في فيفو تقييم التنمية دشبذ الكسر أثناء التئام العظام في الفئران باستخدام جهاز الصدمة المتوافقة مع التصوير بالرنين المغناطيسي لعظم الفخذ الماوس

Summary

تقييم التنمية الأنسجة في دشبذ الكسر أثناء التئام العظام endochondral ضروري لرصد عملية الشفاء. وهنا، نحن تقرير استخدام الرنين المغناطيسي التصوير (التصوير بالرنين المغناطيسي)-التبعي الخارجية متوافقة لعظم الفخذ الماوس للسماح للتصوير بالرنين المغناطيسي بالأشعة أثناء تجديد العظام في الفئران.

Abstract

اندوتشوندرال شفاء الكسر عملية معقدة تنطوي على تطوير أنسجة ليفية وعنقيه العظمى في دشبذ الكسر. كمية الأنسجة المختلفة في دشبذ يوفر معلومات هامة في كسر الشفاء التقدم. وتشمل التقنيات المتوفرة في فيفو طوليا رصد التنمية دشبذ في الأنسجة في الدراسات الإكلينيكية شفاء الكسر باستخدام الحيوانات الصغيرة التصوير الشعاعي الرقمي والتصوير µCT. ومع ذلك، كلا التقنيات فقط قادرة على التمييز بين الأنسجة التعدينية والمعادن. ونتيجة لذلك، من المستحيل أن تميز الغضروف من أنسجة ليفية. وفي المقابل، التصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي) يتصور الهياكل التشريحية استناداً إلى المحتوى الخاص بهم المياه ولذلك قد تكون قادرة على تحديد نونينفاسيفيلي الأنسجة اللينة والغضاريف في دشبذ الكسر. هنا، نحن تقرير استخدام التبعي الخارجية المتوافقة مع التصوير بالرنين المغناطيسي لعظم الفخذ الماوس للسماح بفحص التصوير بالرنين المغناطيسي أثناء تجديد العظام في الفئران. أثبتت التجارب أن التبعي وجهاز تركيب مصنوعة خصيصا تسمح الرنين المتكرر، مما مكن التحليل الطولي للتنمية دشبذ كسر الأنسجة.

Introduction

شفاء الكسر الثانوي هو الشكل الأكثر شيوعاً لشفاء العظام. أنها عملية معقدة محاكاة جوانب محددة من endochondral التحور التحجر^1،،من²³. ورم دموي كسر أوائل غالباً يتكون من الخلايا المناعية، وتحبيب وأنسجة ليفية. التوتر المنخفض الأكسجين وسلالات عالية النشاط الحيوي تعوق osteoblast التمايز في كسر الفجوة، ولكن تعزيز التفريق بين الخلايا السلف في تشوندروسيتيس^4،،من⁵⁶. تبدأ هذه الخلايا تنتشر في موقع الإصابة شكل مصفوفة عنقية توفير الاستقرار الأولية لكسور العظام. أثناء نضج دشبذ، chondrocytes الضخامي، يصبح الخضوع للمبرمج، أو عبر-التفريق في خلايا الاوستيوبلاستس. نيوفاسكولاريزيشن في منطقة انتقالية الغضاريف للعظام يوفر مستويات مرتفعة من الأكسجين، السماح بتكوين نسيج عظمى⁷. بعد عظمى سد الفجوة الكسر، هو زيادة استقرار النشاط الحيوي ويعيد البناء أوستيوكلاستيك من دشبذ كسر خارجي يحدث للحصول على العظام الفسيولوجية الكنتورية وهيكل³. ولذلك، توفر كميات الأنسجة الليفية وعنقيه عظمى في دشبذ الكسر معلومات هامة حول عملية شفاء العظام. اضطراب أو تأخر الشفاء تصبح مرئية بالتعديلات دشبذ الأنسجة التنمية سواء في البشر والفئران^8،9،،من¹⁰¹¹. وتشمل التقنيات المتوفرة في فيفو طوليا رصد التنمية دشبذ الأنسجة في الكسر السريري شفاء دراسات استخدام الحيوانات الصغيرة التصوير الشعاعي الرقمي والتصوير^،من¹²¹³µCT. ومع ذلك، كلا التقنيات فقط قادرة على التمييز بين الأنسجة التعدينية والمعادن. في المقابل، التصوير بالرنين المغناطيسي يوفر تباين الأنسجة اللينة ممتازة ولذلك قد تكون قادرة على تحديد الأنسجة اللينة والغضاريف في دشبذ الكسر.

الأعمال السابقة أظهرت نتائج واعدة التشريح التصوير بالرنين المغناطيسي في الفئران مع كسور مفصلي¹⁴ و في فيفو التصوير بالرنين المغناطيسي في الفئران خلال intramembranous العظام-عيب الشفاء¹⁵. ومع ذلك، ذكر كلتا الدراستين أيضا محدودة المكانية القرار والأنسجة على النقيض. سبق أثبتنا جدوى عالية الدقة في فيفو التصوير بالرنين المغناطيسي لتقييم طولية لتشكيل دشبذ لينة خلال كسر endochondral مورين شفاء¹⁶. هنا، نحن تقرير البروتوكول المتعلق باستخدام التبعي خارجية متوافقة مع التصوير بالرنين المغناطيسي لعظم الفخذ العظم في الفئران بغية رصد التنمية دشبذ النسيج طوليا خلال كسر endochondral عملية الشفاء. تصميم جهاز تركيب مصنوعة خصيصا للإدراج التبعي الخارجية ضمان موقف موحد أثناء المسح المتكررة.

Protocol

جميع الحيوانات التجارب الامتثال للأنظمة الدولية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، ووافقت عليها السلطات التنظيمية الإقليمية (رقم 1250، Regierungspräsidium توبنغن، ألمانيا). أبقى جميع الفئران في مجموعات من اثنين إلى خمسة الحيوانات في قفص على ضوء ح 14، 10-ح إيقاع circadian الظلام مع الماء والغذاء المقدمة الإعلانية libitum.

1-إعداد المواد الجراحية والمعالجة المسبقة للفئران

1. تعقيم جراحي جميع المواد. استخدام درجة حرارة التعقيم 120-135 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة من وقت التعقيم.
الفئران
2. الشراء C57BL/6 أو الفئران من سلالة أخرى ما بين 19-35 غرام وزن الجسم. متابعة الرعاية الحيوانية المناسبة والبروتوكولات التجريبية وفقا لمبادئ توجيهية وطنية يوافق عليه المحقق ' s "المؤسسية رعاية الحيوانات" و "استخدام اللجنة". السماح بالحد ني فترة تأقلم 7 أيام قبل بدء الإجراء.
3. يقدم التسكين لجميع الفئران عن طريق مياه الشرب يوم واحد قبل الجراحة حتى اليوم الثالث بعد العملية الجراحية.

2. الإجراءات الجراحية وتطبيق "التبعي الخارجية"

1. مكان الماوس في أنبوب مسبقة مع الأكسجين إيسوفلوراني و 60 مل/دقيقة 5-7%. بعد فقدان ردود الفعل الوضعي، إزالة الماوس من الأنبوب تحريض التخدير والحفاظ على التخدير عن طريق قناع استنشاق توفير الأوكسجين isoflurane ومل 60 بالدقيقة 1-3%. نمط
   1. جهاز التنفس وهند مخلب منعكس أثناء التخدير. التأكد من أن معدل التنفس حوالي 100 دورة/دقيقة والمعاكسة مخلب هند غائب.
      ​ ملاحظة: كمية الغاز اللازمة يتوقف على السن والجنس، ووزن الجسم والسلالة من الماوس-
2. قبل جراحة، حقن الماوس مع جرعة واحدة من المضادات الحيوية تحت الجلد (الكليندامايسين، 45 مغ/كغ). وعلاوة على ذلك، للحفاظ على توازن السوائل الفيزيولوجية، حقن الماوس مع مستودع السائل تحت الجلد من 500 ميليلتر المالحة (0.9% كلوريد الصوديوم)-
3. لمنع القرنية التجفيف، تطبيق مرهم العين لعيون الماوس. ضع الماوس على لوحة تدفئة في 37 درجة مئوية أثناء التخدير وإجراء العمليات الجراحية للمحافظة على فسيولوجية الجسم درجة الحرارة-
إزالة الفراء من أطرافهم هند حق
4. وفرك المنطقة الجراحية بمطهر المستندة إلى الكحول. تغطية مخلب حق هند مع جزء صغير من القفازات المعقمة لتجنب المناطق غير معقمة. تطهير أطرافهم هند الحق ثلاث مرات. ضع ثني عقيمة على الماوس كله باستثناء منطقة الجراحية.
5. جداً الجلد ما يقرب من 1 سم طوليا على طول الجانب الأمامي من عظم الفخذ الأيسر مع مشرط. فصل صراحة م-العضلة ذات الرأسين الفخذية و lateralis فستوس m. مع مايكرو مقص وملقط. قطع الجانب المنشأ وتر في trochanter عظم الفخذ مع مقص الجزئي السماح بحرية الوصول إلى الجزء أنتيرولاتيرال من العظام. تأكد من أن يتم الاحتفاظ بالعصب الوركي.
6. موقف التبعي الخارجية (صلابة محوري 3 ن/مم، الرقم 1 ألف) موازية لعظم الفخذ. يدوياً حفر الآبار عن طريق اللحاء مع قليلاً حفر 0.45 ملم والسيراميك تركيب دبابيس في الآبار. تبدأ مع دبوس الأكثر الدانية، متبوعاً بدبوس الأكثر القاصي، ودبابيس اثنين بينهما.
   1. تأكد من أن هناك لا توتر أو ضغط أو إجهاد القص على التبعي أثناء عملية التركيب، خلاف ذلك الفجوة العظم يتحقق لن يكون كافياً نظراً لتخفيف التبعي.
7. يرطب العظام مع كمية صغيرة من كلوريد الصوديوم العقيمة لتجنب الجفاف أثناء الإجراء سونج-
8. إنشاء العظم 0.4 مم عن طريق العظم كله بين اثنين دبابيس الداخلية باستخدام منشار سلك الزنابق 0.4 مم-
   ملاحظة: بشكل اختياري، منشار الصغير تتأرجح استخدامها لإنشاء في العظم. تأكد لتجنب أي رقائق معدنية من شاهد في منطقة العظم.
9. استواء الفجوة العظم بعناية مع 2 مل من كلوريد الصوديوم المعقم لإزالة رقائق العظام بين كورتيسيس كسر اثنين.
10. تكييف العضلات باستخدام خياطة مستمرة مع خياطة ريسوربابل (انظر الجدول للمواد). ثم تكييف الجلد باستخدام خيوط غير ريسوربابل المنقطعة (انظر الجدول للمواد). تجنب عض الجرح، لا تضع في الخياطة في الجزء الجمجمة من الجرح.
    ملاحظة: لا تستخدم غراء الجلد أو مقاطع منذ الفئران عادة إزالته من التسبب في جرح كذلك الضرر الذي يلحق بالبشرة.
11. تنظيف المنطقة الجراحية بمطهر ثم ضع الماوس إلى في القفص. رصد الماوس والحرارة إمدادات كافية (مثلاً بالأشعة تحت الحمراء) حتى يكون مستيقظا تماما. رصد المياه وتناول الطعام، ووزن الجسم بعد الجراحة إلى تأكد من أن الحيوان ليس في الألم والحزن. تقديم التسكين لجميع الفئران عن طريق مياه الشرب حتى اليوم الثالث بعد العملية الجراحية.
    ملاحظة: يجوز إيواء الفئران في مجموعات من الحيوانات يصل إلى أربعة-
12. رصد الماوس ' s النشاط في الأيام 1 إلى 5 بعد الجراحة. أثناء هذا الوقت، يجب أن تتحمل الماوس الوزن على أطرافهم تعمل. وبخلاف ذلك، يجب استبعاد الماوس من مزيد من التحليل.

3. إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي وتحليل الصور

1. مسبق للتصوير بالرنين المغناطيسي مسح الداخلي، تخدير الماوس وفقا للبروتوكول في الخطوات 2، 1 و 2-3، والإبقاء على معدل التنفس حوالي 100 إدراج دورات/دقيقة التبعي الخارجية في أطرافهم هند الحق الماوس بعناية في جهاز تركيب مصنوعة خصيصا ( الشكل 1 ب، ج).
   1. تأكد من تجنب الانحناء أو ضغط التبعي أثناء هذه الخطوة منذ ذلك قد تتداخل مع شفاء الكسر.
      ملاحظة: يمكن إجراء فحص التصوير بالرنين المغناطيسي لها في أقرب وقت 3 أيام بعد الجراحة، واعتماداً على رعاية الحيوان وبروتوكول تجريبي.
2. ضع الماوس على مهد مقطورات لعرضه على جهاز التصوير بالرنين المغناطيسي. قم بتوصيل الجهاز تصاعد التشدد بلفائف الرأس أربعة-العنصر.
3. البيانات "الحصول على التصوير بالرنين المغناطيسي" باستخدام نظام التصوير بالرنين المغناطيسي الحيوانات صغيرة عالية-حقل مخصص العاملة على 11.7. ت.
   ​ ملاحظة: الهندسة اقتناء بيانات "التصوير بالرنين المغناطيسي" محاذاة مع عظم الفخذ، أورثوجونالي بالمسامير.
   1. الحصول على البيانات عن طريق تطبيق كثافة بروتون قمعت الدهون شريحة متعددة تسي تسلسل (PD-تسي) باستخدام معلمات اقتناء: صدى/التكرار الوقت TE = 5.8 مللي/TR = 2,500 مرض التصلب العصبي المتعدد، Δr القرار = 52 × 52 × 350 µm³، حقل من عرض (FOV) = 20 × 20 ملم ²، وعرض النطاق الترددي Δω = 150 كيلو هرتز-
   2. ملاحظة: لقد حان وقت الحصول على مجموع الشرائح 22 دقيقة 36
4. فتح البيانات المكتسبة مع برمجيات تحليل الصورة. قم بإدخال الحجم فوكسل ك 0.05 × 0.05 × 0.35 مم ³. الجزء أنسجة مختلفة في كسر دشبذ (العظام، الغضاريف، والأنسجة الليفية/النخاع العظمى) استناداً إلى قوتها مع مستوى العتبة شبه التلقائي كما يلي.
   1. انقر " "تحرير حقل التسمية الجديدة" "، انقر فوق " "إضافة المواد" "، وتسمية المواد إلى " callus ". يميز منطقة دشبذ من الأنسجة المحيطة بها استناداً إلى إشارة هيبو مكثفة من السمحاق باستخدام " ﻻسو " أداة.
   2. انقر فوق " إضافة إلى المواد ". انقر فوق " "إضافة مادة" "، وإعادة تسمية المواد التي " الغضروف ". الجزء الغضروف باستخدام " عتبة " أداة و " حدد المواد الحالية فقط " من " كلوس ". انقر فوق " غضروف " و " إضافة إلى المواد ". كرر هذه الخطوات مع " العظام " و " النسيج الليفي/نخاع العظم ".
5. توليد عمليات إعادة البناء ثلاثي الأبعاد لقصبة مكسور استناداً إلى البيانات تجزئة النسيج باستخدام برمجيات تحليل الصورة. انقر فوق " "سطح توليد" "، تطبيق " بلا " ل " "نوع تجانس" " انقر فوق " "عرض سطح" ".
   ملاحظة: مناطق صغيرة جداً، وفرط مكثفة المحيطة أونس كورتيسيس مكسور يرجح أن القطع الأثرية بسبب الانتقال من عظمى إلى الأنسجة اللينة. هذه المجالات ينبغي أن تستبعد من مزيد من التحليل. مناطق الإفراط الشديد في منتصف الكسر كالوس خلال المرحلة اندوتشوندرال من كسر شفاء الأنسجة عنقية تمثل. المناطق هيبو مكثفة في كسر دشبذ القاصي من الفجوة العظم في مرحلة التحجر endochondral والمناطق بنفس الكثافة في جميع أنحاء دشبذ الكسر كله في الشفاء بعد مراحل تمثل الأنسجة دشبذ عظمى المنشأ حديثا. على الرغم من أن هذه المناطق قد إشارة هيبو مكثفة، حتى أدنى بكثافة إشارة من العظام ناضجة (اللحاء). بعد العتبة كثافة إشارة للأنسجة العظمية والأنسجة عنقية في دشبذ الكسر، مارك الأنسجة المتبقية نخاع العظام وأنسجة ليفية. قيم تجزئة الأنسجة: الأنسجة العظمية (بما في ذلك القشرة الناضجة وترابيكولار العظام والأنسجة العظمية دشبذ) مجزأة ضمن النطاق من 1-3-3 (كثافة إشارة طبيعية للقشرة الناضجة)، النسيج الليفي/نخاع العظام داخل نطاق 3، 4-5-4، و دشبذ عنقية الأنسجة داخل نطاق 5.5-6-2-
6. إذا لزم الأمر، كرر التصوير بالرنين المغناطيسي طوليا خلال كسر عملية الشفاء. لرصد التنمية دشبذ عنقية، تفحص الفئران في أيام 10 و 14، و 21 بعد الجراحة-
   ملاحظة: النقاط الزمنية التي قد تعتمد على رعاية الحيوان وبروتوكول تجريبي.

النتائج

أولاً، يمكن تأكيد نجاح العملية الجراحية بتحليل لفحص التصوير بالرنين المغناطيسي (انظر المثال في الشكل 2). ينبغي أن تكون جميع المسامير الأربعة تقع في منتصف الفخذ رمح. وينبغي أن يكون حجم الفجوة العظم بين 0.3 0.5 مم. إذا كان حجم الفجوة العظم يختلف إلى حد كبير من هذ...

Discussion

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها:

وكان الهدف الرئيسي لهذه الدراسة لوصف بروتوكول لاستخدام للتبعي الخارجية المتوافقة مع التصوير بالرنين المغناطيسي للعظم عظم الفخذ في الماوس مع القدرة على رصد التنمية دشبذ النسيج طوليا خلال عملية التئام الكسر endochondral. تصميم جهاز ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaesthesia tube	FMI, Seeheim, Germany	ZUA-82-ANA-TUB-Mouse
Anaesthetic machine	FMI, Seeheim, Germany	ZUA-82-GME-MA
Artery forceps	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BH104R
Autoclave	Systec, Wettenberg, Germany	DX-150
Autoclaving packaging	Stericlin, Feuchtwangen, Germany	2301-04/06/10/12/16
Avizo software	FEI, Burlington, USA	-	Version 8.0.1
BioSpec 117/16 magnetic resonance imaging system	Bruker Biospin, Ettlingen, Germany	117/16
Bulldog clamp	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BH 021R
Carbon steel scalpel no. 11/15	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BA211/215
Ceramic mounting pin 0.45 mm	RISystem, Davos, Switzerland	HS691490
Clindamycin (300 mg / 2ml)	Ratiopharm, Ulm, Germany	-
Dressing forceps 115 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BD210R
Dressing forceps 130 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BD025R
Drill bit coated 0.45 mm	RISystem, Davos, Switzerland	HS820420
Durogrip needle holder 125 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BM024R
Foliodrape	Hartmann, Heidenheim, Germany	2513026
Frekaderm	Fresenius, Bad Homburg, Germany	4928211
Gigli saw 0.44 mm	RISystem, Davos, Switzerland	RIS.590.110.25
Hand drill	RISystem, Davos, Switzerland	RIS.390.130-01
Heating plate	FMI, Seeheim, Germany	IOW-3704
Hygonorm gloves	Hygi, Telgte, Germany	2706
Isoflurane	Abbot, London, UK	Forene
Micro forceps 155 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BD343R
Micro scissors 120 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	FD013R
Mouse FixEx L 0.7 mm	RISystem, Davos, Switzerland	RIS.611.300-10
Needle case for drills	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BL911R
Needle holder	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BB078R
Octenisept	Schülke, Norderstedt, Germany	121403
Osirix software	Pixmeo SARL, Bernex, Switzerland	-	Version 4.0
Oxygen, medical grade	MTI, Ulm, Germany	-
Resolon 5/0	Resorba, Nürnberg, Germany	88143
Saline 0.9%	Braun, Melsungen, Germany	3570350
Scalpel handle 125 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BB073R
Scissors 150 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BC006R
Sealer for autoclave packaging	Hawo GmbH, Obrigheim, Germany	HM500
Sterican 27 G	Braun, Melsungen, Germany	4657705
Sterile surgical blades no. 11/15	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BB511/515
Surgical gloves	Hartmann, Heidenheim, Germany	Peha-micron 9425712
Surgical light	Maquet SA, Ardon, France	Blue line 80
Syringes 5 ml	Braun, Melsungen, Germany	Injekt 4606051V
Tissue forceps 80 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	OC091R
Tramadol 25 mg/l	Grünenthal, Aachen, Germany	100mg/ml
Vasofix Safety	Braun, Melsungen, Germany	4268113S-01
Vicryl 5-0	Ethicon, Norderstedt, Germany	V30371
Visdisic eye ointment	Bausch & Lomb, Berlin, Germany	3099559