אין ויוו הערכה של שבר פיתוח קסם במהלך עצם הריפוי בעכברים שימוש בהתקן התואם ל- MRI Osteosynthesis את העכבר אתי

Summary

הערכת התפתחות רקמת ב קסם שבר במהלך הריפוי עצם endochondral חיוני לעקוב אחר תהליך הריפוי. כאן, אנחנו מדווחים על השימוש תהודה מגנטית הדמיה (MRI)-fixator חיצוני תואם את אתי העכבר כדי לאפשר MRI סריקות במהלך התחדשות העצם בעכברים.

Abstract

Endochondral ריפוי השבר הוא תהליך מורכב מעורבים בפיתוח של רקמה סיבית, הסחוס ואת osseous בקסם שבר. הכמות ברקמות שונות, קסם מספק מידע חשוב על השבר ריפוי התקדמות. זמין ויוו טכניקות כדי longitudinally לעקוב אחר התפתחות רקמת קסם מחקרים פרה שבר-הילינג, באמצעות חיות קטנות כוללים רדיוגרפיה דיגיטליות µCT הדמיה. עם זאת, בשתי הטכניקות הם רק מסוגלים להבחין בין רקמות על בסיס מינרלים מן, הלא-על בסיס מינרלים מן. כתוצאה מכך, זה בלתי אפשרי להפלות את הסחוס של סיבי רקמת. לעומת זאת, דימות תהודה מגנטית (MRI) מדמיין מבנים אנטומיים בהתאם לתוכן מים שלהן, ולכן עשוי להיות מסוגל לזהות noninvasively רקמות רכות והסחוס בנשיכה קסם שבר. . הנה, מדווחים על השימוש התואמים ל- MRI חיצוני fixator את אתי העכבר כדי לאפשר סריקות MRI במהלך התחדשות העצם בעכברים. הניסויים הראו כי את fixator ואת התקן הרכבה מחוייט לאפשר סריקות MRI חוזרות, ובכך מאפשר ניתוח האורך של התפתחות רקמת שבר-קסם.

Introduction

שבר משני ריפוי הוא הצורה הנפוצה ביותר של עצם ריפוי. זה תהליך מורכב מחקה היבטים ספציפיים של endochondral אונטוגנית התאבנות^1,2,3. שטף דם מוקדם שבר מורכב ברובו תאים חיסוניים, פרור, סיבי רקמת. חמצן נמוך מתח גבוהה זנים biomechanical ה"בלתי אוסטאובלסט בידול בפירצה שבר, אך לקדם את הבידול של ובתאים לתוך chondrocytes^4,5,6. תאים אלה להתחיל להתרבות באתר של פציעה כדי ליצור מטריצה הסחוס לספק יציבות ראשונית של עצם שבורה. במהלך ההבשלה קסם, chondrocytes הופכים היפרטרופית, עוברים אפופטוזיס, או טרנס-להבדיל לתוך תאי העצם. כורוידאלית באיזור סחוס-עד-עצם המעבר מספק רמות החמצן מוגברות, המאפשר את היווצרות הגרמית⁷. לאחר גרמית גישור על הפער שבר, יציבות biomechanical מתגברת, שיפוץ osteoclastic של קסם חיצוני שבר מתרחשת כדי לזכות מתאר ומבנה העצם פיזיולוגיים³. לכן, הכמויות של רקמה סיבית, הסחוס, העצם בקסם שבר לספק מידע חשוב על עצם תהליך הריפוי. מוטרד או מתעכבות ריפוי הופך גלוי על ידי שינויים של התפתחות רקמת קסם הן בני אדם והן עכברים^8,9,10,11. טכניקות זמינים ויוו לפקח longitudinally קסם התפתחות רקמת ב שבר פרה ריפוי מחקרים באמצעות חיות קטנות כוללים רדיוגרפיה דיגיטליות µCT הדמיה^12,13. עם זאת, בשתי הטכניקות מסוגלים רק מתלבטים על בסיס מינרלים מן, הלא-על בסיס מינרלים מן הרקמות. לעומת זאת, MRI מספקת ניגודיות מעולה רקמה רכה, ולכן עשוי להיות מסוגל לזהות רקמות רכות והסחוס בנשיכה קסם שבר.

העבודות הקודמות הראה תוצאות מבטיחות עבור פוסט מורטם MRI בעכברים עם שברים במפרק¹⁴ וויוו MRI בעכברים במהלך ריפוי פגם עצם intramembranous¹⁵. עם זאת, שני המחקרים הצהיר גם מוגבל מרחבית החדות ברזולוציה ורקמות. בעבר להדגים את הכדאיות של MRI ברזולוציה גבוהה ויוו להערכת האורך היווצרות קסם רך במהלך שבר endochondral מאתר הריפוי¹⁶. כאן, אנו מדווחים על הפרוטוקול עבור שימוש fixator חיצוניים התואמים ל- MRI של עצם הירך osteotomy בעכברים כדי לעקוב אחר התפתחות רקמת קסם longitudinally במהלך השבר endochondral תהליך הריפוי. העיצוב של התקן הרכבה בהזמנה אישית עבור החדרת fixator חיצוני הבטיחו עמדה סטנדרטית במהלך סריקות חוזרות ונשנות.

Protocol

חיה כל הניסויים פעלו לפי תקנות בינלאומיות עבור טיפול והשתמש של חיות מעבדה ואושרו על-ידי הרשויות הרגולטוריות אזוריות (1250 מס, Regierungspräsidium טיבינגן, גרמניה). כל העכברים היו מתוחזקים בקבוצות של שניים עד חמישה בעלי חיים לכל הכלוב על אור 14-h, 10-h כהה ביולוגי עם מים ואוכל סיפק ad libitum.

1. הכנת חומר כירורגית וטיפול קדם של העכברים

1. Sterilize כירורגית כל חומר. שימוש autoclaving טמפרטורה של 120-135 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות של זמן עיקור.
עכברים
2. רכש C57BL/6 או עכברים מהמאמץ אחר אשר הם בין 19-35 גרם של משקל הגוף. בצע את טיפול בבעלי חיים המתאים והפרוטוקולים ניסיוני על פי קווים מנחים הלאומי אושרה על ידי החוקר ' s טיפול בעלי חיים מוסדיים והוועדה שימוש. הקדישו לפחות תקופת הסתגלות 7 ימים לפני תחילת ההליך.
3. לספק שיכוך כאבים עכברים כל דרך המים לשתייה יום אחד לפני הניתוח עד היום השלישי שלאחר הניתוח.

2. הליך כירורגי ויישום של Fixator חיצוני

1. במקום העכבר לתוך צינור מראש עם 5-7 אחוז חמצן איזופלוריין ו- 60 mL/min. לאחר אובדן רפלקסים בתנוחה, להסיר את העכבר מהצינור אינדוקציה הרדמה ולקיים ההרדמה באמצעות מסיכת אינהלציה מתן חמצן 1-3% איזופלוריין ו- 60 mL/min. דפוס
   1. צג הנשימה ואת הינד paw רפלקס במהלך הרדמה. ודא קצב הנשימה מחזורים בסביבות 100/דקה רפלקס כפת האחוריות נעדר.
      ​ הערה: כמות הדלק הדרוש הוא תלוי גיל, מין, משקל גוף, זן של העכבר.
2. לפני הניתוח, להזריק את העכבר עם מנה אחת של אנטיביוטיקה subcutaneously (clindamycin, 45 מ"ג/ק"ג). יתר על כן, לצורך תחזוקה של איזון נוזלים פיזיולוגיים, להזריק את העכבר עם מחסן נוזלים תת-עורי תמיסת µL 500 (0.9% NaCl).
3. למניעת הקרנית ייבוש, להחיל משחה עין העיניים העכבר. הנח את העכבר על צלחת חימום ב 37 מעלות צלזיוס במהלך ההרדמה, הליך כירורגי כדי לשמור על פיזיולוגית וחום הגוף.
4. להסיר את הפרווה של האיבר הינד נכון, לשפשף את האזור הכירורגי עם חומר חיטוי בסיס אלכוהול. מכסים הכפה האחוריות נכון עם חלק קטן של כפפה סטרילית להימנע אזורים תקיימו. לחטא את האיבר הינד נכון שלוש פעמים. הצב תלוי סטרילי על העכבר כל פרט האזור הכירורגי.
5. תחתכי את העור כ 1 ס"מ longitudinally לאורך הצד הקדמי של עצם הירך נכון עם אזמל. נפרדים שמותחת את הדו-ראשי אמ, את אמ vastus lateralis עם מספריים מיקרו וחדים. חותכים לצד מקור גיד תל הירך עצם הירך עם מספריים מיקרו כדי לאפשר גישה חופשית אל החלק anterolateral של העצם. ודא כי בעצב נשמר.
6. למקם את fixator חיצוני (מפוח נוקשות 3 N/מ מ, איור 1 א') מקביל עצם הירך. באופן ידני לקדוח את קדחים דרך הקליפה עם מקדחה 0.45 מ מ ומניחים את הקרמי הרכבה סיכות לתוך קדחים. להתחיל עם ה-pin מקורב ביותר, ואחריו את הסיכה דיסטלי ביותר, ואת שני הפינים שביניהם.
   1. ודא כי שם אין מתח, דחיסה או גזירה על fixator במהלך ההליך הרכבה, אחרת הפער osteotomy מושגת לא יהיה מספיק בגלל הרפיה של fixator.
7. ללחלוח העצם עם כמות קטנה של NaCl סטרילי למניעת התייבשות במהלך ההליך ניסור.
8. ליצור osteotomy 0.4 מ מ דרך העצם שלם בין שני הפינים הפנימי באמצעות מסור תיל ג'יגלי 0.4 מ מ.
   הערה: לחלופין, ראה מיקרו נדנוד יכול לשמש כדי ליצור את osteotomy. לוודא למנוע כל שבבי מתכת החל המסור באזור osteotomy.
9. להוריד את הפער osteotomy בזהירות עם 2 מ של NaCl סטרילי כדי להסיר את שבבי עצם בין cortices שבר שני.
10. להתאים את השרירים באמצעות בתפר רצוף בתפר resorbable (ראה טבלה של חומרים). ואז להתאים את העור באמצעות תפרים שאינם resorbable קטע (ראה טבלה של חומרים). כדי למנוע את הפצע נושכת, אל תמקם את התפר בחלק הגולגולת של הפצע.
    הערה: אין להשתמש בדבק עור או קליפים מאז עכברים בדרך כלל להסיר אותו הפצע גרימת נזק נוסף על העור-
11. לנקות את האזור הכירורגי עם חומר מחטא למקם העכבר לתוך הכלוב שלו. הצג את העכבר ואת אספקת חום מספיק (למשל על ידי אור אינפרא-אדום) עד שהוא הוא ער לגמרי. לפקח על מים, צריכת מזון ומשקל הגוף אחרי הניתוח ודא כי החיה אינו נמצא כאב ומצוקה. לספק שיכוך כאבים עכברים כל דרך המים לשתייה עד היום השלישי שלאחר הניתוח.
    הערה: עכברים ייתכן ישוכנו בקבוצות של עד ארבע חיות.
12. לפקח על העכבר ' s פעילות בימים 1 ל 5 לאחר הניתוח. במהלך הזמן הזה, העכבר צריך לשאת משקל על האיבר המופעלים. אחרת, העכבר לא ייכללו ניתוח נוסף.

3. MRI הליך וניתוח תמונה

1. לפני ה MRI סריקה נוהל, להרדים את העכבר לפי הפרוטוקול בשלבים 2.1 ו- 2.3, ולשמור את קצב הנשימה סביב 100 לדקה מחזורים להוסיף את fixator חיצוני האיבר הינד נכון של העכבר בזהירות לתוך התקן הרכבה בהזמנה אישית ( איור 1 ב, ג).
   1. לוודא למנוע כיפוף או דחיסה של fixator במהלך שלב זה, מאז זה עשוי להפריע ריפוי השבר.
      הערה: סריקות MRI יכול להתבצע מוקדם ככל 3 ימים לאחר הניתוח, בהתאם טיפול בבעלי חיים נסיוני.
2. במקום בעכבר על עריסה מבוקרת טמפרטורה על ההקדמה לתוך המכשיר MRI. לחבר את המכשיר הרכבה נוקשה לסליל ראש ארבעה.
3. MRI לרכוש נתונים באמצעות גבוהה-שדה קטן-חיה MRI מערכת ייעודית פועלים ב 11.7 טי
   ​ הערה: MRI נתוני הרכישה הגיאומטריה מיושר עם עצם הירך, orthogonally הברגים.
   1. רכוש נתונים על-ידי החלת פרוטון-צפיפות דיכא שומן פרוסה רב TSE רצף (טסה-PD) באמצעות רכישת פרמטרים: אקו/החזרה זמן טה = ms 5.8/יח = 2,500 ms, רזולוציה Δr = 52 × 52 × 350 µm³, שדה-of-view (FOV) = 20 × 20 mm ², ואת רוחב הפס Δω = 150 קילו-הרץ-
   2. הערה: הזמן הכולל רכישת לפרוסות 22 הוא מינימלית 36
4. לפתוח את הנתונים שהושגו עם התמונה ניתוח תוכנה. להזין את voxel בגודל כ- 0.05 x 0.05 x מ מ 0.35 ³. קטע ברקמות שונות, קסם שבר (עצמות, סחוס, רקמה סיבית/מח) מבוסס על עצמתם עם סף חצי אוטומטי כדלקמן.
   1. לחץ " לערוך שדה תווית חדש ", לחץ על " להוסיף חומר ", ולשנות את החומר " מתייבש ". להבחין בין האזור קסם מן הרקמות הסובבות בהתבסס על האיתות היפו-אינטנסיבי באמצעות קרום העצם " לאסו " כלי.
   2. לחץ " להוסיף חומר ". לחץ על " להוסיף חומר " ולשנות את החומר " הסחוס ". קטע הסחוס באמצעות " הסף " הכלי, " בחר רק הנוכחי חומר " מן " מתייבש ". לחץ על " הסחוס ", " להוסיף חומר ". חזור על שלבים אלה עם " עצם " ו " מח עצם/סיבי רקמת ".
5. ליצור שחזורים תלת-ממד של עצמות, עדיין יש שבר בהתבסס על הנתונים פילוח רקמות באמצעות תוכנת ניתוח התמונה. לחץ על " ליצור משטח ", החל " אף " עבור " סוג החלקת " ולחץ על " משטח התצוגה ".
   הערה: קטן מאוד, רגשניים באזורים המקיפים את ends של cortices שבר שסביר להניח חפצים עקב המעבר גרמית רקמות רכות. אזורים אלה לא להיות כלולים ניתוח נוסף. באזורים Hyper-אינטנסיבי במרכז השבר מתייבש במהלך שלב endochondral של שבר ריפוי רקמות הסחוס מייצגים. אזורים היפו-עז-קסם שבר דיסטלי מן הפער osteotomy בשלב התקשות endochondral, אזורים באותה אינטנסיביות לאורך כל קסם כל שבר ב מאוחר יותר ריפוי בשלבים מייצגים קסם גרמית שהוקם רקמות. למרות באזורים אלה יש אות היפו-אינטנסיבית, עוצמת האות של עצם בוגרת (cortex) הוא אפילו פחות. לאחר קביעת סף עוצמת האות הגרמית, רקמות הסחוס קסם שבר, לסמן הרקמה הנותרת כמו מח העצם ורקמות סיביים. ערכים עבור מקטעי רקמת הם: הגרמית (כולל בוגרת קליפת העצם trabecular, רקמת העצם קסם) הוא מקוטע בטווח של 1-3.3 (עוצמת האות מנורמל ל קליפת בוגר), מח עצם/סיבי רקמת בטווח של 3.4-5.4, ו רקמת הסחוס קסם בטווח של 5.5-6.2.
6. אם יש צורך, חזור על ה-mri longitudinally במהלך השבר תהליך הריפוי. כדי לעקוב אחר התפתחות קסם הסחוס, לסרוק את העכברים בימים 10, 14, ו- 21 לאחר הניתוח.
   הערה: נקודות זמן עשוי תלויים על טיפול בבעלי חיים, נסיוני.

תוצאות

ראשית, ההצלחה של הליך כירורגי יכול להיות מאושרות על ידי ניתוח של MRI סריקות (עיין בדוגמה באיור 2). כל הפינים ארבע צריך להיות ממוקם הפיר הירך. גודל הפער osteotomy צריך להיות בין 0.3-0.5 מ מ. אם גודל הפער osteotomy משתנה במידה רבה בין ערכים אלה, העכבר לא להיות כלולים ניתוח נו?...

Discussion

שינויים, פתרון בעיות:

המטרה העיקרית של מחקר זה היה לתאר את פרוטוקול לשימוש של fixator חיצוני MRI תואם עבור עצם הירך osteotomy העכבר עם היכולת לעקוב אחר התפתחות רקמת קסם longitudinally במהלך תהליך ריפוי השבר endochondral. העיצוב של התקן הרכבה בהזמנה אישית עבור החדרת fixator חיצוני הבטיחו עמד?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaesthesia tube	FMI, Seeheim, Germany	ZUA-82-ANA-TUB-Mouse
Anaesthetic machine	FMI, Seeheim, Germany	ZUA-82-GME-MA
Artery forceps	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BH104R
Autoclave	Systec, Wettenberg, Germany	DX-150
Autoclaving packaging	Stericlin, Feuchtwangen, Germany	2301-04/06/10/12/16
Avizo software	FEI, Burlington, USA	-	Version 8.0.1
BioSpec 117/16 magnetic resonance imaging system	Bruker Biospin, Ettlingen, Germany	117/16
Bulldog clamp	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BH 021R
Carbon steel scalpel no. 11/15	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BA211/215
Ceramic mounting pin 0.45 mm	RISystem, Davos, Switzerland	HS691490
Clindamycin (300 mg / 2ml)	Ratiopharm, Ulm, Germany	-
Dressing forceps 115 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BD210R
Dressing forceps 130 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BD025R
Drill bit coated 0.45 mm	RISystem, Davos, Switzerland	HS820420
Durogrip needle holder 125 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BM024R
Foliodrape	Hartmann, Heidenheim, Germany	2513026
Frekaderm	Fresenius, Bad Homburg, Germany	4928211
Gigli saw 0.44 mm	RISystem, Davos, Switzerland	RIS.590.110.25
Hand drill	RISystem, Davos, Switzerland	RIS.390.130-01
Heating plate	FMI, Seeheim, Germany	IOW-3704
Hygonorm gloves	Hygi, Telgte, Germany	2706
Isoflurane	Abbot, London, UK	Forene
Micro forceps 155 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BD343R
Micro scissors 120 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	FD013R
Mouse FixEx L 0.7 mm	RISystem, Davos, Switzerland	RIS.611.300-10
Needle case for drills	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BL911R
Needle holder	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BB078R
Octenisept	Schülke, Norderstedt, Germany	121403
Osirix software	Pixmeo SARL, Bernex, Switzerland	-	Version 4.0
Oxygen, medical grade	MTI, Ulm, Germany	-
Resolon 5/0	Resorba, Nürnberg, Germany	88143
Saline 0.9%	Braun, Melsungen, Germany	3570350
Scalpel handle 125 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BB073R
Scissors 150 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BC006R
Sealer for autoclave packaging	Hawo GmbH, Obrigheim, Germany	HM500
Sterican 27 G	Braun, Melsungen, Germany	4657705
Sterile surgical blades no. 11/15	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BB511/515
Surgical gloves	Hartmann, Heidenheim, Germany	Peha-micron 9425712
Surgical light	Maquet SA, Ardon, France	Blue line 80
Syringes 5 ml	Braun, Melsungen, Germany	Injekt 4606051V
Tissue forceps 80 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	OC091R
Tramadol 25 mg/l	Grünenthal, Aachen, Germany	100mg/ml
Vasofix Safety	Braun, Melsungen, Germany	4268113S-01
Vicryl 5-0	Ethicon, Norderstedt, Germany	V30371
Visdisic eye ointment	Bausch & Lomb, Berlin, Germany	3099559