聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞細胞パッチ ・ クランプ記録

要約

このプロトコルは、生後ラットの聴性脳幹反応を記録する方法を説明します。外有毛細胞の機能の発達を調べると、全細胞パッチク ランプ分離外有毛細胞内記録の実験の手順がステップバイ ステップで説明されています。

要約

外の有毛細胞は哺乳類の蝸牛の感覚毛の細胞の 2 つのタイプの 1 つです。彼らは、低レベルの音声信号の弱い振動を増幅する潜在的な受容体とそのセルの長さを変更します。形態と内耳外有毛細胞の電気生理学的特性は、産後の早い年齢で開発します。外有毛細胞の成熟聴覚システムの開発に貢献するかもしれない。しかし、内耳の開発のプロセスはよく研究されていません。これは電気生理学的アプローチによるそれぞれの機能を測定する難しさの一因です。上記の問題を解決する簡単な方法を開発することを目的としてここで我々 は生後ラット急性解離の蝸牛における内耳の機能を勉強する段階的なプロトコルをについて説明します。この方法では、純音刺激の蝸牛神経の反応を評価し、表現レベルと強大でタンパク質モータプレスチンの機能を調べる。このメソッドは、内部の有毛細胞 (Ihc) を調査にも使用できます。

概要

哺乳類の聴覚の感覚の蝸牛の有毛細胞の 2 つの異なる機能が欠かせない: mechanoelectric 伝達 (MET) と electromotility^1,2。MET チャネル髪束、Ihc (Ihc), 変換音振動膜電位変化と神経らせん神経節細胞の電気信号であります。内耳膜電位とそのセルの長さを変更し、低音の振動を増幅します。Electromotility と呼ばれるこの活動は,³の外側の壁にあるタンパク質モータプレスチンによって派生します。

齧歯動物を含む多くの種で、公聴会の関数は初期産後エポック^4,5に未熟です。聴覚発症^6、7の前に聴覚野における音声信号への応答で活動電位が検出されません。形態の開発と蝸牛の機能はラット^4,5,8スナネズミ、マウスで広く研究されています。メカノトランスダクションと有毛細胞の electromotility の初期の開発もエポック社の生活の⁵。

生後隔世でラットの聴覚感度を評価するためにラット記録脳幹反応 (ABR) の手法を提案します。全細胞パッチク ランプは、生理、内耳を調査する理想的な技術です。ただし、ニューロンと他の上皮細胞で実行パッチ クランプと比べると、全体携帯シールの低率は分離強大の electromotility の調査を制限しました。

ここで我々 は生後ラット急性解離の蝸牛の形態と生理、内耳を調査する手順をについて説明します。このメソッドは、内部の有毛細胞の開発と機能を制御する分子機構を研究する変更できます。

プロトコル

動物を対象とする実験のすべてのプロトコルは、南方医科大学の動物倫理委員会によって承認されました。

1 実験用のソリューションを準備します。

1. 麻酔の準備 (材料の表を参照してください): 1.5% ペントバルビ タール ナトリウム溶解 ddH₂o.
2. 郭清のソリューションを準備 (材料の表を参照してください): Leiboviz の L-15 パウダー 1 M NaOH で ddH₂O. 調整 pH 7.3 の 1 L に 1 袋を溶かします。Osmometer および使用する前に 10 mM HEPES を使用して 300 330 mOsm に浸透圧を調整します。
3. 2 mg/mL コラゲナーゼ IV を解散 (材料表参照) ステップ 1.2 で郭清溶液で。
4. (材料の表を参照してください) 染色ソリューションを準備: リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 4% パラホルムアルデヒドを解散。
   注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します。
5. PBS で 0.3% 透水剤を希釈します。ブロック バッファーとして PBS で 10% ヤギ血清を希釈します。ブロック バッファーのプレスチン抗体 1: 200 を希釈します。ブロック バッファーで抗体の Alexa488 共役 1:600 を希釈します。PBS でファロイジン Tetramethylrhodamine B イソチオ シアン酸 1: 200 を希釈します。
6. 細胞外の溶液を準備 (材料の表を参照してください): (ステップ 1.2) 上記のように Leiboviz の L-15 媒体を準備します。
7. 細胞内の溶液を調製 (材料の表を参照してください)。

2. ABR 記録

注: ABR 記録は、以前私たちの以前の研究⁹で詳細に記載されています。

1. ペントバルビ タール ナトリウム 1.5% (22 mg/kg の子犬および大人、腹腔内の 30 mg/kg、(i. p.)) の単一の注入と SD) ラット (1 14 日古い子犬、生後 2 ヶ月の大人、男女ともに) を麻酔します。
2. 動物の体を動けなくポリエチレン発泡金型に麻酔下の動物を配置します。音減衰部屋の防振テーブルに動物を配置します。37.5 ° C 加熱パッドで動物の体の温度を保ちます。
3. (巻/巻) 70% エタノールでヘッドの領域を拭いてください。良いはさみを使用して、参照電極または地上に配置する外部の耳介に腹の 1-2 mm の切開を加えます。頭蓋骨の頂点 (図 1 a) 皮下針電極 (電極記録) があります。
4. 関数発生器を使用して様々 な周波数のキャリブレーション トーン バースト (1 ms 立上り/立下り、3 ms 高原) を生成する (2、4、8、16、24、および 32 kHz) と強度 (85 から 5 dB ステップで 10 dB SPL に減少した)。周波数と振幅を手動で変更またはコンピューターを使用しています。動物の頭に向かって離れて 10 cm に位置する静電スピーカーから音刺激を提供します。
5. (100-1,000 Hz) をフィルター、増幅し、平均 (256 回) サウンド誘発可能性多機能プロセッサを使用して、Abr を取得します。ABR のトレースには、オンラインとオフラインで分析できるストアドが監視されます。1 つの動物から記録 ABR を完了する約 40 分かかります。
   注: (波私波 VII) 通常、3 ~ 7 ピーク遅延時間が 15 ms にすることができます未満は (図 1 b) を識別します。ABR 閾値は、I と II が波を検出できる最小の音圧レベルとして定義されます。
6. 動物 (0.3 mL 1.5% ナトリウム, ペントバルビ タールの腹腔内投与) と麻酔から覚める前に安楽死させます。

3. コルチ器官 (OC) 郭清

1. ラットを麻酔します。ラット未満 6 日古いの (< P6)、100 mm の培養皿で動物を維持し、10 分間氷で包みます。ラット用 > P6、1.5% ナトリウム ペントバルビ タール (22 mg/kg, i. p.) の単回投与で動物を麻酔します。麻酔後ラット仔の首をはねます。
2. 頭を 70% (巻/巻) エタノールを噴霧して消毒します。
3. ハサミの矢状面の正中線に沿って頭蓋骨を開く脳、内耳を公開するを削除します。
4. 3 ml 冷たい L-15 (図 2 a) の 35 mm のペトリ皿に内耳を転送します。
5. 解剖顕微鏡の下で微細鉗子を使用して (図 2 b) 蝸牛の硬骨を削除します。
6. OC の包みを開けるし、蝸牛軸から耳用 (SV) を関連付けられています。
7. 押し鉗子、SV の基底部 OC SV から完全に分離ベース-apex (図 2) からゆっくりとアンワインドしています。
8. 高級はさみ (図 2 D) を使って OC を 3 個に均等に切る。

4. 蛍光抗体染色

1. 200 μ L ピペット チップを使用して、スライド ガラス上に OC (ステップ 3.8) のセグメントに転送、4 ° C で、少なくとも 4 時間のための 4% のパラホルムアルデヒドの 100 μ L で固定
   注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します。
2. 新鮮な pbs 100 μ L でパラホルムアルデヒドを置き換えたり、組織を洗います。10 分間 3 回ティッシュを洗います。
3. 室温で 30 分間 PBS で 0.3% 透過性エージェントと組織を孵化させなさい。
4. PBS で透磁率エージェントを破棄し、PBS に組織を 3 回洗います。
5. 室温で 1 時間 PBS で 10% ヤギ血清をブロックします。
6. 一晩 2 時間室温でまたは 4 ° C で解決を妨げる抗プレスチン C 末端抗体 (レバレッジ) で孵化させなさい。
7. 3 回を PBS で 5 分間洗浄します。
8. 暗闇の中で室温で 1 時間ブロッキング液で Alexa488 共役二次抗体 (1:600) を孵化させなさい。
9. 3 回を PBS で暗闇の中で 5 分間洗浄します。
10. ローダミン ファロイジン (レバレッジ) と暗闇の中で室温で 10 分間インキュベートします。
11. 3 回を PBS で暗闇の中で 5 分間洗浄します。
12. スライド ガラス (DAPI を含む) メディアをマウントをマウントします。405 を使用して共焦点顕微鏡画像 nm、488 nm、および 594 nm のレーザー。レーザー電力設定 0.1 0.5 mW とスキャンは 0.5 フレーム/秒で高速化します。

5. パッチク ランプ記録の分離

1. ピペットの引き手を使用し、パッチを作るに偽造者のマイクロ ピペット先端径 2-3 μ m. 埋戻し細胞内ソリューションとピペット。通常、パッチ ピペットの最初の抵抗は、バス ソリューションの 2.5 から 3.5 の MΩ だった。
2. 200 μ L ピペット チップを使用して、35 mm のペトリ皿に (ステップ 3.8) から OC の一部を転送します。100 μ L の酵素消化中で組織を消化 (コラゲナーゼ IV、参照テーブルの材料) 室温で 5 分間。
3. L-15 の 100 μ L の酵素消化中を転置します。組織を有毛細胞を分離するマイクロ メスを使用する小さな断片にカットします。
4. 穏やかなピペッティング後自家製小型プラスチック製チャンバーにセルを転送 (直径 〜 1.5 cm) 無料の酵素入浴液でいっぱい (〜 1.5 mL材料表を参照してください)。
5. 倒立顕微鏡のステージでチャンバーを配置します。健康表示の孤独な内耳を見つけます。
6. 700 b アンプのヘッド ステージにパッチ ピペットをロードします。マイクロマニピュレーターによってパッチ ピペットを慎重に移動し、外有毛細胞 (図 3 a) の下部に位置します。
7. 細胞は、細胞体の側壁をシールで、OHC をクランプします。細胞膜が破裂するまで光の吸引を適用します。-70 で潜在的な開催を設定 mV。10 〜 17 MΩ 抵抗と膜抵抗セルは 100 〜 500 MΩ、成功した全体セル構成と見なされます。
8. コンピューター制御を使用して過分極・脱分極電圧を適用 (250 ms 期間と +94 −140 に至る 13 mV 刻みで mV) 全細胞の流れを引き出すためにセルに。
9. 全細胞の流れを増幅、700 b アンプで (角周波数 5 kHz) をフィルターします。1440A コンバーターとオフライン解析のための店でデータを変換します。
10. パッチ クランプ ソフトウェアによって制御される 2 つの正弦波電圧刺激プロトコルを使用して内耳の膜の静電容量を測定します。-140 から刺激する電圧範囲を 110 に設定 mV。オフライン分析用のデータを格納します。

結果

ABR は、麻酔したラットの子犬生後 7 日目より古い (P7) (図 1 a) 純粋なトーン バーストを使用してから誘発されることができます。図 1 bのように、仔と小振幅だけ 3 〜 4 明瞭な波を示したから ABR 波形が得られます。通常は、7 つのピークまで大人動物 (図 1 b) ABR 波形の観察されました。

ディスカッション

11 日目より若いラット、聴覚野^6,7で音刺激電位が観察できません。したがって、生後 11 日目は、「聴覚発症"¹⁰として記述されます。聴覚の発症がよくまだ研究されていない前に聴覚機能の開発。大人の ABR 記録のため同様のメソッドを使用して、Abr が仔 P11 より若いから純粋なトーン バーストによって誘発されることを示す (

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	1.5% in water
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection solution
Leiboviz's L-15 Medium	Life Technologies	41300-039	1 pack in 1 L water
Collagenase IV	Sigma	C5138	2 mg/mL in L-15
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining solutions
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023	PH 7.3
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4% in PBS
Triton X-100	Amresco	ZS-0694	0.3% in PBS
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific	10000C	10% in PBS
prestin antibody	Santa Cruz	SC-22694	dil 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11055	dil 1:600
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma	P1951	dil 1:200
DAPI	Solarbio	C0060	dil 1:20
Name	Company	Catalog Number	Comments
Extracellular solution
Leiboviz's L-15 Medium	Life Technologies	41300-039	1 pack in 1 L water
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Intracellular solution
CsCl	Sigma	7647-17-8	140 mM
MgCl2	Sigma	7791-18-6	2 mM
EGTA	Sigma	67-42-5	10 mM
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Osmometer	Gonotec	OSMOMAT 3000 basic
Forcep	WPI	14095	Tweezers dumont
Micropipette puller	Sutter Instrument	MODLE-P97
Micro Forge	Narishigen	MF-830
Mini Operating System	Sutter Instrument	MP-285
MultiClamp	Axon	700B
Low-Noise Data Acquisition System	Axon	1440A
ES1 speaker	Tucker-Davis Technologies
TDT system 3	Tucker-Davis Technologies
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
SigGenRP software	Tucker-Davis Technologies
BioSigRP software	Tucker-Davis Technologies
jClamp	Scientific Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
SD rat	Experimental Animal Center of Southern Medical University