Risposta uditiva del tronco cerebrale ed esterna della cellula ciliata cellule intere Patch Clamp registrazione in ratti postnatali

Riepilogo

Questo protocollo descrive i metodi per registrare la risposta uditiva del tronco cerebrale da cuccioli del ratto postnatale. Per esaminare lo sviluppo funzionale di cellule ciliate esterne, la procedura sperimentale del morsetto della intero-cellula patch registrazione in cellule ciliate esterne isolate è descritta passo dopo passo.

Abstract

L'esterno della cellula ciliata è uno dei due tipi di cellule ciliate sensoriali nella coclea dei mammiferi. Essi alterano la loro lunghezza di cella con il recettore potenziale per amplificare la vibrazione debole del segnale a basso livello sonoro. La morfologia e la proprietà elettrofisiologiche delle cellule ciliate esterne (OHCs) si sviluppano in età postnatale precoce. La maturazione della cellula ciliata esterna può contribuire allo sviluppo del sistema uditivo. Tuttavia, il processo di sviluppo di OHCs non è ben studiato. Questo è in parte a causa della difficoltà per misurare la loro funzione da un approccio elettrofisiologico. Con lo scopo di sviluppare un metodo semplice per risolvere il problema di cui sopra, qui descriviamo un protocollo dettagliato per studiare la funzione di OHCs nella coclea acutamente dissociato da ratti postnatali. Con questo metodo, possiamo valutare la risposta coclea agli stimoli di tono puro ed esaminare il livello di espressione e la funzione della proteina motore prestin nel OHCs. Questo metodo può anche essere utilizzato per studiare le cellule ciliate interne (IHCs).

Introduzione

Due funzioni distinte di cellule ciliate sensoriali cocleari sono essenziali per l'udito dei mammiferi: trasduzione del mechanoelectric (MET) ed electromotility^1,2. Dai canali MET situati nel fascio di capelli, IHCs (IHCs) e OHCs Converti vibrazione sonora in variazioni di potenziale di membrana, come pure i segnali elettrici dei neuroni del ganglio spirale innervate. OHCs cambiano la loro lunghezza di cella con il potenziale di membrana e amplificare la vibrazione del suono di basso livello. Questa attività definita electromotility è derivata dalla proteina motore prestin situato nella parete laterale del OHCs³.

In molte specie, tra cui roditori, la funzione uditiva è immatura in epoca postnatale iniziale^4,5. Nessun potenziale d'azione in risposta ai segnali audio potrebbe essere rilevato nella corteccia uditiva prima della udienza inizio^6,7. Sviluppo della morfologia e funzione della coclea è stata ampiamente studiate in mouse, gerbillo e ratto^4,5,8. La meccanotrasduzione ed electromotility delle cellule ciliate sono anche sviluppati nei primi anni di vita epoca⁵.

Al fine di valutare la sensibilità di udienza dei ratti a diverse età postnatale, abbiamo sviluppato un metodo per la risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR) registrazione nei cuccioli di ratto. Intero-cellula patch clamp è una tecnologia ideale per indagare il OHCs electrophysiologically. Tuttavia, confrontato con il morsetto di patch eseguito in neuroni ed altre cellule epiteliali, il basso tasso di cellule intere tenuta limitata l'inchiesta del electromotility di OHCs isolato.

Qui descriviamo una procedura per studiare il OHCs morfologicamente ed electrophysiologically nella coclea acutamente dissociato da ratti postnatali. Questo metodo può essere modificato per studiare i meccanismi molecolari che regolano la funzione e lo sviluppo della cellula ciliata interna.

Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal comitato di etica animale dell'Università medica del sud.

1. preparare le soluzioni per gli esperimenti

1. Preparare l'anestetico (Vedi Tabella materiali): sodio pentobarbital 1,5% disciolto in ddH₂O.
2. Preparare la soluzione di dissezione (Vedi Tabella materiali): sciogliere un sacchetto di polvere di L-15 di Leiboviz in 1 L di ddH₂O. Adjust pH a 7,3 con 1 M NaOH. Regolare osmolarità di 300-330 mOsm utilizzando un Osmometro e 10 mM HEPES prima dell'uso.
3. Sciogliere 2 mg/mL collagenasi IV (Vedi Tabella materiali) in soluzione di dissezione preparata al punto 1.2.
4. Preparare le soluzioni di immunostaining (Vedi Tabella materiali): sciogliere la paraformaldeide al 4% in tampone fosfato salino (PBS).
   Attenzione: Paraformaldeide è tossico; indossare una protezione appropriata.
5. Diluire l'agente di permeabilità di 0.3% in PBS. Diluire il siero di capra normale del 10% in PBS come il tampone di bloccaggio. Diluire l'anticorpo prestin s 1: 200 in tampone bloccante. Diluire l'anticorpo coniugato Alexa488 1:600 in tampone bloccante. Diluire 1: 200 isotiocianato falloidina-tetrametilrodamina B in PBS.
6. Preparare la soluzione extracellulare (Vedi Tabella materiali): preparare mezzo L-15 di Leiboviz, come descritto in precedenza (punto 1.2).
7. Preparare la soluzione intracellulare (Vedi Tabella materiali).

2. ABR registrazione

Nota: Registrazione ABR precedentemente è stato descritto in dettaglio nel nostro precedente studio⁹.

1. Anestetizzare ratti Sprague Dawley (deviazione standard) (1-14 giorno vecchio cuccioli e adulti 2 - mesi-vecchi, entrambi i sessi) con una singola iniezione del 1,5% sodio pentobarbital (22 mg/kg per cuccioli e 30 mg/kg per gli adulti, intraperitoneali (i.p.)).
2. Metti l'animale anestetizzato in uno stampo di schiuma di polietilene per immobilizzare il corpo dell'animale. Metti l'animale su un tavolo antivibrazione in una camera di attenuazione di suono. Mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37,5 ° C con un rilievo di riscaldamento.
3. Pulire la zona della testa con etanolo al 70% (vol/vol). Utilizzando una forbice, praticare un'incisione di 1-2mm ventrolateral alla pinna esterno per posizionare l'elettrodo di riferimento o la terra. Un elettrodo ad ago ipodermico (elettrodo di registrazione) si trova sopra il vertice del cranio (Figura 1A).
4. Utilizzando il generatore di funzioni, generare raffiche di tono calibrato (altopiano di 3 ms, 1 ms salita/discesa) di varie frequenze (2, 4, 8, 16, 24 e 32 kHz) e intensità (è diminuito da 85 a 10 dB SPL nel passaggio 5 dB). Variare la frequenza e l'ampiezza manualmente o utilizzando un computer. Fornire stimoli sonori attraverso un altoparlante elettrostatico che si trova 10 cm distanza verso la testa dell'animale.
5. Filtro (100-1.000 Hz), amplificare e media (256 volte) il suono hanno suscitato potenziale utilizzando un processore multi-funzione per ottenere l'ABR. Le tracce ABR viene monitorata online e memorizzati per l'analisi offline. Si impiegano circa 40 minuti per completare la registrazione da un animale ABR.
   Nota: Solitamente, il tre-sette cime (onda I ad onda VII) con latenze meno di 15 ms può essere identificato (Figura 1B). La soglia ABR è definita come il livello sonoro minimo al quale onda potremmo essere rilevati I e II.
6. Eutanasia prima degli animali svegli dall'anestesia (con un'iniezione intraperitoneale di 0,3 mL 1,5% sodio pentobarbital).

3. la dissezione dell'organo del Corti (OC)

1. Anestetizzare cuccioli del ratto. Per meno di 6 giorni vecchi ratti (< P6), mantenere l'animale in una piastra di coltura di 100 mm e coprire il recipiente con ghiaccio per 10 min. Per i ratti > P6, anestetizzare l'animale con una singola iniezione del 1,5% sodio pentobarbital (22 mg/kg, i.p.). Decapitare i cuccioli di ratto dopo l'anestesia.
2. Sterilizzare la testa di spruzzatura con etanolo al 70% (vol/vol).
3. Aprire il cranio lungo la linea mediana sagittale con le forbici; rimuovere il cervello per esporre l'orecchio interno.
4. Trasferire l'orecchio interno in una capsula di Petri 35 mm riempito con 3 mL di L-15 ghiacciata (Figura 2A).
5. Sotto il microscopio di dissezione, è necessario utilizzare una pinzetta per rimuovere la capsula ossea della coclea (Figura 2B).
6. Scartare l'OC e associati vascularis dello stria (SV) dal modiolus.
7. Tenendo la porzione basale della SV con il forcipe, separare l'OC da SV completamente tramite rimozione lentamente dalla base all'apice (Figura 2).
8. Tagliare in modo uniforme l'OC in tre pezzi utilizzando forbici bene (Figura 2D).

4. immunofluorescenza

1. Utilizzando una punta di pipetta 200 µ l, trasferire i segmenti di OC (punto 3.8) su un vetrino e difficoltà con 100 µ l di paraformaldeide al 4% per almeno 4 ore a 4 ° C.
   Attenzione: Paraformaldeide è tossico; indossare una protezione appropriata.
2. Lavare il tessuto spostando il paraformaldeide con 100 µ l di PBS fresco. Lavare il tessuto tre volte per 10 min.
3. Incubare il tessuto con agente di permeabilità di 0.3% in PBS per 30 min a temperatura ambiente.
4. Scartare l'agente di permeabilità in PBS e lavare il tessuto tre volte con PBS.
5. Bloccare con 10% siero di capra normale in PBS per 1 h a temperatura ambiente.
6. Incubare con l'anticorpo anti-prestin-C-terminale (1: 200) in blocco soluzione per 2 h a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la notte.
7. Lavare tre volte con PBS per 5 min.
8. Incubare con anticorpi secondari coniugati Alexa488 (1:600) in soluzione bloccante per 1 h a temperatura ambiente al buio.
9. Lavare tre volte con PBS per 5 min al buio.
10. Incubare con rodamina-falloidina (1: 200) per 10 min a temperatura ambiente al buio.
11. Lavare tre volte con PBS per 5 min al buio.
12. Montare su un vetrino con mezzo di montaggio (contenente DAPI). Immagine con microscopia confocale utilizzando 405 nm, 488 nm e 594 nm laser. Impostare la potenza del laser a 0,1-0,5 mW e la scansione velocità a 0,5 fotogrammi/s.

5. Patch clamp registrazione di OHCs isolato

1. Utilizzare la levetta della pipetta e micro-falsario per rendere patch pipette con una punta di diametro 2-3 µm. Back-riempimento le pipette con soluzione intracellulare. Solitamente, la resistenza iniziale della pipetta patch era MΩ 2.5-3.5 nella soluzione del bagno.
2. Utilizzando una pipetta 200 µ l, trasferire un pezzo di the OC (dal punto 3.8) in una capsula di Petri da 35 mm. Digerire il tessuto con 100 µ l di terreno di digestione enzimatica (collagenasi IV, Vedi Tabella materiali) per 5 min a temperatura ambiente.
3. Spostare il mezzo di digestione enzimatica con 100 µ l di L-15. Tagliare il tessuto in piccoli pezzi utilizzando un micro bisturi per isolare le cellule ciliate.
4. Dopo delicato pipettaggio, trasferire le cellule in un piccolo alloggiamento di plastica fatti in casa (diametro ~ 1,5 cm) riempito con soluzione del bagno senza enzima (~ 1,5 mL, Vedi Tabella materiali).
5. Posizionare la camera sul palco di un microscopio invertito. Trovare il OHCs solitario che appaiono sani.
6. Caricare la pipetta patch in fase di testa di un amplificatore di 700B. Muoversi con cautela la pipetta patch di un micromanipolatore e posizionarlo intorno alla parte inferiore della cella capelli esterna (Figura 3A).
7. Morsetto della intero-cellula patch OHC sigillando la parete laterale del corpo cellulare. Applicare l'aspirazione di luce fino a quando la membrana cellulare è rotto. Impostare l'azienda potenziale a -70 mV. Cellule con accesso ha variato da 10 a 17 MΩ e resistenza di membrana hanno variato da 100 a 500 MΩ e sono considerate una corretta configurazione di cellule intere.
8. Utilizzando il computer di controllo, applicare hyperpolarizing e depolarizzazione tensione (durata 250 ms e che vanno da −140 a + 94 mV in 13 passi mV) alla cella di suscitare correnti della intero-cellula.
9. Amplificare le correnti della intero-cellula, (angolo frequenza di 5 kHz) del filtro da un amplificatore di 700B. Convertire i dati da un convertitore 1440A e archivio per l'analisi offline.
10. Misurare la capacità di membrana del OHCs utilizza un protocollo di stimolo di tensione due sinusoidale controllato da un software di patch clamp. Impostare l'intervallo di tensione di stimolare da -140 a 110 mV. Memorizzare i dati per l'analisi offline.

Risultati

ABR può essere suscitata da cuccioli del ratto anestetizzato oltre postnatale giorno 7 anni di età (P7) utilizzando gli scoppi di tono puro (Figura 1A). Come mostrato in Figura 1B, le forme d'onda ABR ottenuti da cuccioli del ratto ha mostrati solo tre o quattro distinte ondate con piccola ampiezza. Di solito, fino a sette cime sono state osservate nelle forme d'onda ABR di animali adulti (Figura 1B

Discussione

In ratti più giovani di giorno 11, nessun potenziale d'azione in risposta a stimolazione sonora potrebbe essere osservato nella corteccia uditiva^6,7. Di conseguenza, postnatale giorno 11 è descritto come "inizio dell'udito"¹⁰. Lo sviluppo della funzione uditiva prima insorgenza di udienza non è stato ben studiato ancora. Utilizzando il metodo simile per la registrazione di ABR adulto, dimostriamo che ABRs potrebbe essere suscitata da sc...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	1.5% in water
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection solution
Leiboviz's L-15 Medium	Life Technologies	41300-039	1 pack in 1 L water
Collagenase IV	Sigma	C5138	2 mg/mL in L-15
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining solutions
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023	PH 7.3
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4% in PBS
Triton X-100	Amresco	ZS-0694	0.3% in PBS
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific	10000C	10% in PBS
prestin antibody	Santa Cruz	SC-22694	dil 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11055	dil 1:600
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma	P1951	dil 1:200
DAPI	Solarbio	C0060	dil 1:20
Name	Company	Catalog Number	Comments
Extracellular solution
Leiboviz's L-15 Medium	Life Technologies	41300-039	1 pack in 1 L water
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Intracellular solution
CsCl	Sigma	7647-17-8	140 mM
MgCl2	Sigma	7791-18-6	2 mM
EGTA	Sigma	67-42-5	10 mM
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Osmometer	Gonotec	OSMOMAT 3000 basic
Forcep	WPI	14095	Tweezers dumont
Micropipette puller	Sutter Instrument	MODLE-P97
Micro Forge	Narishigen	MF-830
Mini Operating System	Sutter Instrument	MP-285
MultiClamp	Axon	700B
Low-Noise Data Acquisition System	Axon	1440A
ES1 speaker	Tucker-Davis Technologies
TDT system 3	Tucker-Davis Technologies
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
SigGenRP software	Tucker-Davis Technologies
BioSigRP software	Tucker-Davis Technologies
jClamp	Scientific Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
SD rat	Experimental Animal Center of Southern Medical University