JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu iletişim kuralı İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi postnatal fare pups üzerinden kaydetmek için yöntemler açıklanır. Dış saç hücreleri fonksiyonel gelişimi incelemek için tüm hücreli yama kelepçe dış saç hücreleri izole kayıt deneysel işlemin adım adım açıklanmıştır.

Özet

Dış saç hücre duyu saç hücreleri memeli koklea içinde iki tür biridir. Onlar kendi cep uzunluğu reseptör alt düzey ses sinyalinin zayıf titreşim yükseltmek için potansiyel ile değiştirin. Morfoloji ve dış saç hücrelerinin (OHCs) elektrofizyolojik özelliği erken postnatal yaşlarda geliştirmek. Dış saç hücre olgunlaşma işitme sisteminin gelişimine katkıda bulunabilir. Ancak, OHCs geliştirme sürecinin de incelenmiştir değil. Bunun nedeni kısmen zorluk işlevlerine elektrofizyolojik bir yaklaşım tarafından ölçmek için olmasıdır. Yukarıdaki sorunu gidermek için basit bir yöntem geliştirmek amacı ile burada biz OHCs işlevinde akut Disosiye koklea postnatal fareler üzerinden çalışmak için adım adım bir protokol tanımlamak. Bu yöntemle, saf ton uyaranlara koklear yanıtı değerlendirmek ve ifade düzey ve OHCs motor protein prestin işlevini inceleyin. Bu yöntem aynı zamanda iç saç hücreleri (IHCs) araştırmak için kullanılabilir.

Giriş

Koklear duyu saç hücreleri iki farklı işlevi memeli işitme için önemlidir: mechanoelectric iletim (MET) ve electromotility1,2. Saç demeti, IHCs (IHCs) ve OHCs dönüştürmek ses titreşim membran olası değişiklikleri içine yanı sıra içinde elektrik sinyallerini innervated sarmal ganglion nöronların bulunan MET kanalları tarafından. OHCs onların hücre membran potansiyeli ile değiştirmek ve düşük seviyeli Ses titreşimi yükseltmek. Electromotility olarak adlandırdığı bu faaliyet OHCs3lateral duvarında bulunan motor protein prestin tarafından türetilmiştir.

Kemirgenler de dahil olmak üzere birçok tür, işitme fonksiyonu erken postnatal dönem4,5' te olgunlaşmamış. Hiç aksiyon potansiyeli seda cevaben önce işitme başlangıçlı6,7işitsel korteks tespit edilemedi. Morfoloji gelişimi ve koklea fonksiyonu, yaygın olarak fare, fare ve sıçan4,5,8çalışılmıştır. Mechanotransduction ve electromotility saç hücrelerinin de erken gelişmiştir hayat dönemi5.

Fareler işitme duyarlılığını farklı postnatal yaş değerlendirmek için fare pups içinde kayıt İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi (ABR) için bir yöntem geliştirdi. Bütün hücre yama kelepçe OHCs electrophysiologically araştırmak için ideal bir teknolojidir. Ancak, sinir hücreleri ve diğer epitelyal hücreler yıllarındaki yama kelepçe ile karşılaştırıldığında, tüm hücreli sızdırmazlık oranı düşük izole OHCs electromotility incelenmesi sınırlı.

Burada OHCs morfolojik ve electrophysiologically Doğum sonrası fareler gelen akut Disosiye koklea içinde araştırmak için bir yordam açıklanmaktadır. Bu yöntem iç saç hücre gelişimi ve işlev düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için değiştirilebilir.

Protokol

Hayvan konular içeren tüm deneysel protokoller Güney Tıp Üniversitesi hayvan Etik Komitesi tarafından kabul edildi.

1. deney için çözümleri hazırlayın

  1. Anestezi hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek): % 1.5 Fentobarbital sodyum çözünmüş GKD2' O.
  2. Diseksiyon çözüm hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek): bir GKD2O. ayarlama pH 7,3 için 1 L 1 M NaOH ile Leiboviz'ın L-15 toz torba geçiyoruz. OSMOLARİTE 300-330 mOsm için bir osmometer ve 10 mM HEPES kullanmadan önce kullanarak ayarlayın.
  3. 2 mg/mL collagenase IV dağıtılması ( Tablo malzemelerigörmek) 1.2 adımda hazırlanan diseksiyon solüsyona.
  4. (Bkz: Malzemeler tablo) immunostaining çözümleri hazırlamak: fosfat tamponlu tuz (PBS) % 4 paraformaldehyde geçiyoruz.
    Dikkat: Paraformaldehyde toksik; uygun koruma giymek.
  5. PBS % 0,3 geçirgenliği Ajan sulandırmak. PBS % 10 normal keçi serum engelleme tampon olarak sulandırmak. Prestin antikor 1: 200 engelleme arabelleği sulandırmak. Alexa488 Birleşik antikor 1:600 engelleme arabelleği sulandırmak. Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate 1: 200, PBS sulandırmak.
  6. Hücre dışı çözüm hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek): Leiboviz'ın L-15 orta (yukarıdaki adım 1.2) açıklandığı şekilde hazırlayın.
  7. Hücre içi çözüm hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek).

2. ABR kayıt

Not: ABR kayıt daha önce ayrıntılı bizim önceki çalışma9olarak tarif edilmiştir.

  1. Sprague Dawley (SD) fareler (1-14 gün eski pups ve 2 - ay yaşlı yetişkinler, her iki cinsiyette) % 1.5 sodyum Fentobarbital (22 mg/kg için yavru ve yetişkin, mayi için 30 mg/kg (IP)) tek bir enjeksiyon ile anestezi.
  2. İmzalat hayvan hayvanın vücut hareketsiz için Polietilen köpük kalıp içine yerleştirin. Hayvan ses inceltiyorum oda bir anti-titreşim tablosunda yerleştirin. Hayvanın vücut sıcaklık 37,5 ° C bir ısıtma yastığı ile tutun.
  3. % 70 (vol/vol) etanol ile baş alanı silin. İyi makas kullanarak, bir 1-2 mm kesi ventrolateral referans elektrot veya yere yerleştirmek için dış pinna için yapın. (Elektrot kayıt) bir deri altı iğne elektrot (Şekil 1A) kafatası tepe üzerinde yer alır.
  4. İşlev üreteci kullanarak oluştur kalibre edilmiş sesi patlamaları (1 ms yükselme/düşme, 3 ms Yaylası) çeşitli frekansları (2, 4, 8, 16, 24 ve 32 kHz) ve yoğunluklarda (5 dB adımda 10 dB SPL için 85 azalmış). Frekans ve genlik el ile farklı farklı veya bir bilgisayar kullanarak. 10 cm uzakta hayvan Başkanı doğru yer alan bir elektrostatik hoparlöründen ses uyaranlara teslim.
  5. (100-1000 Hz) filtre ve bir çok fonksiyonlu işlemci ABR'lerden almak için (256 kere) ses elicited potansiyel kullanarak ortalama yükseltmek. ABR izlemeler çevrimiçi ve çevrimdışı analiz için saklı izlenir. Bir hayvan kayıt ABR tamamlamak için yaklaşık 40 dakika sürer.
    Not: genellikle, üç ila yedi tepeler (dalga ben dalga VII) gecikme süreleri ile 15 ms olabilir daha az (Şekil 1B) tespit. ABR eşik hangi dalga ı ve II tespit edilebilir en düşük ses seviyesi tanımlanır.
  6. Anestezi (ile 0.3 mL % 1.5 sodyum Fentobarbital mayi bir enjeksiyon) üzerinden uyanık hayvanlar önce ötenazi.

3. Organ of Corti (OC) diseksiyon

  1. Fare pups anestezi. İçin rats az 6 günlük (< P6), hayvan bir 100 mm Kültür çanak tutmak ve 10 min için buz ile çanak kapağı. Fareler için > P6, % 1.5 sodyum Fentobarbital (22 mg/kg, IP) tek bir enjeksiyon hayvanla anestezi. Fare pups anestezi sonra başını kesmek.
  2. Baş % 70 (vol/vol) etanol ile püskürtülerek sterilize.
  3. Kafatası sagittal orta çizgi boyunca makasla açın; beyin iç kulak ortaya çıkarmak için kaldırın.
  4. İç kulak içine buz gibi L-15 (Şekil 2A) 3 mL ile dolu 35-mm Petri kabına aktarın.
  5. Diseksiyon mikroskop altında iyi forseps koklea (Şekil 2B) kemikli kapsül kaldırmak için kullanın.
  6. OC paketini açmak ve çizikleri vascularis (SV) modiolus üzerinden ilişkili.
  7. Tutarak SV ile forseps, bazal bölümünü ayrı OC SV tamamen tarafından yavaş yavaş gevşemek Bankası-için-apex (Şekil 2C).
  8. OC eşit iyi makas (Şekil 2B) kullanarak üç parçalar halinde kesin.

4. ayirt boyama

  1. 200 µL pipet ucu kullanarak, OC (adım 3.8) kesimleri bir cam slayt üzerine transfer ve % 4 paraformaldehyde için en az 4 h 4 ° C'de 100 µL ile saptamak
    Dikkat: Paraformaldehyde toksik; uygun koruma giymek.
  2. Doku paraformaldehyde ile taze PBS 100 µL yerinden tarafından yıkayın. Doku 10 min için üç kez yıkayın.
  3. Oda sıcaklığında 30 dk için PBS içinde % 0,3 geçirgenliği Ajan dokuyla kuluçkaya.
  4. PBS geçirgenliği Ajan atın ve doku üç kez PBS ile yıkayın.
  5. Oda sıcaklığında 1 h için PBS içinde % 10 normal keçi serum ile engelleyin.
  6. Oda sıcaklığında veya 4 ° C'de 2 h için çözüm gecede kapatmaktır anti-prestin-C-terminus antikor (1: 200) ile kuluçkaya.
  7. Üç kez PBS ile 5 dakika yıkayın.
  8. Alexa488-Birleşik ikincil antikorlar ile (1:600) içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 1 h için engelleme çözümde kuluçkaya.
  9. Üç kez karanlıkta 5 min için PBS ile yıkayın.
  10. Rodamine-phalloidin (1: 200) ile karanlık oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
  11. Üç kez karanlıkta 5 min için PBS ile yıkayın.
  12. Bir cam slayt üzerinde (DAPI içeren) montaj orta ile bağlayın. 405 kullanarak confocal mikroskobu ile görüntü nm, 488 nm ve 594 nm lazerler. Lazer güç 0.1-0,5 ayarla mW ve tarama hızı 0.5 kare/s.

5. yama kelepçe izole OHCs kayıt

  1. Yama yapmak için mikro-kalpazan uç çapı ile pipettes 2-3 µm. geri dolgu ile hücre içi çözüm Pipetler ve pipet çektirmenin kullanın. Genellikle, yama pipet ilk direnç 2.5-3.5 MΩ banyo çözüm oldu.
  2. 200 µL pipet ucu kullanarak, OC (Kimden adım 3.8) bir parça bir 35 mm Petri kabına aktarın. Enzimatik sindirim orta 100 µL dokuyla sindirmek (collagenase IV, bkz: Malzemeler tablo) Oda sıcaklığında 5 min için.
  3. L-15 100 µL ile enzimatik sindirim orta yerinden. Doku saç hücreleri izole etmek için mikro neşter kullanarak küçük parçalar halinde kesin.
  4. Nazik pipetting sonra hücreleri bir ev yapımı küçük plastik odasına aktar (çapı ~ 1,5 cm) enzimi içermeyen banyo çözüm ile dolu (~ 1,5 mL, Tablo malzemelerigörmek).
  5. Odası ters bir mikroskop sahnesinde yerini. Sağlıklı görünen yalnız OHCs bulmak.
  6. Yama pipet 700B amplifikatör baş sahne içine yükleyin. Yama pipet dikkatli bir micromanipulator tarafından hareket ve dış saç hücresi (Şekil 3A) alt konumlandırın.
  7. Bütün hücre yama kelepçe hücre vücut lateral duvarına mühürleyerek OHC. Hücre zarı yırtıldı kadar ışık emici uygulamak. Holding-70 potansiyel ayarla mV. Hücreleri için 17 MΩ 10 değişiyordu erişim direnç ve membran direnç için 500 MΩ 100 değişiyordu ve başarılı bir bütün-hücre yapılandırma olarak kabul edilir.
  8. Bilgisayar kontrolü, kullanarak uygulama hyperpolarizing ve gerilim depolarize (250 ms süresi ve −140 + 94 için değişen 13 mV adımda mV) bütün hücreli akımları temin için hücreye.
  9. Bütün hücre akımları yükseltmek, 700B amplifikatör tarafından (5 kHz Frekans köşe) filtre. 1440A converter ve çevrimdışı analiz için mağaza tarafından verileri dönüştürmek.
  10. Bir yama kelepçe yazılım tarafından kontrollü bir iki sinüs dalga gerilim uyarıcı iletişim kuralı kullanılarak OHCs membran kapasitans ölçmek. Stimulate voltajı 110 -140 ayarla mV. Çevrimdışı analizleri için veri depolar.

Sonuçlar

ABR saf ton patlamaları (Şekil 1A) kullanarak imzalat fare pups postnatal gün 7 büyük (P7) elde edildi. Şekil 1B, sadece üç-dört ayrı dalgalar küçük genlik ile gösterdi fare pups elde edilen ABR dalga biçimleri gösterildiği gibi. Genellikle, en fazla yedi tepeler Yetişkin hayvanlar (Şekil 1B) ABR dalga biçimleri gözlendi.

Tartışmalar

Rat 11 gün genç, yanıt olarak ses stimülasyon yok Aksiyon potansiyeli işitsel korteks6,7' gözlenen. Bu nedenle, postnatal gün 11 "işitme başlangıçlı"10tanımlanır. İşitme başlangıçlı henüz de incelenmiştir değil önce işitme fonksiyonu geliştirilmesi. Benzer yöntem yetişkin ABR kaydı için kullanarak, biz saf ton veri bloğu fare pups P11 genç dan tarafından ABR'ler elde edildi göstermek (...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser hibe 973 programı (2014CB943002) ve Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (11534013, 31500841) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthetic
Pentobarbital sodiumSigmaP37611.5% in water
NameCompanyCatalog NumberComments
Dissection solution
Leiboviz's L-15 MediumLife Technologies41300-0391 pack in 1 L water
Collagenase IVSigmaC51382 mg/mL in L-15
HEPESSigma7365-45-910 mM
NameCompanyCatalog NumberComments
Immunostaining solutions
PBSThermo Fisher Scientific10010023PH 7.3
ParaformaldehydeSigma1581274% in PBS
Triton X-100AmrescoZS-06940.3% in PBS
Normal goat serumThermo Fisher Scientific10000C10% in PBS
prestin antibodySanta CruzSC-22694dil 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated antibodyThermo Fisher ScientificA-11055dil 1:600
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanateSigmaP1951dil 1:200
DAPISolarbioC0060dil 1:20
NameCompanyCatalog NumberComments
Extracellular solution
Leiboviz's L-15 MediumLife Technologies41300-0391 pack in 1 L water
HEPESSigma7365-45-910 mM
NameCompanyCatalog NumberComments
Intracellular solution
CsClSigma7647-17-8140 mM
MgCl2Sigma7791-18-62 mM
EGTASigma67-42-510 mM
HEPESSigma7365-45-910 mM
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
OsmometerGonotecOSMOMAT 3000 basic
ForcepWPI14095Tweezers dumont
Micropipette pullerSutter InstrumentMODLE-P97
Micro ForgeNarishigenMF-830
Mini Operating SystemSutter InstrumentMP-285
MultiClampAxon700B
Low-Noise Data Acquisition SystemAxon1440A
ES1 speakerTucker-Davis Technologies
TDT system 3Tucker-Davis Technologies
NameCompanyCatalog NumberComments
Software
SigGenRP softwareTucker-Davis Technologies
BioSigRP softwareTucker-Davis Technologies
jClampScientific Solutions
NameCompanyCatalog NumberComments
Animal
SD ratExperimental Animal Center of Southern Medical University

Referanslar

  1. He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. a. n. t. o. s. -., J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
  2. Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).
  3. Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405, 149-155 (2000).
  4. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  5. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).
  6. Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex. Nat Neurosci. 4, 1123 (2001).
  7. De, V. -. S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat. J Neurosci. 27, 180-189 (2007).
  8. He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells. Hearing Res. 78, 77-90 (1994).
  9. Hang, J., et al. Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats. Neural Plast. , 4545826 (2016).
  10. Ehret, G. Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus). J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).
  11. Møller, A. R. . Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , (2006).
  12. He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. Isolation of cochlear inner hair cells. Hearing Res. 145, 156-160 (2000).
  13. Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor. J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).
  14. Fu, M., et al. The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells. Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N rolojiksorunu 135i itsel Beyin Sap Davran m Odyometrisiorgan ve Cortid sa h crepostnatal s ant m h creli yama kelep edo rusal olmayan kapasite

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır