 15dk için 4 ° C'de 13.000 x g de tarafından süpernatant protein kurtarmak.
   5. Protein konsantrasyonları BCA protein tahlil kullanarak belirleyin.
   6. 4 x LaemmLi örnek arabellek protein örnekleri (en az 20-30 µg protein) ve 3 dk 100 ° C'de ısı ekleyin.
   7. 20-30 µg LaemmLi protein çözüm ve 5-10 µL protein örnek standart yük ve prekast 4-%20 jeller kullanabilirsiniz.
   8. Western blot yüzük TRIS/GLICYNE /SDS 1 x arabellek ile doldurun ve (zaman aksi takdirde birkaç ek dakika çalıştırılır jel boya ulaştı onay durduğunda) jel 110 V 30-60 dakika çalıştırın
   9. Electroblot protein PVDF membran aktarmak için (bkz. Tablo reçetesi) yarı kuru sistem kullanarak.
   10. Membran üzerinde oda sıcaklığında shaker 1 h için uygun protein çözüm (süt/BSA % 5) ıslatarak engelleyin.
   11. 1: 400 çözüm anti-IQGAP1 birincil antikor ile %5 süt çözeltilerine olun ( Tablo malzemelerigörmek).
   12. Membran birincil antikor çözüm üzerinde bir shaker soğuk bir odada gece yerleştirin.
   13. Ertesi gün, antikor çözüm atmak ve T-TBS 1 x çözümde emmek (1 x T-TBS: Tris tuzlu arabellek eklendi 1 x Tween20 tarafından % 0,1) oda sıcaklığında bir shaker 7 min için üzerinde.
   14. T-TBS 1 çözüm ve Değiştir atın. 3 kez tekrarlayın.
   15. Algılama leke için standart Western antikor ekleyerek 1:10,000 ikincil fare-antikor yapmak a eriyik ( Tablo malzemelerigörmek) ve membran üzerinde bir shaker; 2 h için oda sıcaklığında bırakın.
   16. Antikor çözüm atmak ve T-TBS 1 x çözüm üzerinde 7 dakika oda sıcaklığında bir shaker içinde ıslatın.
   17. T-TBS 1 çözüm ve Değiştir atın. 3 kez tekrarlayın.
   18. Membran 5 min için chemiluminescent bir çözümde emmek ve membran Kemiluminesan Imager üzerinde görüntü.

3. geri yükleme hedef-terapi inhibitörü duyarlılık tarafından aday R-gen Knock-down

1. Hücre hazırlık
   1. Tek hücre süspansiyon tarafından trypsinization hazırlayın. Transfection hücreleri kaplama gününde gerçekleştirin.
      1. Yıkama ncı-N87 PBS ile hücreleri ve 5-10 dakika ekleyin 2 birim (örneğin, orta tripsin her 1 mL için 2 mL) tripsin nötralize etmek için RPMI orta içeren % 10 fetal sığır serum için % 0.05 tripsin/EDTA çözüm ile 37 ° C'de kuluçkaya.
      2. Trypan mavi boyama kullanarak bir hemasitometre ile hücreleri hesaplama. Her koşul için bir T25 cm² şişe üzerine tohum 2.5 x 10⁵ hücreleri (%60 izdiham).
         Not: Uygun için tohum hücrelerinin hücre satır katlama zaman ve deneme süresi tarafından belirlenir. Amaç hedef gen knock-down deneme süresi boyunca elde etmektir. Dokuz T25 cm² şişe transfection koşulları ve klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar tahlil (denetimler, negatif transfection denetimleri, gen-hedef transfection için 3 Şişeler için 3 Şişeler için 3 şişe) için idealdir.
2. Geriye doğru transfection
   1. Gen-hedef hazırlamak ve denetim transfection karışımı her T25 cm² şişe için aşağıdaki gibi negatif.
      1. Her gen hedefleme siRNA oligonucleotides veya negatif kontrol siRNA oligonucleotides en az önemli transfection orta (oranı 1:55; bkz: Malzemeler tablo) 12.5 µL sulandırmak.
      2. Katyonik lipozom transfection reaktifi (gen hedefleme siRNA oligonucleotides ile 1:1 oran; bkz: Malzemeler tablo) ekleyin. 20 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
         Not: Toplam transfection Mix 700 µL birimdir.
      3. Transfection Mix 700 µL her T25 cm² şişe ekleyin. 37 ° C'de hücreler 1-3 gün kuluçkaya.
   2. Gen knock-down RT-PCR ve Western blot analizi doğrulayın. Sözde R-gen knock-down (tekrar adım 1.5) koloni oluşumu deneyler yoluyla hedeflenen terapötik ajan için duyarlılık restorasyon üzerinde etkisini bir kez daha denetleyin.

Sonuçlar

Şekil 1 deneysel işlemin çerçevesinde özetliyor. Üç mide kanseri hücre-çizgi HER2 ve duyarlı trastuzumab için yüksek düzeyde ifade (IC₅₀ < en yüksek plazma düzeyini uyuşturucu, şekil 2A, sol grafik) kültür hedeflenen terapötik ajan içeren ortamda yetiştirilmiştir. Bir doz daha trastuzumab (10 µg/mL) en yüksek plazma konsantrasyonu başlangıç dozu ayarla ve yavaş yavaş artan 400 µg/mL 8-12 ...

Tartışmalar

Kişiselleştirilmiş ve hedeflenmiş tedaviler büyüyen coşku elicited, bu sözde 'akıllı' tedaviler geleneksel kemoterapi ilaçları, Yani, ilaç direnci hızlı ve öngörülemeyen edinimi olarak aynı büyük engel yüz. Hedefe yönelik tedavi sonuçlarını geliştirmek için ilaç direnci sorunları onları neden mekanizmaları daha iyi bir anlayış ile çözülmesi gerekir. Burada, biz hedefe yönelik tedavi ilaçlar kanser hücre satırı modellerinde Edinsel direnç mekanizmaları araştırmak içi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizol Reagent	Invitrogen	15596026	TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT	Bio-Rad	1708891	The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR.
TaqMan gene expression assay	Life Technologies	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	78501	Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Scientific	78440	Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates.
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard.
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample.
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	Bio-Rad	456-1094	Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis.
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards	Bio-Rad	1610376	Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE.
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs	Bio-Rad	1704156	Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane.
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate	Bio-Rad	1610381	StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots.
Immun-Star WesternC solution	Bio-Rad	5572	Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein.
Universal Negative Control	Invitrogen	12935300	Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology.
opti-MEM Glutamax Medium	Thermo Fisher Scientific	51985026	Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology.
Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA	Ambion	4390824	RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types.
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778075	Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types.
Mouse anti-IQGAP1	Invitrigen	33-8900	working concentration: 1:400 in 5% milk solution
goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	working concentration: 1:10000 in 5% milk solution
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase
Thermocycler for RT-PCR	MJ Research	MJ Research PTC-200 Thermal Cycler	it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Real Time RT-PCR instrument	Applied Biosystems	7500 RT-PCR system	This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Microvolume Spectrophotometers	Thermo Scientific	Nanodrop	It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample
Blotting system	Bio-Rad	Trans-Blot Turbo system	It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes
Image acquisition system and gel documentation	Bio-Rad	Chemidoc image system	It is easy to use for chemiluminescent detection