Na Vivo Avaliação do desenvolvimento de calo de fratura durante a consolidação óssea em ratos usando um dispositivo de osteossíntese compatível com MRI para o fêmur de Mouse

Resumo

A avaliação do desenvolvimento do tecido no calo de fratura durante a cicatrização de osso endocondral é essencial para monitorar o processo de cicatrização. Aqui, nós relatamos o uso de uma ressonância magnética (MRI)-fixador externo compatível para o fêmur do mouse para permitir MRI varreduras durante a regeneração óssea em ratos.

Resumo

Endocondral fratura cura é um processo complexo que envolve o desenvolvimento de tecido fibroso, cartilaginoso e ósseo no calo de fratura. A quantidade de tecidos diferentes em calo ósseo fornece informações importantes sobre a fratura cura progresso. Disponível na vivo técnicas para monitorar longitudinalmente o desenvolvimento de tecido de calo em estudos pré-clínicos consolidação da fratura, utilizando pequenos animais incluem radiografia digital e imagem latente de µCT. No entanto, ambas as técnicas só são capazes de distinguir entre o tecido mineralizado e não-mineralizado. Por conseguinte, é impossível discriminar cartilagem de tecido fibroso. Em contraste, ressonância magnética (MRI) visualiza estruturas anatômicas com base no seu teor de água e, portanto, pode ser capaz de identificar canaliza o tecido mole e cartilagem no calo de fratura. Aqui, nós relatamos o uso do fixador externo compatível com o MRI para o fêmur do mouse para permitir ressonâncias durante a regeneração óssea em ratos. Os experimentos demonstraram que o fixador externo e um dispositivo de fixação feito por permitam ressonâncias repetitivas, possibilitando assim a análise longitudinal do desenvolvimento do tecido de calo de fratura.

Introdução

Consolidação da fratura secundária é a forma mais comum de consolidação óssea. É um processo complexo, imitando a aspectos específicos da^32,1,do ossificação endocondral ontogenic. O hematoma de fratura precoce consiste predominantemente de células do sistema imunológico, granulação e tecido fibroso. Tensão de oxigênio de baixa e altas tensões biomecânicas dificultam a diferenciação osteoblástica na gap da fratura, mas promovem a diferenciação de células progenitoras em condrócitos^4,5,6. Essas células começam a proliferar no local da lesão para formar uma matriz cartilaginosa, fornecendo estabilidade inicial do osso fraturado. Durante a maturação do calo, condrócitos se tornar hipertróficas, passam por apoptose, ou trans-se diferenciar em osteoblastos. Neovascularização na zona de transição de cartilagem-de-osso fornece níveis elevados de oxigênio, permitindo a formação de tecido ósseo,⁷. Depois da ponte óssea do fosso de fratura, estabilidade biomecânica é aumentada e osteoclástica remodelação do calo externo fratura ocorre para ganhar óssea fisiológica contorno e estrutura³. Portanto, a quantidade de tecido fibroso, cartilaginoso e ósseo no calo de fratura fornece informações importantes sobre a processo de consolidação. Perturbado ou retardado cura torna-se visível por alterações do desenvolvimento do tecido de calo tanto em humanos e ratos^8,9,10,11. Disponível na vivo técnicas para monitorar longitudinalmente o desenvolvimento de tecido calo ósseo em fratura pré-clínicos cura estudos utilizando pequenos animais incluem radiografia digital e µCT de imagem^12,13. No entanto, ambas as técnicas só são capazes de discriminar entre o tecido mineralizado e não-mineralizado. Em contraste, ressonância fornece contraste excelente de tecidos moles e, portanto, pode ser capaz de identificar os tecidos moles e cartilagem no calo de fratura.

Trabalhos anteriores mostraram resultados promissores para post mortem MRI em camundongos com fraturas articulares¹⁴ e na vivo MRI em ratos durante intramembranosa defeito ósseo-cura¹⁵. No entanto, ambos os estudos também declarou limitada contraste espacial, resolução e tecido. Nós anteriormente demonstrou a viabilidade da RM de alta resolução na vivo para avaliação longitudinal da formação de calo macio durante fratura endocondral murino¹⁶de cura. Aqui, nós relatamos o protocolo para o uso de fixador externo compatível com o MRI para osteotomia de fêmur em ratos a fim de monitorar o desenvolvimento de tecido calo longitudinalmente durante a fratura endocondral, processo de cura. O projeto de um dispositivo de montagem sob medida para a inserção do fixador externo assegurado uma posição padronizada durante as varreduras repetidas.

Protocolo

animal todos os experimentos cumprimento de regulamentos internacionais para o cuidado e o uso de animais de laboratório e foram aprovados pelas autoridades reguladoras regionais (n. º 1250, Regierungspräsidium Tübingen, Alemanha). Todos os ratos foram mantidos em grupos de dois a cinco animais por gaiola a luz 14-h, 10 h a escuro ritmo circadiano com água e alimentos fornecidos ad libitum.

1. preparação do Material cirúrgico e pré-tratamento dos ratos

1. esterilize tudo cirúrgico material. Use uma temperatura de autoclave de 120-135 ° C por 20-30 min do tempo de esterilização.
2. Compra C57BL/6 ratos ou camundongos de outra estirpe, que têm entre 19-35 g de peso corporal. Siga o cuidado animal apropriado e protocolos experimentais em conformidade com as diretrizes nacionais que é aprovado pelo investigador ' s cuidados institucionais do Animal e Comissão de utilização. Permitir um mínimo de 7 dias o período de aclimatação antes de iniciar o procedimento.
3. Fornecer analgesia para todos os mouses através da água potável, um dia antes da cirurgia até o dia em terceiro pós-operatório.

2. Procedimento cirúrgico e a aplicação de fixador externo

1. lugar o mouse em um tubo preloaded com 5-7% de isoflurano e 60 mL/min de oxigênio. Após a perda de reflexos posturais, remover o mouse do tubo de indução da anestesia e manter a anestesia através de uma máscara de inalação, fornecendo oxigênio isoflurano e 60 mL/min de 1-3%.
   1. Monitor a respiração padrão e cerva pata reflexo durante a anestesia. Certifique-se de que a taxa de respiração é cerca de 100 ciclos/min e o reflexo da pata traseira está ausente.
      ​ Nota: A quantidade de gás necessário é dependente da idade, sexo, peso corporal e estirpe do mouse.
2. Antes da cirurgia, injetar o mouse com uma dose única de antibióticos por via subcutânea (Clindamicina, 45 mg/kg). Além disso, para a manutenção do equilíbrio fisiológico fluido, injetar o mouse com um depósito de fluido subcutâneo de soro fisiológico 500 µ l (0,9% NaCl).
3. Para evitar corneal secagem, aplica pomada para os olhos de rato. Coloque o mouse sobre uma placa de aquecimento a 37 ° C durante a anestesia e procedimento cirúrgico para manter fisiológica de temperatura corporal.
4. Remover a pele da extremidade direita de hind e esfregue a área cirúrgica com um desinfectante à base de álcool. Cobrir a pata traseira direita com uma pequena parte de uma luva estéril para evitar áreas não esterilizadas. Desinfecte o membro posterior direito três vezes. Coloque um pano estéril sobre o mouse todo exceto para a área cirúrgica.
5. Entalha a pele de aproximadamente 1 cm no sentido longitudinal ao longo da parte anterior do fêmur direito com um bisturi. Separe sem rodeios o m. bíceps femoral e o m. vasto lateral com pinças e tesoura micro. Corte o lado de origem do tendão o trocânter do fêmur com uma tesoura micro para permitir o livre acesso à parte ântero-lateral do osso. Certifique-se de que o nervo ciático é preservado.
6. Posicionar o fixador externo (rigidez axial de N/mm 3, Figura 1 A) paralelo ao fêmur. Perfurar os furos através do córtex com uma broca de 0.45 mm e coloque a cerâmica pinos de montagem para os furos manualmente. Comece com o pino mais proximal, seguido pelo pino mais distal e os dois pinos no meio.
   1. Certifique-se que não há nenhuma tensão, compressão ou tensão de cisalhamento no fixador durante o procedimento de montagem, caso contrário, o fosso de osteotomia alcançado não serão suficiente devido ao relaxamento do fixador.
7. Umidificar o osso com uma pequena quantidade de NaCl estéril para evitar a desidratação durante o processo de serragem.
8. Criar uma osteotomia de 0.4 mm através do osso inteiro entre os dois pinos internos usando uma serra de fio de gigli de 0,4 mm.
   Nota: Opcionalmente, uma serra oscilatória micro pode ser usada para criar a osteotomia. Certifique-se de evitar qualquer metais microplaquetas da Serra na área da osteotomia.
9. Liberar o gap de osteotomia cuidadosamente com 2 mL de NaCl estéril para remover fragmentos de ossos, entre os dois córtices fraturados.
10. Adaptar os músculos por meio de uma sutura contínua com uma sutura absorvível (ver Tabela de materiais). Então, adapte a pele usando interrompidas suturas não-absorvíveis (ver Tabela de materiais). Para evitar ferimento morder, não coloque a sutura na parte cranial da ferida.
    Nota: Não use cola de pele ou clipes desde ratos, geralmente, removê-lo da ferida causando mais danos à pele.
11. Limpar a área cirúrgica com um desinfetante e posicione o mouse em sua gaiola. Monitor, mouse e abastecimento calor suficiente (por exemplo, pela luz infravermelha) até que ele é totalmente desperto. monitorar o peso corporal, ingestão de alimentos e água após a cirurgia para Certifica-se de que o animal não é de dor e angústia. Proporcionar uma anestesia para todos os mouses através da água potável até o dia em terceiro pós-operatório.
    Nota: Os ratos podem ser alojados em grupos de até quatro animais.
12. Monitorar o mouse ' atividade nos dias 1 a 5, após a cirurgia. Durante esse tempo, o rato deve suportar o peso sobre o membro operado. Caso contrário, o mouse deve ser excluído da análise adicional.

3. Procedimento de MRI e análise de imagens

1. prévio para o MRI varredura procedimento, anestesiar o mouse de acordo com o protocolo em passos 2.1 e 2.3 e manter a taxa respiratória cerca de 100 ciclos/min. inserir o fixador externo na extremidade direita do hind do rato com cuidado em um dispositivo de montagem sob medida ( Figura 1 B, C).
   1. Certifique-se de evitar flexão ou compressão do fixador durante esta etapa, já que isto pode interferir com a consolidação da fratura.
      Nota: As ressonâncias podem efectuar-se logo em 3 dias após a cirurgia, dependendo do cuidado animal e protocolo experimental.
2. Coloque o mouse sobre um suporte de temperatura controlada para introdução no aparelho MRI. Conecte o dispositivo de montagem rígida para a bobina de cabeça de quatro elementos.
3. Dados de MRI adquirir usando um sistema dedicado de MRI pequeno-animal alto-campo operando em 11,7 T.
   ​ Nota: geometria de aquisição de dados The MRI é alinhada com o osso fêmur, ortogonalmente aos parafusos.
   1. Adquirir dados aplicando uma próton-densidade suprimido por gordura multi-slice TSE sequência (PD-TSE) usando parâmetros de aquisição: eco/repetição tempo TE = 5.8 ms/TR = 2.500 ms, resolução Δr = 52 × 52 × 350 µm³, campo de visão (FOV) = 20 × 20 mm ² e Δω de largura de banda = 150 KHz.
   2. Nota: O tempo de aquisição total para 22 fatias é 36 min.
4. Abrir os dados adquiridos com software de análise de imagem. Digite o tamanho de voxel como 0,05 x 0,05 x 0,35 mm ³. Segmente os tecidos diferentes no calo de fratura (osso, cartilagem, tecido fibroso ou da medula óssea) com base na sua intensidade com limiarização semi-automática como segue.
   1. Clique o " editar novo rótulo de campo ", clique " adicionar Material " e renomear o material para " do calo ". Distinguir a área de calo os tecidos circundantes baseada o sinal hipo-intensa o periósteo que usa o " Lasso " ferramenta.
   2. Clique " adicionar ao material ". Clique " adicionar Material " e renomeie o material para " cartilagem ". A cartilagem do segmento usando o " limiar " ferramenta e " selecione apenas atual material " de " do calo ". Clique " cartilagem " e " adicionar ao material ". Repita essas etapas com " osso " e " de tecido fibroso/medula óssea ".
5. Gerar reconstruções 3D dos fêmures fraturados baseadas nos dados de segmentação do tecido usando software de análise de imagem. Clique " gerar superfície ", aplicar " nenhum " para " tipo de suavização de " e clique em " vista de superfície ".
   Nota: Muito pequenas, hipertenso áreas circundantes do ptDS dos córtices fraturados são prováveis ser artefatos devido a transição do ossudo para tecidos moles. Essas áreas devem ser excluídas de uma análise mais aprofundada. Hyper-intensas áreas no meio da fratura do calo durante a fase de endocondral de fratura cura representam tecido cartilaginoso. Áreas de hipo-intensa no calo de fratura distal da gap osteotomia na fase de ossificação endocondral e áreas com a mesma intensidade em todo o calo de fratura toda em estágios de cura mais tarde representam tecido recém-formado do calo ósseo. Embora estas áreas têm um sinal hipo-intensa, a intensidade de sinal do osso maduro (córtex) é ainda menor. Após limiarização a intensidade de sinal para o tecido ósseo e tecido cartilaginoso no calo de fratura, marca o restante tecido como a medula óssea e tecido fibroso. São valores para segmentação de tecido: tecido ósseo (incluindo tecido de calo ósseo, osso trabecular e córtex maduro) é segmentado dentro do intervalo de 1-3.3 (intensidade de sinal normalizado para córtex maduro), medula óssea/fibroso tecido dentro do intervalo de 3.4-5.4, e tecido cartilaginoso calo dentro do intervalo de 5.5-6.2.
6. Se necessário, repita a varredura de MRI longitudinalmente durante o processo de consolidação da fratura. Para monitorar o desenvolvimento do calo cartilaginoso, digitalizar os ratos nos dias 10, 14 e 21 após a cirurgia.
   Nota: Os pontos de tempo podem depender o protocolo experimental e cuidado animal.

Resultados

Em primeiro lugar, o sucesso do procedimento cirúrgico pode ser confirmado pela análise das varreduras de MRI (ver exemplo na Figura 2). Todos os quatro pinos deverá situar-se no meio da diáfise femoral. O tamanho da lacuna a osteotomia deve ser entre 0.3-0.5 mm. Se o tamanho da lacuna osteotomia varia muito desses valores, o mouse deve ser excluído uma análise mais aprofundada.

Em segundo lug...

Discussão

Modificações e solução de problemas:

O principal objetivo deste estudo foi descrever um protocolo para o uso de fixador externo compatível com o MRI para osteotomia do fêmur no mouse com a capacidade de monitorar o desenvolvimento de tecido calo longitudinalmente durante o processo de consolidação da fratura endocondral. O projeto de um dispositivo de montagem sob medida para a inserção do fixador externo assegurado uma posição padronizada durante as varreduras rep...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaesthesia tube	FMI, Seeheim, Germany	ZUA-82-ANA-TUB-Mouse
Anaesthetic machine	FMI, Seeheim, Germany	ZUA-82-GME-MA
Artery forceps	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BH104R
Autoclave	Systec, Wettenberg, Germany	DX-150
Autoclaving packaging	Stericlin, Feuchtwangen, Germany	2301-04/06/10/12/16
Avizo software	FEI, Burlington, USA	-	Version 8.0.1
BioSpec 117/16 magnetic resonance imaging system	Bruker Biospin, Ettlingen, Germany	117/16
Bulldog clamp	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BH 021R
Carbon steel scalpel no. 11/15	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BA211/215
Ceramic mounting pin 0.45 mm	RISystem, Davos, Switzerland	HS691490
Clindamycin (300 mg / 2ml)	Ratiopharm, Ulm, Germany	-
Dressing forceps 115 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BD210R
Dressing forceps 130 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BD025R
Drill bit coated 0.45 mm	RISystem, Davos, Switzerland	HS820420
Durogrip needle holder 125 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BM024R
Foliodrape	Hartmann, Heidenheim, Germany	2513026
Frekaderm	Fresenius, Bad Homburg, Germany	4928211
Gigli saw 0.44 mm	RISystem, Davos, Switzerland	RIS.590.110.25
Hand drill	RISystem, Davos, Switzerland	RIS.390.130-01
Heating plate	FMI, Seeheim, Germany	IOW-3704
Hygonorm gloves	Hygi, Telgte, Germany	2706
Isoflurane	Abbot, London, UK	Forene
Micro forceps 155 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BD343R
Micro scissors 120 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	FD013R
Mouse FixEx L 0.7 mm	RISystem, Davos, Switzerland	RIS.611.300-10
Needle case for drills	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BL911R
Needle holder	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BB078R
Octenisept	Schülke, Norderstedt, Germany	121403
Osirix software	Pixmeo SARL, Bernex, Switzerland	-	Version 4.0
Oxygen, medical grade	MTI, Ulm, Germany	-
Resolon 5/0	Resorba, Nürnberg, Germany	88143
Saline 0.9%	Braun, Melsungen, Germany	3570350
Scalpel handle 125 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BB073R
Scissors 150 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BC006R
Sealer for autoclave packaging	Hawo GmbH, Obrigheim, Germany	HM500
Sterican 27 G	Braun, Melsungen, Germany	4657705
Sterile surgical blades no. 11/15	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BB511/515
Surgical gloves	Hartmann, Heidenheim, Germany	Peha-micron 9425712
Surgical light	Maquet SA, Ardon, France	Blue line 80
Syringes 5 ml	Braun, Melsungen, Germany	Injekt 4606051V
Tissue forceps 80 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	OC091R
Tramadol 25 mg/l	Grünenthal, Aachen, Germany	100mg/ml
Vasofix Safety	Braun, Melsungen, Germany	4268113S-01
Vicryl 5-0	Ethicon, Norderstedt, Germany	V30371
Visdisic eye ointment	Bausch & Lomb, Berlin, Germany	3099559