JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويصف هذا البروتوكول أساليب لتسجيل استجابة جذع الدماغ السمعية من الجراء الفئران بعد الولادة. دراسة تطور وظيفي لخلايا الشعر الخارجي، يرد وصف للإجراءات التجريبية لتصحيح كامل الخلية المشبك تسجيل في عزل خلايا الشعر الخارجي خطوة بخطوة.

Abstract

خلية الشعر الخارجي واحد من هذين النوعين من الخلايا الشعر الحسي في القوقعة الثدييات. أنها تغير طول الخلايا مع مستقبلات محتملة لتضخيم الاهتزاز ضعيف لإشارة الصوت منخفض المستوى. مورفولوجيا والخاصية الكهربية لخلايا الشعر الخارجي (أوهكس) تضع في سن مبكرة بعد الولادة. نضوج خلية الشعر الخارجي قد تسهم في تطوير النظام السمعي. ومع ذلك، عملية التنمية أوهكس لم تدرس جيدا. وهذا جزئيا بسبب صعوبة قياس وظيفتها بنهج الكهربية. هدف تطوير طريقة بسيطة لمعالجة هذه المسألة المذكورة أعلاه، هنا نحن تصف بروتوكول خطوة بخطوة لدراسة وظيفة أوهكس في القوقعة حاد ينتابها من الفئران بعد الولادة. مع هذا الأسلوب، يمكننا تقييم cochlear الاستجابة للمحفزات نغمة نقية ودراسة مستوى التعبير ووظيفة بريستين موتور البروتين في أوهكس. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب للتحقيق في خلايا الشعر الداخلية (إيكس).

Introduction

وظيفتين متميزتين من خلايا الشعر الحسية cochlear ضرورية لاستماع الثدييات: ميتشانويليكتريك تنبيغ (MET) واليكتروموتيليتي1،2. MET القنوات الموجودة في حزمة الشعر، إيكس (إيكس) وأوهكس تحويل الاهتزاز الصوت إلى غشاء التغييرات المحتملة، فضلا عن الإشارات الكهربائية من دوامة معصب العقدة العصبية. أوهكس تغيير طول الخلية بغشاء المحتملة وتضخيم الاهتزاز للصوت منخفض المستوى. يتم اشتقاق هذا النشاط الذي يطلق عليه اليكتروموتيليتي بريستين البروتين المحرك الموجود في الجدار الجانبي أوهكس3.

في العديد من الأنواع بما فيها القوارض، وظيفة السمع غير ناضجة في عصر ما بعد الولادة المبكرة4،5. تعذر الكشف عن لا إمكانات العمل استجابة لإشارات الصوت في القشرة السمعية قبل بداية الجلسة6،7. ودرست التنمية مورفولوجيا ووظيفة القوقعة على نطاق واسع في الماوس، وعضل، والفئران4،،من58. ميتشانوترانسدوكشن واليكتروموتيليتي من خلايا الشعر وتوضع أيضا في أوائل حقبة الحياة5.

من أجل تقييم حساسية السمع من الفئران في مختلف الإعمار ما بعد الولادة، قمنا بتطوير طريقة لاستجابة جذع الدماغ السمعية (ABR) التسجيل في الجراء الفئران. تصحيح كامل الخلية المشبك عبارة عن تقنية مثالية للتحقيق في أوهكس اليكتروفيسيولوجيكالي. ومع ذلك، مقارنة مع المشبك التصحيح المنجزة في الخلايا العصبية والخلايا الظهارية الأخرى، المعدل المنخفض لختم كامل الخلية محدودة التحقيق في اليكتروموتيليتي أوهكس معزولة.

هنا يصف لنا إجراء للتحقيق في أوهكس شكلياً واليكتروفيسيولوجيكالي في القوقعة حاد ينتابها من الفئران بعد الولادة. يمكن تعديل هذا الأسلوب لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم التنمية الداخلية الشعر الخلية ووظيفتها.

Protocol

كافة البروتوكولات التجريبية التي تنطوي على الموضوعات الحيوان بموافقة "لجنة الأخلاقيات الحيوان" "الجامعة الطبية جنوب".

1. إعداد حلول لتجارب

  1. تحضير المخدر (انظر الجدول للمواد): 1.5% بينتوباربيتال الصوديوم المذابة في ddH2o.
  2. إعداد الحل تشريح (انظر الجدول للمواد): حل كيس واحد من مسحوق L-15 في ليبوفيز في 1 لتر من ddH2O. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.3 مع 1 م هيدروكسيد الصوديوم. ضبط الاسموليه لموسم 300-330 باستخدام أوسموميتير و 10 ملم حبيس قبل الاستخدام.
  3. حل 2 مغ/مل كولاجيناز الرابع (انظر الجدول للمواد) في حل تشريح إعدادها في الخطوة 1.2.
  4. إعداد الحلول إيمونوستينينج (انظر الجدول للمواد): حل بارافورمالدهيد 4% في المحلول الملحي الفوسفات مخزنة (PBS).
    تنبيه: بارافورمالدهيد السامة؛ ملابس الحماية المناسبة.
  5. تمييع عامل نفاذية 0.3% في برنامج تلفزيوني. تمييع مصل الماعز العادي 10% في برنامج تلفزيوني كحظر المخزن المؤقت. تضعف 1: 200 جسم بريستين في المخزن المؤقت لحظر. تضعف مقاومة جسم مترافق Alexa488 في المخزن المؤقت لحظر. تضعف 1: 200 إيسوثيوسياناتي "ب" فالويدين-تيتراميثيلرهوداميني في برنامج تلفزيوني.
  6. إعداد الحل خارج الخلية (انظر الجدول للمواد): إعداد المتوسطة L-15 ليبوفيز النحو المبين أعلاه (الخطوة 1، 2).
  7. إعداد الحل داخل الخلايا (انظر الجدول للمواد).

2-العبر التسجيل

ملاحظة: تسجيل ABR سابقا وصفت بالتفصيل في موقعنا الدراسة السابقة9.

  1. تخدير الفئران سبراغ داولي (SD) (الجراء يوم 1-14 القديمة والكبار 2-شهر القديمة، وكلا الجنسين) بحقنه واحدة من الصوديوم 1.5% بينتوباربيتال (22 ملغ/كغ الجراء و 30 ملغ/كغ للبالغين، وداخل (القائمة)).
  2. مكان هذا الحيوان أنيسثيتيزيد في العفن رغوة البولي إثيلين شل جسم الحيوان. ضع الحيوان على طاولة المضادة اهتزاز في غرفة لتخفيف الصوت. الحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان في 37.5 درجة مئوية مع وسادة تدفئة.
  3. مسح منطقة الرأس مع الإيثانول 70% (المجلد/المجلد). باستخدام مقص غرامة، إجراء شق 1-2 مم فينترولاتيرال بينا خارجي وضع مرجع قطب كهربائي أو الأرض. قطب إبرة تحت الجلد (تسجيل القطب) يقع على قمة الجمجمة (الشكل 1A).
  4. استخدام مولد الدالة، تولد لهجة معايرة رشقات نارية (1 ms الارتفاع/الانخفاض، الهضبة 3 مللي ثانية) لترددات مختلفة (2، 4، 8، 16 و 24 و 32 كيلو هرتز) وكثافة (انخفضت من 85 إلى 10 ديسيبل SPL في الخطوة 5 dB). تختلف في التردد والسعة يدوياً أو باستخدام جهاز كمبيوتر. تقديم المحفزات السليمة من خلال أحد المتكلمين الالكتروستاتيكي تقع 10 سم بعيداً نحو رأس الحيوان.
  5. تصفية (100 1,000 هرتز) وتضخيم ومتوسط (256 مرات) الصوت انتزع إمكانات استخدام معالج متعدد الوظائف للحصول Abr. ويتم رصد آثار العبر عبر الإنترنت وتخزينها للتحليل دون اتصال. ويستغرق حوالي 40 دقيقة لإكمال ABR تسجيل من الحيوان واحدة.
    ملاحظة: عادة، من ثلاث إلى سبع قمم (موجه أنا موجه السابع) مع الاختفاء أقل من 15 مرض التصلب العصبي المتعدد يمكن تحديدها (الشكل 1B). عتبة ABR يعرف الحد الأدنى لمستوى الصوت في الموجه التي يمكن الكشف الأول والثاني.
  6. Euthanize من قبل الحيوانات مستيقظا من التخدير (مع حقن داخل بينتوباربيتال الصوديوم 1.5% 0.3 مل).

3-تشريح الجهاز من كورتي (OC)

  1. تخدير الجراء الفئران. للفئران القديمة أقل من 6 أيام (< P6) وإبقاء الحيوان في صحن ثقافة 100 مم، وتغطي الطبق مع الثلج لمدة 10 دقائق. للفئران > P6، تخدير الحيوان بحقنه واحدة من بينتوباربيتال الصوديوم 1.5% (22 مغ/كغ، والقائمة). قطع رأس الجراء الفئران بعد التخدير.
  2. تعقيم الرأس بالرش مع الإيثانول (المجلد/المجلد) 70%.
  3. فتح الجمجمة على طول خط الوسط السهمي مع مقص؛ إزالة الدماغ لفضح الإذن الداخلية.
  4. نقل الإذن الداخلية إلى طبق بتري 35 ملم مليئة 3 مل من المثلج L-15 (الشكل 2A).
  5. تحت مجهر التشريح، استخدام الملقط غرامة لإزالة الكبسولة عظمى من القوقعة (الشكل 2).
  6. بسط قائد والمرتبطة فاسكولاريس ستريا (SV) من موديولوس.
  7. بعقد فصل الجزء القاعدي من SV بالملقط، قائد من SV تماما بالاسترخاء ببطء من القاعدة إلى قمة (الشكل 2).
  8. قطع قائد المنطقة بالتساوي إلى ثلاث قطع باستخدام مقص غرامة (الشكل 2D).

4-الفلورة تلطيخ

  1. باستخدام تلميح ماصة 200 ميليلتر، نقل أجزاء OC (الخطوة 3.8) إلى شريحة زجاج، والإصلاح مع 100 ميليلتر من بارافورمالدهيد 4% على الأقل من 4 ح في 4 درجات مئوية.
    تنبيه: بارافورمالدهيد السامة؛ ملابس الحماية المناسبة.
  2. يغسل النسيج بإزاحة بارافورمالدهيد مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني جديد. تغسل الأنسجة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق.
  3. احتضان الأنسجة مع عامل نفاذية 0.3% في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. تجاهل عامل النفاذية في برنامج تلفزيوني وغسل الأنسجة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  5. كتلة مع 10% مصل الماعز العادي في برنامج تلفزيوني عن ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
  6. احتضان مع الأضداد المضادة-بريستين-ج--المحطة (1: 200) في عرقلة الحل ح 2 في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  7. أغسل ثلاث مرات ببرنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  8. احتضان مع مترافق Alexa488 الأجسام المضادة الثانوية (مقاومة) في عرقلة الحل ح 1 في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  9. أغسل ثلاث مرات ببرنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في الظلام.
  10. احتضان مع والرودامين-فالويدين (1: 200) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  11. أغسل ثلاث مرات ببرنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في الظلام.
  12. جبل على شريحة زجاجية مع تصاعد المتوسطة (التي تحتوي على DAPI). صورة مع [كنفوكل] مجهرية باستخدام 405 نانومتر، 488 نانومتر، و 594 نانومتر الليزر. تعيين السلطة الليزر في 0.1-0.5 ميغاواط والمسح الضوئي بسرعة في إطار/ثانية 0.5.

5-تصحيح المشبك "تسجيل أوهكس معزولة"

  1. استخدام ساحبة ماصة والصغرى-صانعا لجعل التصحيح pipettes يبلغ قطرها تلميح 2-3 ميكرومتر-مرة أخرى--ملء الماصات مع الحل داخل الخلايا. عادة، كانت المقاومة الأولية لتصحيح ماصة MΩ 2.5 3.5 في حمام الحل.
  2. باستخدام تلميح ماصة 200 ميليلتر، تحويل قطعة من قائد (من الخطوة 3، 8) إلى 35 مم طبق بيتري. هضم الأنسجة مع 100 ميليلتر من الهضم الأنزيمي المتوسطة (كولاجيناز الرابع، انظر الجدول للمواد) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. يزيح متوسطة الهضم الأنزيمي مع 100 ميليلتر من L-15. قطع الأنسجة إلى قطع صغيرة باستخدام مشرط الجزئي لعزل خلايا الشعر.
  4. بعد بيبيتينج لطيف، نقل الخلايا إلى غرفة بلاستيكية صغيرة محلية صنع (قطر ~ 1.5 سم) مليئة بحل حمام خال من إنزيم (~ 1.5 مل، انظر الجدول للمواد).
  5. ضع الدائرة على مرحلة المجهر المقلوب. العثور أوهكس الانفرادي صحية الظهور.
  6. تحميل ماصة التصحيح في مرحلة الرأس مكبر للصوت 700B. نقل ماصة التصحيح بعناية قبل ميكرومانيبولاتور ووضعه حول الجزء السفلي من الخلية الشعر الخارجي (الشكل 3A).
  7. تصحيح كامل الخلية المشبك والنشرمحفوظه بختم الجدار الجانبي من جسم الخلية. تطبيق شفط الخفيفة حتى هو تمزق في غشاء الخلية. تعيين إجراء محتمل في-70 mV. الخلايا مع المقاومة الوصول تتراوح من 10 إلى 17 MΩ ومقاومة الغشاء تراوحت من 100 إلى 500 MΩ، وتعتبر تكوين كامل الخلية ناجحة.
  8. مراقبة الكمبيوتر، باستخدام تطبيق هايبربولاريزينج وديبولاريزينج الجهد (250 ms المدة وتتراوح بين −140 + 94 أم في 13 mV الخطوات) للخلية للحصول على كامل الخلية التيارات.
  9. تضخيم التيارات كامل الخلية، وتصفية (الزاوية تردد 5 كيلوهرتز) بمكبر للصوت 700B. تحويل البيانات بتحويل 1440A ومخزن للتحليل دون اتصال.
  10. قياس السعة غشاء من أوهكس استخدام بروتوكول حافز جهد موجه جيبية بمعدل اثنين تسيطر برمجيات المشبك تصحيح. تعيين نطاق الجهد الحث من-140 إلى 110 mV. تخزين البيانات للتحليل دون اتصال.

النتائج

يمكن أثارت العبر من الفئران تخديره الجراء الأقدم من يوم الولادة 7 (P7) استخدام لهجة نقية رشقات نارية (الشكل 1A). كما هو مبين في الشكل 1 باء، الحصول على الطول الموجي العبر من الجراء الفئران أظهرت سوى ثلاث أو أربع موجات متميزة مع السعة الصغيرة. عا...

Discussion

في فئران أصغر سنا من يوم 11، يمكن ملاحظة لا إمكانات العمل استجابة للتحفيز سليمة في القشرة السمعية6،7. ولذلك، بعد الولادة يوم 11 توصف بأنها "بداية جلسة الاستماع"10. تطوير وظيفة السمع قبل بداية جلسة الاستماع لم تدرس جيدا حتى الآن. استخدام أسلوب مماثل ?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل منح من برنامج 973 (2014CB943002) والوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (11534013, 31500841).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthetic
Pentobarbital sodiumSigmaP37611.5% in water
NameCompanyCatalog NumberComments
Dissection solution
Leiboviz's L-15 MediumLife Technologies41300-0391 pack in 1 L water
Collagenase IVSigmaC51382 mg/mL in L-15
HEPESSigma7365-45-910 mM
NameCompanyCatalog NumberComments
Immunostaining solutions
PBSThermo Fisher Scientific10010023PH 7.3
ParaformaldehydeSigma1581274% in PBS
Triton X-100AmrescoZS-06940.3% in PBS
Normal goat serumThermo Fisher Scientific10000C10% in PBS
prestin antibodySanta CruzSC-22694dil 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated antibodyThermo Fisher ScientificA-11055dil 1:600
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanateSigmaP1951dil 1:200
DAPISolarbioC0060dil 1:20
NameCompanyCatalog NumberComments
Extracellular solution
Leiboviz's L-15 MediumLife Technologies41300-0391 pack in 1 L water
HEPESSigma7365-45-910 mM
NameCompanyCatalog NumberComments
Intracellular solution
CsClSigma7647-17-8140 mM
MgCl2Sigma7791-18-62 mM
EGTASigma67-42-510 mM
HEPESSigma7365-45-910 mM
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
OsmometerGonotecOSMOMAT 3000 basic
ForcepWPI14095Tweezers dumont
Micropipette pullerSutter InstrumentMODLE-P97
Micro ForgeNarishigenMF-830
Mini Operating SystemSutter InstrumentMP-285
MultiClampAxon700B
Low-Noise Data Acquisition SystemAxon1440A
ES1 speakerTucker-Davis Technologies
TDT system 3Tucker-Davis Technologies
NameCompanyCatalog NumberComments
Software
SigGenRP softwareTucker-Davis Technologies
BioSigRP softwareTucker-Davis Technologies
jClampScientific Solutions
NameCompanyCatalog NumberComments
Animal
SD ratExperimental Animal Center of Southern Medical University

References

  1. He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. a. n. t. o. s. -., J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
  2. Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).
  3. Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405, 149-155 (2000).
  4. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  5. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).
  6. Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex. Nat Neurosci. 4, 1123 (2001).
  7. De, V. -. S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat. J Neurosci. 27, 180-189 (2007).
  8. He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells. Hearing Res. 78, 77-90 (1994).
  9. Hang, J., et al. Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats. Neural Plast. , 4545826 (2016).
  10. Ehret, G. Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus). J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).
  11. Møller, A. R. . Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , (2006).
  12. He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. Isolation of cochlear inner hair cells. Hearing Res. 145, 156-160 (2000).
  13. Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor. J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).
  14. Fu, M., et al. The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells. Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

135

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved