En Vivo Evaluación del desarrollo del callo de fractura durante la cicatrización ósea en ratones usando un dispositivo de osteosíntesis de MRI-compatible para el fémur de ratón

Resumen

La evaluación del desarrollo de tejido en el callo de fractura durante la cura de hueso endocondral es esencial para monitorear el proceso de curación. Aquí, Divulgamos el uso de una resonancia magnética (MRI)-compatible con fijador externo para fémur de ratón para permitir MRI las exploraciones durante la regeneración ósea en los ratones.

Resumen

Curación de fractura endocondral es un proceso complejo que involucra el desarrollo de tejido fibroso, cartilaginoso y óseo en el callo de fractura. La cantidad de los diferentes tejidos en el callo proporciona información importante sobre la fractura cura progreso. Disponible en vivo técnicas longitudinalmente, controlar el desarrollo de tejido de callo en estudios preclínicos de la curación de fractura con pequeños animales incluyen radiografía digital y la proyección de imagen de µCT. Sin embargo, ambas técnicas sólo son capaces de distinguir entre el tejido mineralizado y no mineralizado. Por lo tanto, es imposible diferenciar cartílago de tejido fibroso. En cambio, la proyección de imagen de resonancia magnética (RM) visualiza estructuras anatómicas basadas en su contenido en agua y por lo tanto, podrían ser capaces de identificar de forma no invasiva suave del tejido y del cartílago en el callo de fractura. Aquí, Divulgamos el uso de un fijador externo de MRI-compatible para el fémur de ratón para permitir las exploraciones de MRI durante la regeneración ósea en los ratones. Los experimentos demostraron que el fijador y un dispositivo de montaje a medida permiten IRM repetitivas, permitiendo análisis longitudinal del desarrollo de tejido de callo de fractura.

Introducción

Curación de fractura secundaria es la forma más común de cicatrización ósea. Es un proceso complejo que mímico aspectos específicos de ontogenic endocondral osificación^1,2,3. El hematoma de fractura temprana consiste en predominante de las células inmunes, granulación y tejido fibroso. Tensión de oxígeno baja alta tensiones biomecánicas dificultan la diferenciación de osteoblastos en el boquete de la fractura, y promoción la diferenciación de células progenitoras en condrocitos^4,5,6. Estas células comienzan a proliferar en el sitio de la lesión para formar una matriz cartilaginosa proporcionando estabilidad inicial del hueso fracturado. Durante la maduración del callo, condrocitos ser hipertróficas, experimentan apoptosis, o trans-se diferencian en osteoblastos. Neovascularización en la zona de transición de cartílago a hueso proporciona niveles elevados de oxígeno, que permite la formación de tejido óseo⁷. Después ósea tiende un puente sobre la brecha de la fractura, se incrementa la estabilidad biomecánica y remodelación osteoclástica del callo de fractura externa se produce obtener hueso fisiológico contorno y estructura³. Por lo tanto, la cantidad de tejido fibroso, cartilaginoso y óseo en el callo de fractura proporciona importante información sobre el proceso de curación del hueso. Perturbado o retrasada la curación llega a ser visible por alteraciones del desarrollo del tejido de callo en los seres humanos y ratones^8,9,10,11. Disponible en vivo técnicas longitudinalmente controlar desarrollo de tejido de callo en preclínica fractura cura estudios con animales pequeños incluyen radiografía digital y µCT de^12,13. Sin embargo, ambas técnicas sólo son capaces de discriminar entre tejido mineralizado y no mineralizado. Por el contrario, MRI proporciona contraste tejidos blandos excelente y por lo tanto, podría ser capaces de identificar los tejidos blandos y cartílago en el callo de fractura.

Trabajos previos demostraron resultados prometedores para post mortem MRI en ratones con fracturas articulares RM¹⁴ e in vivo en ratones durante defecto intramembranosa del hueso curativo¹⁵. Sin embargo, ambos estudios también declaró contraste de tejido y resolución espacial limitada. Previamente hemos demostrado la viabilidad de MRI de alta resolución en vivo para la evaluación longitudinal de la formación de un callo suave durante fractura endocondral murino curación¹⁶. Aquí, Divulgamos el protocolo para el uso de un fijador externo de MRI-compatible para la osteotomía del fémur en ratones para supervisar el desarrollo de tejido de callo longitudinalmente durante la fractura endocondral proceso de curación. El diseño de un dispositivo de montaje a la medida para la inserción del fijador externo garantiza una posición estandarizada durante los análisis repetidos.

Protocolo

animal todos los experimentos cumplen con normas internacionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por la autoridad regulatoria regional (no. 1250, competente Tübingen, Alemania). Todos los ratones fueron mantenidos en grupos de dos a cinco animales por jaula en una luz 14-h, 10 h oscuro del ritmo circadiano con agua y comida proporcionados ad libitum.

1. preparación del Material quirúrgico y tratamiento previo de los ratones

1. esterilizar todo quirúrgico material. Utilizar una temperatura de esterilización en autoclave de 120-135 ° C por 20-30 min de duración de la esterilización.
2. Compra C57BL/6 ratones o ratones de otra cepa que son entre 19-35 g de peso corporal. Siga el cuidado apropiado de los animales y protocolos experimentales con arreglo a directrices nacionales que es aprobada por el investigador ' s cuidado Animal institucional y Comité de uso. Deje un mínimo de 7 días de período de aclimatación antes de iniciar el procedimiento de.
3. Proporcionar analgesia a todos los ratones vía agua de bebida un día antes de la cirugía hasta el tercer día postoperatorio.

2. Procedimiento quirúrgico y la aplicación de fijador externo

1. lugar el ratón en un tubo precargado con 5-7% de isoflurano y 60 mL/min de oxígeno. Después de la pérdida de los reflejos posturales, quitar el ratón desde el tubo de inducción de la anestesia y mantener la anestesia a través de una máscara de inhalación proporcionar 1-3% isoflurano y 60 mL/min de oxígeno.
   1. Monitor de la respiración patrón y trasero pata reflejo durante la anestesia. Asegúrese de que la tasa de respiración es de alrededor de 100 ciclos/min y el reflejo de la patas traseras se ausenta.
      ​ Nota: la cantidad de gas necesitada es dependiente de la edad, sexo, peso corporal y la tensión del ratón.
2. Antes de la cirugía, inyectar el ratón con una dosis única de antibióticos por vía subcutánea (clindamicina, 45 mg/kg). Además, para el mantenimiento del equilibrio líquido fisiológico, inyectar el ratón con un depósito de líquido subcutáneo de solución salina 500 μl (0,9% NaCl).
3. Para evitar que la córnea secado, aplica ungüento oftálmico en los ojos de ratón. Coloque el ratón sobre una placa de calentamiento a 37 ° C durante la anestesia y procedimiento quirúrgico fisiológica de mantener temperatura del cuerpo.
4. Quitar la piel de las extremidades derecha y frote el área quirúrgico con un desinfectante a base de alcohol. Cubrir la pata trasera derecha con una pequeña parte de un guante estéril para evitar zonas sin esterilizar. Desinfectar las extremidades derecha tres veces. Colocar un paño estéril sobre el ratón todo excepto el área quirúrgico.
5. Incide la piel de aproximadamente 1 cm longitudinalmente a lo largo de la parte anterior del fémur derecho con un bisturí. Separar claramente el m. bíceps femoral y el m. vastus lateralis con pinzas y tijeras micro. Corte el lado de origen del tendón en el trocánter del fémur con una tijera micro para permitir el acceso libre a la parte anterolateral del hueso. Asegúrese de que el nervio ciático se conserva.
6. Colocar el fijador externo (rigidez axial de 3 N/mm, figura 1 A) paralela al fémur. Perfore los agujeros a través de la corteza con una broca de 0.45 mm y coloque lo pernos de montaje en los agujeros de cerámica manualmente. Comienzan con el pasador más proximal, seguido por el pin más distal y las dos clavijas en el medio.
   1. Asegúrese de que no hay ninguna tensión, compresión o tensión de esquileo en el fijador durante el procedimiento de montaje, de lo contrario la brecha osteotomía alcanzado no será suficiente debido a la relajación de la fixator.
7. Humidificar el hueso con una pequeña cantidad de NaCl estéril para evitar la deshidratación durante el proceso de aserrado.
8. Crear una osteotomía de 0,4 mm a través del hueso entero entre los dos pernos interiores usando una sierra de alambre gigli de 0,4 mm.
   Nota: Opcionalmente, un micro sierra oscilante se puede utilizar para crear la osteotomía. Asegúrese de evitar cualquier viruta metálica de la sierra en la zona de osteotomía.
9. Eliminar la brecha de la osteotomía con 2 mL de NaCl estéril para retirar virutas de hueso entre las dos cortezas fracturadas.
10. Adaptar los músculos mediante el uso de una sutura continua con una sutura reabsorbible (véase Tabla de materiales). Luego adaptar la piel mediante el uso de suturas no reabsorbibles interrumpidas (véase Tabla de materiales). Para evitar la herida penetrante, debe colocar la sutura en la parte craneal de la herida.
    Nota: No use el pegamento de la piel o clips desde ratones generalmente extraerlo la herida que causa más dañan a la piel.
11. Limpiar la zona quirúrgica con un desinfectante y colocar el ratón en su jaula. Monitor el mouse y suministro suficiente calor (por ejemplo por luz infrarroja) hasta que está totalmente despierto. Monitor de agua, consumo de alimentos y peso corporal después de la cirugía a Asegúrese de que el animal no está en el dolor y el malestar. Proporcionar analgesia a todos los ratones mediante el agua potable hasta el tercer día postoperatorio.
    Nota: Ratones pueden ser alojados en grupos de hasta cuatro animales.
12. Controlar el ratón ' actividad de s 1 a 5 días después de la cirugía. Durante ese tiempo, el ratón debe tener peso en el miembro operado. De lo contrario, el ratón debe excluirse de análisis.

3. Procedimiento de RMN y análisis de imágenes

1. antes de la MRI exploración procedimiento, anestesiar el ratón según el protocolo en los pasos 2.1 y 2.3 y mantener la frecuencia respiratoria de alrededor de 100 ciclos/min Introduzca el fijador externo en las extremidades derecha de la ratón con cuidado en un dispositivo de montaje a medida ( figura 1 B, C).
   1. Asegúrese de evitar flexión o compresión del fijador durante este paso ya que esto puede interferir con la cicatrización de la fractura.
      Nota: Las exploraciones de MRI pueden llevarse a cabo tan pronto como 3 días después de la cirugía, dependiendo del cuidado de los animales y el protocolo experimental.
2. Coloque el ratón sobre una base de temperatura controlada para la introducción en el dispositivo de MRI. Conecte el dispositivo de montaje rígido a la bobina principal de cuatro elementos.
3. Datos de MRI de adquirir mediante un alto campo pequeño animal MRI sistema operando a 11,7 T.
   ​ Nota: geometría de adquisición de datos de la resonancia magnética está alineado con el hueso fémur, ortogonalmente a los tornillos.
   1. Adquirir datos aplicando una densidad de protones gordo-suprimidas multicorte TSE secuencia (PD-TSE) utilizando los parámetros de adquisición: Eco/repetición tiempo TE = 5,8 ms/TR = 2.500 ms, resolución Δr = 52 × 52 × 350 µm³, campo de visión (FOV) = 20 × 20 mm ² y Δω de ancho de banda = 150 KHz.
   2. Nota: el tiempo de adquisición total de 22 rebanadas es min 36
4. Abra los datos adquiridos con software de análisis de imagen. Indique el tamaño del voxel como 0.05 x 0.05 x 0.35 mm ³. Segmento de los diferentes tejidos en el callo de fractura (hueso, cartílago, médula ósea tejido fibroso) basados en su intensidad con umbralización automática como sigue.
   1. Haga clic en el " editar nuevo etiqueta campo ", haga clic en " añadir Material " y cambiar el nombre del material a " callos ". Distinguir el área del callo de los tejidos circundantes, basados en la señal hipo intensa desde el periostio usando el " Lasso " herramienta.
   2. Clic " agregar al material ". Haga clic " agregar Material " y cambiar el nombre del material a " cartílago ". El cartílago del segmento mediante el uso de la " umbral " herramienta y " seleccione sólo material actual " de " de callos ". Haga clic en " cartílago " y " añadir a material ". Repita estos pasos con " ósea " y " tejido de la médula/fibroso ".
5. Generar reconstrucciones 3D de la fracturada fémur basada en los datos de segmentación del tejido usando software de análisis de imagen. Haga clic en " generar superficie ", aplique " ninguno " para " tipo alisado " y haga clic en " vista de superficie ".
   Nota: Muy pequeñas áreas hiper intenso alrededor de la enDS de las cortezas fracturadas están probable que sean artefactos debido a la transición de la huesuda a tejidos blandos. Estas áreas deben ser excluidas del análisis posterior. Áreas hyper-intensas en medio de la fractura callo durante la fase de endocondral de fractura cura representan tejido cartilaginoso. Áreas hipo intensa en el callo de fractura distal de la brecha de la osteotomía en la fase de osificación endocondral y con la misma intensidad a lo largo del callo de fractura completa en la cura después de etapas representan tejido recién formado callo oseo. Aunque estas zonas tienen una señal hipo intensa, la intensidad de señal del hueso maduro (corteza) es aún menor. Después de umbral la intensidad de la señal para el tejido óseo y tejido cartilaginoso en el callo de fractura, marcar los restantes tejidos como médula ósea y tejido fibroso. Los valores de segmentación del tejido son: tejido óseo (incluyendo corteza madura y hueso trabecular tejido de callo oseo) está segmentada dentro de la gama de 1-3.3 (intensidad de la señal normalizada a corteza madura), tejido de la médula/fibroso dentro de la gama de 3.4-5.4, y tejido cartilaginoso callo dentro del rango de 5.5-6.2.
6. Si es necesario, repetir la exploración de MRI longitudinalmente durante el proceso de curación de fractura. Supervisar el desarrollo de callo cartilaginoso, explorar los ratones en los días 10, 14 y 21 después de la cirugía.
   Nota: Los puntos del tiempo dependerá del cuidado de los animales y el protocolo experimental.

Resultados

En primer lugar, el éxito del procedimiento quirúrgico se puede confirmar por el análisis de las exploraciones de MRI (ver ejemplo en figura 2). Todos los cuatro pines deben ser situados en el centro del eje femoral. El tamaño de la brecha de la osteotomía debe ser entre 0.3-0.5 mm. Si el tamaño de la brecha de osteotomía varía mucho de estos valores, el ratón debe excluirse del análisis posterior.

Discusión

Modificaciones y resolución de problemas:

El objetivo principal de este estudio era describir un protocolo para el uso de un fijador externo de MRI-compatible para la osteotomía del fémur en el ratón con la capacidad para monitorear el desarrollo de tejido de callo longitudinalmente durante el proceso de curación de fractura endocondral. El diseño de un dispositivo de montaje a la medida para la inserción del fijador externo garantiza una posición estandarizada durante...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaesthesia tube	FMI, Seeheim, Germany	ZUA-82-ANA-TUB-Mouse
Anaesthetic machine	FMI, Seeheim, Germany	ZUA-82-GME-MA
Artery forceps	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BH104R
Autoclave	Systec, Wettenberg, Germany	DX-150
Autoclaving packaging	Stericlin, Feuchtwangen, Germany	2301-04/06/10/12/16
Avizo software	FEI, Burlington, USA	-	Version 8.0.1
BioSpec 117/16 magnetic resonance imaging system	Bruker Biospin, Ettlingen, Germany	117/16
Bulldog clamp	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BH 021R
Carbon steel scalpel no. 11/15	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BA211/215
Ceramic mounting pin 0.45 mm	RISystem, Davos, Switzerland	HS691490
Clindamycin (300 mg / 2ml)	Ratiopharm, Ulm, Germany	-
Dressing forceps 115 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BD210R
Dressing forceps 130 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BD025R
Drill bit coated 0.45 mm	RISystem, Davos, Switzerland	HS820420
Durogrip needle holder 125 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BM024R
Foliodrape	Hartmann, Heidenheim, Germany	2513026
Frekaderm	Fresenius, Bad Homburg, Germany	4928211
Gigli saw 0.44 mm	RISystem, Davos, Switzerland	RIS.590.110.25
Hand drill	RISystem, Davos, Switzerland	RIS.390.130-01
Heating plate	FMI, Seeheim, Germany	IOW-3704
Hygonorm gloves	Hygi, Telgte, Germany	2706
Isoflurane	Abbot, London, UK	Forene
Micro forceps 155 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BD343R
Micro scissors 120 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	FD013R
Mouse FixEx L 0.7 mm	RISystem, Davos, Switzerland	RIS.611.300-10
Needle case for drills	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BL911R
Needle holder	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BB078R
Octenisept	Schülke, Norderstedt, Germany	121403
Osirix software	Pixmeo SARL, Bernex, Switzerland	-	Version 4.0
Oxygen, medical grade	MTI, Ulm, Germany	-
Resolon 5/0	Resorba, Nürnberg, Germany	88143
Saline 0.9%	Braun, Melsungen, Germany	3570350
Scalpel handle 125 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BB073R
Scissors 150 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BC006R
Sealer for autoclave packaging	Hawo GmbH, Obrigheim, Germany	HM500
Sterican 27 G	Braun, Melsungen, Germany	4657705
Sterile surgical blades no. 11/15	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BB511/515
Surgical gloves	Hartmann, Heidenheim, Germany	Peha-micron 9425712
Surgical light	Maquet SA, Ardon, France	Blue line 80
Syringes 5 ml	Braun, Melsungen, Germany	Injekt 4606051V
Tissue forceps 80 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	OC091R
Tramadol 25 mg/l	Grünenthal, Aachen, Germany	100mg/ml
Vasofix Safety	Braun, Melsungen, Germany	4268113S-01
Vicryl 5-0	Ethicon, Norderstedt, Germany	V30371
Visdisic eye ointment	Bausch & Lomb, Berlin, Germany	3099559