JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تفاصيل البروتوكول هذا ببناء وتشغيل المجهر تتبع في الوقت الحقيقي 3D الجسيمات واحدة قادرة على تعقب النانو الفلورسنت يسبر سرعة انتشارية عالية ومعدلات العد فوتون منخفضة.

Abstract

جسيم واحد ثلاثي الأبعاد في الوقت الحقيقي تتبع (RT-3D-SPT) لديه القدرة على إلقاء الضوء على عمليات سريعة، 3D في أنظمة الهاتف الخلوي. على الرغم من أن أساليب RT-3D-SPT مختلفة قدمت في السنوات الأخيرة، تتبع عالية السرعة 3D نزع فتيل الجسيمات في معدلات العد فوتون منخفضة لا يزال يمثل تحديا. وعلاوة على ذلك، الرايت-3D-SPT الأجهزة عادة ما تكون معقدة وصعبة التنفيذ، تحد من تطبيقها على نطاق واسع للمشاكل البيولوجية. ويعرض هذا البروتوكول نظام RT-3D-SPT المسمى 3D "دينامية فوتون التعريب تتبع" (3D-ديبلوت)، التي يمكن أن تتبع الجسيمات بسرعة انتشارية عالية (تصل إلى 20 ميكرون/ق2) أسعار العد فوتون منخفضة (وصولاً إلى 10 كيلوهرتز). يستخدم 3D-ديبلوت منحرف الكهرضوئية ثنائية الأبعاد (2D--التخلص من الذخائر المتفجرة) وعدسة الانضباطي تدرج صوتي (علامة) إلى محرك أقراص واحد وركزت الليزر المستطيل بشكل حيوي في 3D. 3D-ديبلوت جنبا إلى جنب مع خوارزمية تقدير موقف أمثل، يمكن أن تلتحم جزيئات مفردة مع تعقب عالية السرعة والدقة العالية ومسلم. نظراً للإثارة واحدة وتخطيط مسار كشف واحد، 3D-ديبلوت قوية وسهلة لإقامة. ويناقش هذا البروتوكول كيفية بناء 3D-ديبلوت خطوة بخطوة. أولاً، يتم وصف تخطيط البصرية. المقبل، هو النظام معايرة والأمثل من قبل النقطية المسح حبة فلورسنت 190 نيوتن متر مع نانوبوسيتيونير كهرضغطية. أخيرا، وللتدليل على تتبع قدرة 3D في الوقت الحقيقي، يتم تعقب الخرز الفلورسنت 110 في شمال البحر الأبيض المتوسط في المياه.

Introduction

ظهور تقنيات التصوير المتقدمة قد فتحت نافذة لمعرفة هيكل من أي وقت مضى أكثر تفصيلاً من الظواهر الخلوية، على طول الطريق وصولاً إلى المستوى الجزيئي. أساليب مثل التعمير البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة)1،2،3، تنشيط صور التعريب مجهرية (النخيل)4،،من56،7 ومنظم الإضاءة مجهرية (SIM)8،،من910،11، وحفز الانبعاثات استنفاد مجهرية (STED)12،13، 14 قد تجاوزت الآن الحد حيود لتقديم التفاصيل لم يسبق لها مثيل في هيكل ووظيفة الخلايا الحية. ومع ذلك، كامل فهم كيف أن هذه النظم تتصرف يتطلب المعلومات الحيوية، فضلا عن المعلومات الهيكلية. القرار فائقة الأساليب المذكورة أعلاه تشمل مفاضلة بين القرار المكانية والأزمنة، يحد من الدقة الزمنية التي يمكن بحث العمليات الحيوية. أسلوب الذي يوفر عالية الدقة المكانية والزمانية القرار هو RT-3D-SPT15،،من1617،،من1819،20، 21،23،22،،من2426،25،27،،من2829. هنا، يمكننا التمييز بين SPT 3D التقليدية30 و RT-3D-SPT. التقليدية يتطلب 3D SPT ببساطة سلسلة زمنية من بيانات الصورة ثلاثية الأبعاد (والتي يمكن الحصول عليها أما باستخدام مجهر [كنفوكل] أو مجهر ابيفلوريسسينسي ونظرا للتكوين الصحيح). في 3D التقليدية-SPT، تتحدد إحداثيات الجسيمات بعد جمع البيانات بتحديد الجسيمات في كل مكدس الصورة وسلسلة المواقع الموجودة في وحدات التخزين المتعاقبة لإنشاء مسار. لهذه الأساليب، يتحدد القرار الزمانية في نهاية المطاف بمعدل التصوير الحجمي. لمجاهر [كنفوكل]، وهذا بسهولة بمقياس ثانية لعشرات ثواني. لأساليب ابيفلوريسسينسي، حيث يتم معالجته المسار البصري حيث أنه يمكن استخراج معلومات الموقع المحوري، يقتصر القرار الزماني وقت التعرض أو قراءات الكاميرا. تقتصر هذه الأساليب ابيفلوريسسينت في النطاق الذي يمكن جمع المعلومات المحوري، وعلى الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا في مرحلة الطائرة فورييه أقنعة التصميم والبصريات التكيفية وتوسع هذه النطاقات إلى 10 ميكرون أو أكثر31،32 , 33 , 34.

وفي المقابل، RT-3D-SPT لا تعتمد على الحصول عليها كومة صور الثلاثية الأبعاد والجسيمات بعد وقوعها. بدلاً من ذلك، يتم استخراج معلومات الموقع في الوقت الحقيقي عن طريق الكشف عن نقطة واحدة وردود الفعل يطبق على فعالية "قفل" الجسيمات في تنسيق حجم العدسة الهدف عن طريق استخدام مرحلة كهرضغطية العالية السرعة. يسمح هذا القياس المستمر للموقف الجسيمات محدودة فقط التي يمكن جمعها كم عدد الفوتونات. وعلاوة على ذلك، تتيح هذه الطريقة الاستجواب الطيفية للجسيمات وهي تنتقل عبر مسافات بعيدة. RT-3D-SPT سارية المفعول قوي يعمل أقرب إلى فخ خالية من القوة ضوئية لكائنات النانو، حيث الجسيمات باستمرار سبر ويقاس في الوقت الحقيقي دون الحاجة إلى صلاحيات كبيرة الليزر أو البصرية. نظراً لأن RT-3D-SPT يوفر وسيلة للاستجواب مستمر من كائنات سريعة انتشارية (تصل إلى 20 ميكرون2/ق)25،29 في الأبعاد الثلاثة في فوتون المنخفضة عد أسعار20،29، 35، ينبغي أن يوفر نافذة في العمليات البيولوجية سريعة أو عابرة مثل نقل البضائع داخل الخلايا ويجند مستقبلات ملزم وديناميات فيريونس واحد خارج الخلية. ومع ذلك، إلى هذه النقطة، تطبيق RT-3D-SPT اقتصر على حفنة الجماعات التي تعمل على النهوض بهذه التكنولوجيا.

جدار واحد من تعقيد التخطيط البصرية المطلوبة بأساليب RT-3D-SPT، التي تتنوع. لمعظم طرق التغذية المرتدة البصرية يتم توفيرها من قبل مرحلة كهرضغطية. كالجسيمات يجعل الحركات الصغيرة في X، Y، أو Z، قراءات من نقطة واحدة للكشف عن تحويلها إلى وظائف خطأ وتغذية في عالي السرعة إلى نانوبوسيتيونير كهرضغطية، الذي بدوره ينتقل العينة للتصدي للحركة للجسيمات، وفعالية قفل عليه في مكان بالنسبة للعدسة الهدف. لقياس الحركات الموضعية الصغيرة في X، Y، و Z، أما متعددة (4 أو 5 اعتماداً على التنفيذ) للكشف عن15،،من1821 أو متعددة الإثارة البقع (2-4، الأقل من التي يمكن تطبيقها إذا يتم استخدام قفل في مكبر للصوت لاستخراج X وموقف Y باستخدام التناوب ليزر بقعة) تطبق25،28 . التداخل بين هذه البقع الكشف والانبعاث متعددة تجعل النظم صعوبة في محاذاة والحفاظ على.

هنا، نحن نقدم أسلوب عالي السرعة المستهدفة غير الساحلية و 3D-SPT مع تصميم بصرية مبسط يسمى 3D-ديبلوت29. يستخدم 3D-ديبلوت 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة وعلامة عدسة36،،من3738 للتحرك بشكل حيوي بقعة ليزر مركزة من خلال حجم التنسيق الموضوعي بمعدل مرتفع (50 كيلوهرتز XY، 70 كيلو هرتز Z). الجمع بين موضع تركيز الليزر ووقت وصول فوتون تمكن موقف 3D للجسيمات سرعة الحصول عليها حتى في معدلات العد فوتون منخفضة. 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة محركات تركيز الليزر في فارس جولة نمط39 مع حجم مربع من 1 x 1 ميكرومتر في الطائرة X-Y وعدسة العلامة ينتقل تركيز الليزر في اتجاه محوري مع مجموعة من 2-4 ميكرون. يتم الحصول على موقف 3D الجسيمات مع موضع أمثل تقدير خوارزمية29،40 في 3D. وتجري السيطرة 3D تتحرك بشكل حيوي ليزر بقعة، فوتون عد من الانهيار الضوئي (APD) وحساب موضع الجسيمات في الوقت الحقيقي، والمرحلة كهرضغطية التغذية المرتدة، وتسجيل البيانات في صفيف حقل بوابة القابلة لبرمجة (FPGA).في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية بناء مجهر 3D-ديبلوت خطوة بخطوة، بما في ذلك محاذاة البصري، المعايرة مع جزيئات ثابتة، وأخيراً مجانية تتبع الجسيمات. كدليل، تم تعقبها الخرز الفلورسنت 110 في شمال البحر الأبيض المتوسط بشكل مستمر في الماء لمدة دقيقة في كل مرة.

الأسلوب الموصوفة هنا اختيار مثالي لأي تطبيق حيث أنه المطلوب لترصد باستمرار تحقيق فلورسنت تتحرك بسرعة في ضوء المستويات المنخفضة، بما في ذلك الفيروسات والجسيمات النانوية وحويصلات مثل اندوسوميس. وعلى النقيض من الأساليب السابقة، هناك فقط الإثارة واحد ومسار كشف واحد، جعل المحاذاة والصيانة مباشرة. وعلاوة على ذلك، يتيح مجال كبير في الكشف عن هذا المجهر لالتقاط بسهولة بسرعة نزع فتيل الجسيمات، بينما القدرة على تتبع المستويات إشارة منخفضة (وصولاً إلى 10 كيلوهرتز) يجعل هذا الأسلوب المثالي لتطبيقات الإضاءة المنخفضة29.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد التخطيط والتنسيق

  1. التثبيت و collimation من الإثارة التعقب بالليزر
    1. إلصاق الليزر للجدول البصرية باستخدام جبل الصنع. الجبل لوحة ألومنيوم بسيطة مع تصاعد الثقوب للرأس الليزر والجدول البصرية. ينبغي إيلاء جبل معدنية للاستقرار وتبديد الحرارة بشدة الليزر. لهذا العمل، واستخدام ليزر حالة صلبة 488 نانومتر للإضاءة (الشكل 1)، على الرغم من أن يمكن تحديد الطول الموجي تتناسب مع فلوروفوري خاصة أو تجربة. عامل حاسم هو أن الطول الموجي الليزر تناسب نطاق العامل 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة، التي تتحدد أساسا بلوحة موجه بين انحراف اثنين (الشكل 1: W2). يمكن أن تثير 488 نانومتر الليزر فعالية الأخضر أو الأصفر فلوري البروتين (التجارة والنقل/يفب)، التي هي العلامات الفلورية الشائعة في تجارب الخلايا الحية.
    2. ضبط ارتفاع شعاع الليزر والاتجاه باستخدام زوج من المرايا كهرونافذية (الشكل 1: M). تأكد من شعاع الليزر موازية للجدول البصرية وضبط ذلك بارتفاع مناسب.
      ملاحظة: الارتفاع ينبغي اختيارها بالاعتماد على منصة المجهر. ينبغي الإبقاء على هذا الارتفاع لجميع المرايا اللاحقة المستخدمة في هذا البروتوكول، على الرغم من أنه لم يتم ذكر صراحة.
    3. كوليماتي الشعاع مع زوج من العدسات (الشكل 1: L1 و L2). ينبغي أن تكون أطوال العدسات اختيرت بعناية لتجنب بقعة ليزر يتم قص بواسطة فتحه 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة. ويتضح القطع بحدوث تغيير في شكل شعاع الليزر بعد مرورها 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة. نوعية collimation هنا مهم جداً لأنه سيتم تفصيل الانحرافات بالعدسات اللاحقة، وأي تباين سوف يتدهور أداء انحراف 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة. ومن الناحية المثالية، كوليماتي الشعاع بتركيز شعاع بنقطة على الأقل 20 متر.
  2. مكان ثقب (الشكل 1: الأس الهيدروجيني) من الحجم المناسب في تركيز العدسة collimation الأول (الشكل 1: L1).
    1. اختر ثقب حجم مناسب. ويمكن اختيار حجم الثقب استناداً إلى الحساب التالي:
      figure-protocol-2032
      حيث λ هو الطول الموجي لليزر، f هو البعد البؤري للعدسة الأولى، وهو د قطرها شعاع الإدخال.
    2. جبل الثقب في مرحلة ترجمة 3D حتى أنه يمكن وضع التحديد في تركيز العدسة collimation الأولى.
    3. ضبط موضع الثقب. ضع عداد طاقة ليزر بعد الثقب وضبط موضع الثقب في XYZ لتعظيم قراءات عداد الطاقة. إذا لوحظ عصابة حيود، منعه مع قزحية المعروضة في 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة.
  3. تثبيت المستقطب Glan-تومسون
    1. وضع المستقطب Glan-تومسون (الشكل 1: سباق الجائزة الكبرى) بعد العدسة collimation الثانية (الشكل 1: L2) لتنظيف استقطاب شعاع الليزر. قم بتدوير المستقطب للبحث عن الإرسال القصوى مع مقياس الطاقة.
  4. تركيب اودس
    1. استخدام اودس 2 (الشكل 1: EOD1 & EOD2) لتشتيت الليزر في الاتجاهين X و Y. قم بتكبير الإرسال الليزر بضبط ياو والملعب، وارتفاع كل التخلص من الذخائر المتفجرة.
    2. قم بمحاذاة اودس اثنين فيما يتعلق ببعضها البعض باستخدام علامة المحاذاة توفيرها من قبل الشركة المصنعة على جانب كل منحرف.
    3. تطبيق نمط اختبار إلى وحدة تحكم 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة لفحص إخراج التخلص من الذخائر المتفجرة. هذا يمكن أن يكون أما جولة الفارس (الشكل 2) عبر FPGA الموصوفة أدناه أو موجه جيبية بسيطة يوفرها مولد دالة. الحصول على أفضل أداء، الانحراف بكل منحرف بشكل مواز لاتجاه X أو Y نانوبوسيتيونير بيزو. هذا الاتجاه تمليه الاتجاه الزاوي لانحراف حول محور انتقال العدوى. لتدوير اتجاه انحراف دون تحريك في 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة، ضع منشور حمامة بعد 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة محاذاة محاور انحراف للمحاور نانوبوسيتيونير بيزو.
  5. تركيب لوحة نصف الموجه
    1. ضع لوحة نصف الموجه (الشكل 1: W1) بين المستقطب Glan-تومسون (الشكل 1: سباق الجائزة الكبرى) وشعاع 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة محاذاة الليزر واردة الاستقطاب مع محاور انحراف 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة. ضع عدسة طويلة المحورية (300 ملم) بعد 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة ومكان كاميرا سكموس في تركيز الليزر. وبعد ذلك، قم بتشغيل في 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة لتوليد جولة الفارس المبينة أدناه (الشكل 2). قم بتدوير اللوحة نصف الموجه حتى يحتفل توزيع ليزر مربعة بالتساوي على الكاميرا.
  6. تثبيت شعاع أنفاق عدسة زوج وزوج عدسة التتابع
    1. وضع زوج من العدسات (الشكل 1: L3 و L4) بعد 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة لتوسيع شعاع لملء الفتحة الخلفية للعدسة الهدف (الشكل 1: را) وزوج آخر من العدسات (الشكل 1: L5 و L6) إلى ترحيل المستوى البؤري لهدف المجهر. تأكد من ترك مساحة كافية بين هذه اثنين من الأزواج من العدسات كما سيتم تثبيت العدسة العلامة بينهما في خطوة لاحقة.
  7. تثبيت عامل تصفية مزدوج اللون، والخائن شعاع 10/90، تركز العدسة، APD، الهدف العدسة، وتصفية الانبعاثات الأسفار لإكمال المسار الكشف.
    1. تثبيت عامل التصفية مزدوج اللون (الشكل 1: DC) ليعكس الليزر نحو الهدف العدسة. قم بمحاذاة الليزر للذهاب مباشرة من خلال مركز العدسة الهدف باستخدام قزحيات اثنين في أعلى وأسفل من أنبوب عدسة طويلة.
    2. تثبيت تقسيم شعاع 10/90 (الشكل 1: بكالوريوس) التي ينعكس فيها 10% ضوء للتصوير كاميرا سكموس (الموصوفة أدناه) و 90% من يمر بالرابطة لتتبع.
    3. محاذاة المحيط الهادئ. وتركز الليزر على ساترة بالعدسة الهدف. استخدام الانعكاس من ساترة لمحاذاة العناصر جميع المتلقين للمعلومات بوضع ساترة في التركيز الموضوعي والتحقق من كثافة قراءات APD. بعد التقسيم شعاع، تثبيت APD تركز العدسة (الشكل 1: L7) متبوعاً الرابطة في مرحلة ترجمة 3D. ضع العدسة مثل انعكاس الليزر من الهدف يمر عبر مركز العدسة.
يمكن أن يكون الأمثل موقف APD بضبط موضع ثلاثي الأبعاد إلى أقصى حد الكثافة من انعكاس الليزر على ساترة. ويتمثل موقف APD في الموضع الأمثل عند تحرك من موقف الكاشف في أي اتجاه انخفاض الكثافة.
  • تثبيت عامل تصفية انبعاثات fluorescence الفلترات (الشكل 1: و) قبل التقسيم شعاع لإزالة الضوء المنعكس ومتناثرة.
  • تركيب العدسة العلامة
    1. ضع علامة العدسة بين أزواج اثنين من العدسات (بين الرقم 1: L4 و L5) كما ذكر قبل وهو مبين في الشكل 1. ضبط ياو، الملعب، والارتفاع، والموضع الأفقي مثل الشعاع يمر عمودياً من خلال عدسة مركز الوسم.

    • 2-نموذج إعداد.

    1. إعداد الجسيمات الثابتة
      1. 190 نانومتر الخرز الفلورية إلى تمييع ~8 5 × 10 حبات/مل في برنامج تلفزيوني. إضافة 400 ميليلتر الخرز الحل إلى ساترة وجبل على حامل عينة المرحلة كهرضغطية (حجم الخرز سيتوقف على صاحب العينة؛ قطر الدائرة حامل العينة المستخدمة هنا 18 ملم). يتسبب برنامج تلفزيوني الخرز المستخدمة هنا، الجسيمات بإيداع ساترة.
    2. إعداد الجسيمات تتحرك مجاناً
      1. تمييع 110 الخرز الفلورسنت نانومتر إلى ~8 5 × 10 حبات/مل مع المياه دي. إضافة 400 ميليلتر الخرز محلول على ساترة وجبل على صاحب العينة لمرحلة كهرضغطية.

    3-تحسين تتبع المعلمات

    1. مسح النقطية الثابتة الجسيمات
      1. وضع نموذج جسيمات ثابتة في المجهر.
      2. قم بتشغيل الليزر وتحكم ميكروبوسيتيونير وتحكم نانوبوسيتيونير بيزو، علامة عدسة وحدة تحكم وتحكم التخلص من الذخائر المتفجرة. علما أن الأمر ليس حاسما. قم بتشغيل نانوبوسيتيونير بيزو في حلقة مغلقة.
      3. خطوط المسح مسح العينة باستخدام مسح برمجيات برنامج مخصص (S3 الرقم، البرمجيات المتاحة عند الطلب من المؤلفين)، الذي يدفع في 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة في جولة فارس (الشكل 2)، يجمع التهم الموجهة إليه من APD، محركات الأقراص في بيزو XYZ نانوبوسيتيونير، ويقوم بعملية حسابية موقف (S2 الشكل). حجم الخطوة هو 40 نانومتر ونطاق المسح هو 2 ميكرومتر.
        1. وضع ساترة في التركيز الهدف، إزالة عامل التصفية الانبعاثات الأسفار واستخدام انعكاس الليزر من ساترة لزيادة كثافة إشارة كدالة لموقف زي ميكروبوسيتيونير. بعد وضع العينة في المستوى البؤري، ضع مرة أخرى تصفية الانبعاثات الأسفار.
        2. فتح برنامج المسح. تعيين نطاق المسح وحجم الخطوة بكتابة الرقم في 'ابدأ'، 'الانتهاء' و 'خطوة'. أولاً تعيين نطاق المسح الكبيرة وحجم خطوة لتحديد مكان جسيم (مثلاً، 10 × 10 ميكرون النطاق مع حجم الخطوة شمال البحر الأبيض المتوسط 200). بعد العثور الجسيمات، تقليص نطاق المسح وتقليل حجم الخطوة (مثلاً، 2 × 2 ميكرومتر النطاق مع حجم الخطوة nm 100). انقر فوق الزر 'مسح' لإجراء فحص نقطية ثلاثية الأبعاد لإيجاد تركيز الفلورسنت.
    2. إعدادات العدسة العلامة (انظر الشكل 3)
      1. انقر فوق برنامج السيطرة عدسة العلامة. انقر فوق 'اتصال'، 'السلطة في' تسلسلياً.
      2. لتغيير في مرحلة الإخراج من إشارات الزناد، من الضروري تغيير وضع الزناد الإخراج. أولاً قم بتغيير الوضع من 'RGB' إلى 'مولتيبلاني' وثم تغييره مرة أخرى. الآن يمكن أن تكون المرحلة تغيير (الشكل 3b).
      3. تعيين مرحلة الإخراج لتكون 270 ° 0 ° و 90 °. بينما يمكن استخدام أي من المراحل الثلاث التي تغطي مساحة المرحلة، تم العثور على هؤلاء الثلاثة للعمل كذلك تجريبية (الشكل 3 ج).
      4. حدد الإعداد التردد هرتز 68,500.
      5. للبحث عن الترددات الأمثل من الضروري غالباً تغيير نطاق البحث التردد. انقر فوق 'خيارات متقدمة'، 'الإعداد'. تغيير ' ماكس. Freq(Hz) ' العمود 0 من 70,000 هرتز هرتز 71,500. ويمكن تعديل هذا لنطاق الترددات أيا كان من المناسب. انقر فوق 'حفظ المعايرة'، 'خروج المعايرة' (3d الشكل).
      6. لإجراء المعايرة الجديدة فعالة، التبديل الرنين إلى تردد آخر (على سبيل المثال، 189,150 هرتز) وتحولت بعد ذلك إلى الإعداد التردد هرتز 68,500 (رقم 3e).
      7. تغيير السعة تدريجيا إلى 35%. انقر فوق 'لوك الرنين'. بعد التواتر مؤمن، انقر فوق '"إلغاء تأمين الرنين"' (رقم 3e). عدسة العلامة جاهز للاستخدام الآن.
      8. معايرة، وتغيير المعلمات التي يتم استخدامها في التقدير جعل الموضع المقدر مساو للموقف الحقيقي، كما هو مبين في الشكل 4e، واو إدخال نطاق المسح x، y، و z وثم انقر فوق 'مسح' زر لمسح العينة في XYZ للانتقال الجسيمات من خلال بقعة الليزر تتحرك. موقف الجسيمات كما أنه يتم مسحها ضوئياً عن طريق تركيز الليزر يجب أن يتفق مع موقف الجسيمات التقديرية تحددها الحلقة تقدير الموقف (S1 الشكل). العلاقة بين الموضع المقدر والموقف الحقيقي (الشكل 4 د) يمكن أن تستخلص من الصور الموضع المقدر (4f الشكل). إذا لم تتفق ومواقف، قم بضبط القيم لليزر الموضع (جك) المستخدمة في تقدير الموقف التكرار الحلقي (S1 الشكل).
      9. قم بمحاذاة العلامة العدسة
        1. عند إيقاف تشغيل وحدة تحكم عدسة الوسم، النقطية تفحص الصور الجسيمات (الموصوفة أدناه) المتخذة قبل تثبيت العدسة العلامة وبعد تثبيت علامة العدسة يجب أن تبدو متطابقة. بعد ذلك، تنفيذ مكدس الجسيمات الفلورية Z المسح بتحريك الهدف مع نانوبوسيتيونير z لضبط الموضع وزاوية العدسة العلامة (الشكل 4). ضبط موضع العدسة العلامة حتى يكون هناك لا الانجراف في الصور الجسيمات في الطائرة XY على طول اتجاه Z، الذي يتحقق عندما يكون هناك لا تغيير في موقف س وص للجسيمات كدالة للموقف Z (الشكل 4 د). نظام تتبع جاهز للاستخدام بعد المحاذاة للعدسة العلامة.
    3. تركيب كاميرا سكموس لرصد الجسيمات
      1. قم بتثبيت كاميرا سكموس لتصور الجسيمات في حين أنهم يجري تعقب. تثبيت في سكموس فقط بعد أن تم تثبيتها جميع مكونات نظام التتبع والأمثل.
    تحميل نموذج جسيمات فلورية ثابتة على المجهر وقم بتشغيل برنامج التعقب لقفل الجسيمات واحد في وحدة التنسيق الموضوعي. ثم قم بتثبيت العدسة البعد البؤري 100 مم (الشكل 1: L8) وسكموس. ضبط موضع سكموس حيث أن صورة الجسيمات يتركز على الفور أصغر وأذكى.

    4. في الوقت الحقيقي تتبع 3D بحرية نشر جسيمات نانوية

    1. وضعت 110 نيوتن متر حرة تتحرك الجسيمات العينة في المجهر.
    2. قم بتشغيل الليزر والصغرى-ميضعه وحدة تحكم وتحكم نانوبوسيتيونير بيزو، علامة عدسة وحدة تحكم وتحكم التخلص من الذخائر المتفجرة. قم بتشغيل نانوبوسيتيونير بيزو في حلقة مفتوحة. تعيين البرامج عدسة العلامة وفقا للخطوة 3، 2.
    3. فتح وتشغيل برامج التتبع (متاح عند الطلب من المؤلفين). تعيين الموضع تقدير المعلمات إلى قيمها الأمثل، الذي تم العثور عليه في الباب 3.
    4. وضع ساترة في التركيز الهدف، إزالة عامل التصفية الانبعاثات الأسفار واستخدام انعكاس الليزر من ساترة لزيادة كثافة إشارة كدالة لموقف زي ميكروبوسيتيونير. بعد العثور ساترة، زيادة تركيز موقف ميكرومتر 15 تركيز الليزر بعيداً ساترة وإلى الحل. مكان العودة تصفية الانبعاثات الأسفار.
    5. تعيين ثوابت تحكم لا يتجزأ. يمكن تعيين بثوابت عناصر التحكم لا يتجزأ بدءاً من قيمة منخفضة وزيادة ببطء حتى يمكن رؤية التذبذبات في قراءات الموقف الجسيمات. عندما يلاحظ ذبذبات، تعيين بثوابت عناصر التحكم لا يتجزأ إلى 80% القيمة التي تسبب الذبذبات. القيم النموذجية ستكون حوالي 0.012 لتخطيط س ص 'مكاسب لا يتجزأ' و 0.004 لض 'مكسب لا يتجزأ'.
    6. تعيين عتبات تتبع في 'المسار عتبة' و 'المسار الحد الأدنى' وبدء التجربة التعقب بواسطة النقر فوق 'بحث' و 'المسار التلقائي'. يتم تعيين الحد الأدنى لإنهاء تتبع أعلى قليلاً من مستوى الخلفية وعتبة أحداث التتبع أعلى بحوالي مرتين من الخلفية. هنا، هو الحد الأدنى لتحريك تتبع 3 كيلو هرتز وهو الحد الأدنى لإنهاء المسار 1.5 كيلو هرتز.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    النتائج

    الجسيمات الثابتة المسح الضوئي (الشكل 4) ونشرها بحرية 110 نانومتر الفلورسنت الجسيمات تتبع (الشكل 5) أجريت في أعقاب البروتوكول أعلاه. وأجرى المسح الجسيمات بتحريك الفوتونات نانوبوسيتيونير وبن كهرضغطية بينما في نفس الوقت حساب الجسيمات يقدر الم...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    على الرغم من أن العديد من أصناف الجسيمات واحدة 3D تتبع أساليب ظهرت في السنوات الأخيرة، تتبع في الوقت الحقيقي قوية لنشر عالية السرعة 3D أسعار العد فوتون منخفضة مع إعداد بسيطة لا تزال تشكل تحديا، مما يحد من تطبيقه على الأهمية البيولوجية مشاكل. وصف الأسلوب 3D-ديبلوت في هذه عناوين بروتوكول هذه ال...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

    Acknowledgements

    وأيد هذا العمل بالمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة "المعاهد الوطنية للصحة" تحت رقم جائزة R35GM124868 وجامعة ديوك.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    NameCompanyCatalog NumberComments
    2D Electro-optic Deflector ConOpticsM310A2 required
    Power supply for EODConOptics412Converts FPGA ouput to high voltage for EOD
    TAG  LensTAG OpticsTAG 2.0Used to deflect laser along axial direction
    XY piezoelectric nanopositionerMadCity LabsNano-PDQ275HSUsed for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in 
    Z piezoelectric nanoposiitonerMadCity LabsNano-OP65HSUsed to move the objective lens to follow the diffusing particle
    MicropositionerMadCity LabsMicroDriveUsed to coarsely position sample and evaluate
    Objective LensZeissPlanApoHigh numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss
    sCMOS cameraPCOpco.edge 4.2Used to monitor the particle's position
    APDExcelitasSPCM-ARQH-15Lower dark counts beneficial
    Field programmable gate arrayNational InstrumentsNI-7852r
    SoftwareNational InstrumentsLabVIEW
    Tracking excitation laserJDSUFCD488-30
    LensThorLabsAC254-150-A-MLL1
    LensThorLabsAC254-200-A-MLL2
    PinholeThorLabsP75SPH
    Glan-Thompson PolarizerThorLabsGTH5-AGT
    Half-wave plateThorLabsWPH05M-488WP
    LensThorLabsAC254-75-A-MLL3
    LensThorLabsAC254-250-A-MLL4
    LensThorLabsAC254-200-A-MLL5
    LensThorLabsAC254-200-A-MLL6
    Dichroic MirrorChromaZT405/488/561/640rpcDC
    Fluorescence Emission FilterChromaD535/40mF
    10/90 beamsplitterChroma21012BS
    PBSSigmaD8537
    190 nm fluorescent nanoparticlesBangs laboratoriesFC02F/9942
    110 nm fluorescent nanoparticlesBangs laboratoriesFC02F/10617
    CoverslipFisher Scientific12-545A
    PowermeterThorlabsPM100D
    CMOSThorlabsDCC1545M
    IrisThorlabsSM1D12D
    MicroscopeMad City LabsRM21

    References

    1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
    2. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
    3. Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
    4. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
    5. Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
    6. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
    7. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat. Methods. 5 (5), 417(2008).
    8. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044(2011).
    9. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods. 6 (5), 339(2009).
    10. Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
    11. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
    12. Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED). Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).
    13. Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).
    14. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
    15. Welsher, K., Yang, H. Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles. Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).
    16. Welsher, K., Yang, H. Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy. Faraday Discuss. 184 (0), 359-379 (2015).
    17. Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking. J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).
    18. Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles. Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).
    19. Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts. Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901(2006).
    20. Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions. ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).
    21. Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells. Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).
    22. Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. Three-dimensional tracking of individual quantum dots. Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).
    23. McHale, K., Mabuchi, H. Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope. Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).
    24. McHale, K., Mabuchi, H. Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm. J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).
    25. McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking. Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).
    26. Juette, M. F., Bewersdorf, J. Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution. Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).
    27. Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bräuchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking. ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).
    28. Perillo, E. P., Liu, Y. -L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -K., Hung, M. -C., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, (2015).
    29. Hou, S., Lang, X., Welsher, K. Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot. Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).
    30. Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).
    31. Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions. Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).
    32. Lee, H. -lD., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision. Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701(2012).
    33. Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).
    34. Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzanò, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges. Optica. 4 (3), 367-373 (2017).
    35. Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynnå, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606(2017).
    36. Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing. Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).
    37. Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics. BIOMEDO. 17 (5), (2012).
    38. Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens. Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).
    39. Wang, Q., Moerner, W. E. Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap. Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).
    40. Fields, A. P., Cohen, A. E. Optimal tracking of a Brownian particle. Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).
    41. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Explore More Articles

    131 3D

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Privacy

    Terms of Use

    Policies

    Contact Us

    Recommend to library

    JoVE NEWSLETTERS

    Research

    Education

    Authors

    Librarians

    ABOUT JoVE

    Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved