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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieser Protokolldetails, den Bau und Betrieb eines Echtzeit-3D Einzelkorn Tracking-Mikroskops in der Lage Tracking nanoskalige fluoreszierende Sonden bei hohen diffusiven Geschwindigkeiten und geringen Photon Zählraten.

Zusammenfassung

Echtzeit-dreidimensionale Einzelkorn tracking (RT-3D-SPT) hat das Potenzial, schnell, 3D Prozesse in zellulären Systemen beleuchten. Obwohl verschiedene RT-3D-SPT-Methoden in den letzten Jahren vorgeschlagen haben, bleibt high-Speed-tracking 3D diffundierende Teilchen bei niedrigen Photon Zählraten eine Herausforderung. Darüber hinaus sind RT-3D-SPT-Setups in der Regel komplex und schwierig zu implementieren, Begrenzung ihrer weitverbreitete Anwendung auf biologische Probleme. Dieses Protokoll stellt ein RT-3D-SPT-System namens 3D dynamische Photon Lokalisierung Tracking (3D-DyPLoT), die Partikel mit hoher diffusiven Geschwindigkeit (bis zu 20 µm2/s) verfolgen können bei niedrigen Photon Zählraten (bis 10 kHz). 3D-DyPLoT beschäftigt einen 2D elektrooptischen Deflektor (2D-EOD) und eine einstellbaren akustischen Farbverlauf (TAG) Objektiv zu fahren, die eine einzige konzentrierte sich laser-Spot dynamisch in 3D. In Kombination mit einer optimierten Position Schätzung Algorithmus, kann 3D-DyPLoT auf einzelne Partikel mit hoher Verfolgungsgeschwindigkeit und hohe Lokalisierung Präzision sperren. Aufgrund der einheitlichen Erregung und einzelne Erkennung Pfad Layout ist 3D-DyPLoT robust und einfach einzurichten. Dieses Protokoll beschreibt die 3D-DyPLoT Schritt für Schritt aufbauen. Erstens ist das optische Layout beschrieben. Als nächstes wird das System kalibriert und optimiert durch Raster eine 190 nm fluoreszierende Perle mit piezoelektrischen Nanopositionierer scannen. Schließlich, um Echtzeit-3D tracking-Fähigkeit zu demonstrieren, werden 110 nm fluoreszierenden Perlen im Wasser verfolgt.

Einleitung

Die Entstehung der modernen bildgebenden Verfahren hat ein Fenster um zu sehen, je mehr detaillierte Struktur der zelluläre Phänomene bis hin zum molekularer Ebene geöffnet. Methoden wie stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm)1,2,3, Foto-aktivierte Lokalisierung Mikroskopie (PALM)4,5,6,7 , strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM)8,9,10,11, und stimulierte Emission Depletion-Mikroskopie (STED)12,13, 14 gegangen weit jenseits der Beugungsgrenze, noch nie dagewesene Detail in die Struktur und Funktion von lebenden Zellen zu liefern. Voll zu verstehen, wie diese Systeme Verhalten erfordert jedoch dynamische Informationen sowie Strukturinformationen. Die oben aufgeführten Höchstauflösung Methoden beinhalten einen Kompromiss zwischen Ortsauflösung und zeitlicher Auflösung, Begrenzung der zeitlichen Präzisions mit der dynamische Prozessen sondiert werden können. Eine Methode, die liefert hochpräzise räumliche und zeitliche Auflösung ist RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Wir unterscheiden hier zwischen traditionellen 3D-SPT30 und RT-3D-SPT. Traditional 3D-SPT erfordert lediglich eine Zeitreihe von dreidimensionalen Bilddaten (die entweder mit einem confocal Mikroskop oder einem Epifluoreszenz Mikroskop erworben werden können Angesichts der richtigen Konfiguration). In traditionellen 3D-SPT sind die Koordinaten des Partikels nach der Datenerfassung entschlossen durch Auffinden der Partikel in jedem Bildstapel und die Standorte in aufeinander folgenden Bänden zu verketten, eine Flugbahn zu schaffen. Für diese Methoden ist die ultimative zeitliche Auflösung durch die volumetrische Bildverarbeitung Rate bestimmt. Für konfokale Mikroskope ist dies leicht in der Größenordnung von Sekunden bis zu zehn Sekunden. Für Epifluoreszenz Methoden, wobei der Strahlengang so manipuliert ist, dass die axiale Lage Informationen extrahiert werden kann, ist die zeitliche Auflösung der Kamera Belichtung oder Auslesen zeitlich begrenzt. Diese Epifluorescent-Methoden sind begrenzt im Bereich über dem axiale Informationen gesammelt werden kann, obwohl die jüngsten Fortschritte bei Fourier Flugzeug Phase Masken Design und adaptive Optik weitet diese reicht bis zu 10 µm oder mehr31,32 , 33 , 34.

Im Gegensatz dazu setzt RT-3D-SPT nicht auf einen 3D-Bild Stapel zu erwerben und die Suche nach Partikel nach der Tat. Stattdessen Standort in Echtzeit Informationen über einzelne Punktmelder extrahiert und Feedback werden effektiv "das Teilchen im fokalen Volumen der Objektivlinse durch den Einsatz von piezoelektrischen Bühne Highspeed sperren". Dies ermöglicht kontinuierliche Messung der Position der Partikel begrenzt nur durch wie viele Photonen gesammelt werden können. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode spektrale Verhör des Partikels, wie es über große Entfernungen bewegt. RT-3D-SPT Kräfte wirksam funktioniert ähnlich wie eine Kraft-freie optische Falle für nanoskalige Objekte, wobei die Partikel kontinuierlich sondiert und in Echtzeit ohne die Notwendigkeit für große Laserleistungen oder optische gemessen. Angesichts der Tatsache, dass RT-3D-SPT für fortlaufende Befragung schnell diffusiven Objekte (bis zu 20 µm2/s)25,29 in drei Dimensionen bei niedrigen Photon zählen Preise20,29Mittel bietet, 35, es soll ein Fenster in schnell oder vorübergehende biologische Prozesse wie intrazelluläre Frachtverkehr, Ligand-Rezeptor-Bindung und die extrazelluläre Dynamik der einzelnen Virionen. Zu diesem Punkt wurde jedoch die Anwendung der RT-3D-SPT beschränkt sich auf die wenigen Gruppen arbeiten, um diese Technologie zu fördern.

Eine Barriere ist die Komplexität des optischen Layouts erforderlich durch RT-3D-SPT-Methoden, die verschieden sind. Für die meisten Methoden ist die optische Rückmeldung durch einen piezoelektrischen Bühne zur Verfügung gestellt. Wie die Teilchen macht kleine Bewegungen in X, Y oder Z, Anzeigen von Einzelpunkt-Detektoren sind in Fehlerfunktionen konvertiert und gefüttert wiederum drehen bewegt sich auf einem piezoelektrischen Nanopositionierer High-Speed-die Probe, die Partikelbewegung effektiv entgegenzuwirken Sperren sie im Ort bezogen auf das Objektiv. Zur Messung von kleiner positioneller Bewegungen in X, Y und Z, entweder mehrere Detektoren (4 oder 5 je nach Implementierung)15,18,21 oder mehrere Erregung Flecken (2-4, desto geringer die angewendet werden, kann wenn eine Lock-in-Verstärker dient zur extrahieren Sie X und Y-Position mit einer rotierenden laser-spot)25,28 gelten. Die Überlappung dieser mehrere Erkennung und Emission Flecken erschweren die Systeme zu richten und zu pflegen.

Hier präsentieren wir eine High-Speed-Ziel gesperrt 3D-SPT-Methode mit einem vereinfachten optischen Design 3D-DyPLoT29genannt. 3D-DyPLoT verwendet ein 2D-EOD und ein TAG Objektiv36,37,38 , um dynamisch ein fokussierte Laserspot durch das Objektiv Brennweite Volumen mit einer hohen Rate (50 kHz XY, 70 kHz Z) bewegen. Kombination von Laser-Fokus-Position und der Photon-Ankunftszeit ermöglicht 3D Position der Partikel schnell auch bei niedrigen Photon Zählraten eingeholt werden. 2D-EOD treibt Laserfokus eines Ritters Tour Muster39 mit einer quadratischen Größe von 1 x 1 µm in der XY-Ebene und die TAG-Linse bewegt Laserfokus in axialer Richtung mit einer Reichweite von 2-4 µm. Die 3D Partikel-Position wird durch eine optimierte Position Schätzung Algorithmus29,40 in 3D erreicht. Die Kontrolle über das 3D dynamisch bewegten Laser spot, Photon beginnend mit der Lawine Fotodiode (APD), Echtzeit-Partikel Positionsberechnung, piezoelektrische Bühne Feedback und Datenaufzeichnung erfolgt auf einem Feld programmierbare Gate Array (FPGA).In diesem Protokoll haben wir beschrieben, wie Sie Schritt für Schritt, einschließlich der optischen Achse, Kalibrierung mit festen Partikeln, 3D-DyPLoT Mikroskop bauen und endlich frei Particle Tracking. Als eine Demonstration wurden 110 nm fluoreszierenden Perlen im Wasser für Minuten hintereinander kontinuierlich verfolgt.

Die hier beschriebene Methode ist eine ideale Wahl für alle Anwendungen wo ist es wünschenswert, eine schnell bewegendes fluoreszierende Sonde bei wenig Licht, einschließlich Viren, Nanopartikeln und Vesikel wie Endosomen kontinuierlich zu überwachen. Im Gegensatz zu bisherigen Methoden gibt es nur eine einzige Anregung und einzelne Erkennung Weg, so dass Ausrichtung und Wartung einfach. Darüber hinaus ermöglicht der großen Erfassungsbereich dieses Mikroskop leicht schnell diffundierende Teilchen, während die Fähigkeit, bei niedrigen Signalpegeln (bis 10 kHz) verfolgen diese Methode ideal für Low-Light Anwendungen29macht abholen.

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Protokoll

1. setup Layout und Ausrichtung

  1. Laser-Installation und Kollimation der Tracking-Anregung
    1. Befestigen Sie den Laser auf die optischen Tisch mit einer selbstgebauten Halterung. Die Halterung ist eine einfache Aluminium-Platte mit Befestigungsbohrungen für den Laserkopf und optischen Tisch. Der Laser ist fest eine Metallfassung für Stabilität und Wärmeableitung beizufügen. Verwenden Sie für diese Arbeit 488 nm Festkörperlaser für Beleuchtung (Abbildung 1), obwohl die Wellenlänge ausgewählt werden kann, entsprechen einem bestimmten Fluorophore oder experimentieren. Ein kritischer Faktor ist, dass die Wellenlänge des Lasers den 2D-EOD Arbeitsbereich passen bestimmt in erster Linie durch die Wellenlängen-Platte zwischen die zwei Deflektoren (Abbildung 1: W2). 488 nm Laser kann das grüne oder gelbe fluoreszierende Protein (GFP/YFP), die gemeinsame fluoreszierende Tags in live Zellexperimente sind effektiv begeistern.
    2. Der Laserstrahl Höhe und Richtung mit einer dielektrischen Spiegel anpassen (Abbildung 1: M). Stellen Sie sicher, dass der Laserstrahl ist parallel zum optischen Tisch und auf eine passende Höhe einstellen.
      Hinweis: Sollte die Höhe anhand der Mikroskop-Plattform gewählt werden. Diese Höhe sollte für alle nachfolgenden Spiegel in diesem Protokoll verwendeten beibehalten werden, obwohl es nicht explizit angegeben werden.
    3. Lassen Sie den Strahl mit einem Paar Linsen (Abbildung 1: L1 und L2). Die Brennweiten der Linsen sollte sorgfältig ausgewählt werden, um den Laserpunkt abgeschnitten durch die Blende von der 2D-EOD zu vermeiden. Clipping ist offensichtlich durch eine Änderung in der Laser-Strahl-Form nach dem Durchlaufen der 2D-EOD. Die Qualität der Kollimation hier ist sehr wichtig, weil Aberrationen durch nachfolgende Linsen verstärkt werden und jede Abweichung wird die Leistung der 2D-EOD Durchbiegung verschlechtern. Im Idealfall lassen Sie den Strahl durch Fokussierung des Strahls zu einem Punkt mindestens 20 m entfernt.
  2. Legen Sie eine Lochblende (Abbildung 1: PH) der entsprechenden Größe im Mittelpunkt der ersten Kollimation Linse (Abbildung 1: L1).
    1. Wählen Sie eine entsprechend dimensionierte Lochkamera. Die Lochkamera Größe kann anhand der folgenden Berechnung gewählt werden:
      figure-protocol-2601
      Wo λ ist die Wellenlänge des Lasers, f ist die Brennweite der ersten Linse, und D ist der Eingang Strahldurchmesser.
    2. Montieren Sie die Lochkamera auf 3D Verschiebetisch, so dass es gerade im Mittelpunkt der ersten Kollimation Linse platziert werden kann.
    3. Passen Sie die Position für das Loch. Einen Laser-Leistungsmesser nach der Lochkamera und passen Sie die Position der Lochkamera in XYZ, das macht Zähler auslesen zu maximieren. Wenn ein Beugung Ring beobachtet wird, mit einer Iris platziert, bevor die 2D-EOD blockieren.
  3. Installation von Glan-Thompson-Polarisator
    1. Setzen Sie den Glan-Thompson-Polarisator (Abbildung 1: GP) nach der zweiten Linse Kollimation (Abbildung 1: L2) um die Polarisation des Laserstrahls zu reinigen. Drehen Sie den Polarisator um maximale Kraftübertragung mit dem Leistungsmesser zu finden.
  4. Installation von EOD
    1. Verwenden Sie 2 EOD (Abbildung 1: EOD1 & EOD2), den Laser in X- und Y-Richtung abzulenken. Maximieren Sie die Laser-Übertragung durch Anpassen der Gier, Neigung und Höhe des jedem EOD.
    2. Richten Sie die zwei EODs zueinander mit der Ausrichtung Markierung des Herstellers auf der Seite jedes Deflektor.
    3. Beantragen Sie ein Testmuster an die Steuerung des 2D-EOD, überprüfen Sie die Ausgabe der EOD. Dies kann der Ritter Tour (Abbildung 2) über die nachfolgend beschriebenen FPGA oder eine einfache Sinuswelle von einem Funktionsgenerator zur Verfügung gestellt. Für eine optimale Leistung sollte der Ablenkung durch jede Deflektor parallel zur X oder Y-Richtung des Piezo-Nanopositionierer sein. Diese Richtung wird durch die Winkelrichtung die Deflektoren um die Getriebe-Achse bestimmt. Um die Durchbiegung Richtung drehen ohne bewegliche 2D-EOD, platzieren Sie eine Taube Prism nach 2D-EOD die Durchbiegung Achsen zu den Piezo Nanopositionierer Achsen ausrichten.
  5. Installation von Halbwellen-Platte
    1. Legen Sie eine Halbwellen-Platte (Abbildung 1: W1) zwischen den Glan-Thompson-Polarisator (Abbildung 1: GP) und 2D-EOD ausrichten den eingehenden Laser beam Polarisation mit den Achsen der Durchbiegung des 2D-EOD. Eine langen Brennweite Objektiv (300 mm) nach der 2D-EOD und eine sCMOS Kamera im Laserfokus. Als nächstes aktivieren Sie die 2D-EOD, der Ritter Tour beschrieben (Abbildung 2) zu generieren. Drehen Sie die Halbwellen Platte, bis eine gleichmäßig quadratische Laser-Verteilung auf die Kamera beobachtet wird.
  6. Installation eines Balkens Aufwendung Objektiv und Relais-Linse-paar
    1. Legen Sie ein paar Linsen (Abbildung 1: L3 und L4) nach der 2D-EOD, erweitern Sie den Balken um die hintere Öffnung der Objektivlinse zu füllen (Abbildung 1: OL) und ein weiteres paar Linsen (Abbildung 1: L5 und L6), Relais der Brennebene auf das Mikroskopobjektiv. Achten Sie darauf, genügend Raum zwischen diesen beiden Paaren von Linsen zu verlassen, wie der TAG Objektiv zwischen ihnen in einem späteren Schritt installiert werden soll.
  7. Installieren Sie das dichroitische Filter, 10/90 Strahlteiler, Fokussierung Objektiv, APD, Objektiv und Fluoreszenz Emission Filter zur Vervollständigung den Erkennung Weg.
    1. Den dichroitischen Filter einbauen (Abbildung 1: DC) entsprechend den Laser auf das Objektiv. Richten Sie den Laser gehen Sie geradeaus durch das Zentrum der Objektivlinse mit zwei Schwertlilien auf der Ober- und Unterseite von einer langen Objektiv-Tubus.
    2. Installieren Sie einen 10/90 Strahlteiler (Abbildung 1: BS) durch die 10 % des Lichtes für die Bildgebung durch eine sCMOS Kamera (siehe unten) und 90 % der durchläuft, der APD für Tracking reflektiert wird.
    3. Richten Sie die APD. Fokussieren Sie den Laser auf einem Deckgläschen durch das Objektiv. Verwenden Sie die Reflexion aus dem Deckglas, alle nachfolgenden Elemente auszurichten, indem ein Deckglas der Objektive Fokus setzen und überprüfen die Intensität der APD auslesen. Nach den Strahlteiler installieren der APD Fokussierlinse (Abbildung 1: L7) gefolgt von der APD auf einer 3D Übersetzung-Bühne. Positionieren Sie das Objektiv so, dass die Laser-Reflexion aus dem Ziel, durch die Mitte der Linse geht.
Die APD-Position kann optimiert werden, durch die 3D Position um die Intensität von der Laser-Reflexion auf das Deckglas zu maximieren. Die APD-Position ist an der optimalen Position, wenn eine Bewegung der Detektor Position in eine beliebige Richtung die Intensität verringert.
  • Installieren Sie einen Langpass-Fluoreszenz Emission Filter (Abbildung 1: F) vor den Strahlteiler, reflektierte und zerstreute Licht zu entfernen.
  • Installation von der TAG-Linse
    1. Legen Sie das TAG Objektiv zwischen den beiden Paaren von Linsen (zwischen Abbildung 1: L4 und L5) so erwähnt und in Abbildung 1dargestellt. Anpassen der Yaw, Pitch, Höhe und Seitenlage derart, dass der Strahl senkrecht durch die Mitte des TAG-Linse geht.

    • 2. Probenvorbereitung.

    1. Feste Partikel Vorbereitung
      1. Verdünnen Sie 190 nm fluoreszierenden Perlen, ~ 5 × 108 Perlen/mL mit PBS-Puffer. 400 µL-Perlen-Lösung auf einem Deckglas und Mount auf dem Probenhalter der piezoelektrischen Bühne hinzufügen (das Volumen der Perlen hängen von der Probenhalter; der Durchmesser der Probenkammer Halter verwendet hier ist 18 mm). Für die hier verwendeten Perlen werden PBS die Partikel auf dem Deckglas zu hinterlegen.
    2. Frei bewegliche Teilchen-Vorbereitung
      1. Verdünnen Sie 110 nm fluoreszierenden Perlen, ~ 5 × 108 Perlen/mL mit VE-Wasser. 400 µL-Perlen-Lösung auf einem Deckgläschen hinzufügen und auf der Probenhalter der piezoelektrischen Stufe montieren.

    3. optimieren Sie Tracking-Parameter

    1. Rasterscan feste Partikel
      1. Legen Sie eine feste Partikel Probe am Mikroskop.
      2. Aktivieren Sie den Laser, Micropositioner Controller, Piezo Nanopositionierer Controller, TAG Objektiv Controller und EOD-Controller. Beachten Sie, dass die Reihenfolge nicht ankommt. Führen Sie die Piezo-Nanopositionierer im geschlossenen Regelkreis.
      3. Raster scannen die Probe in XYZ mit einer benutzerdefinierten Scan Software (Abbildung S3, Software, die von den Autoren auf Anfrage erhältlich), das treibt die 2D-EOD in einem Ritter Tour (Abbildung 2), sammelt zählt die APD, treibt die piezo Nanopositionierer, und führt Positionsberechnung (Abbildung S2). Die Schrittweite ist 40 nm und die Tastweite ist 2 µm.
        1. Um das Deckglas im Mittelpunkt des Ziels zu platzieren, entfernen Sie die Fluoreszenz Emission Filter und verwenden Sie die Reflexion des Lasers aus dem Deckglas zu, um die Signalintensität in Abhängigkeit von der Z-Position der Micropositioner zu maximieren. Nach der Platzierung der Probenmaterials in der Brennebene zurück setzen Sie Fluoreszenz Emission Filter ein.
        2. Öffnen Sie das Scan-Programm. Stellen Sie Scanbereich und Schrittweite durch Eingabe der Nummer in der "Start", "fertig stellen" und "Schritt ein". Zunächst legen Sie einen großen Scanbereich und Schrittweite, ein Teilchen (z.B. 10 x 10 µm Bereich mit 200 nm Schrittweite) zu finden. Schrumpfen Sie nach der Feststellung der Partikel der Scanbereich und verringern Sie Schrittweite (z.B. 2 x 2 µm Bereich mit 100 nm Schrittweite) zu. Klicken Sie auf "Scan", um führen Sie einen 3D Rasterscan, um den fluoreszierenden Fokus zu finden.
    2. TAG-Objektiv-Einstellungen (siehe auch Abbildung 3)
      1. Klicken Sie auf die TAG-Objektiv-Steuerungs-Software. Klicken Sie auf "verbinden", "schalten" sequenziell.
      2. Um die Ausgangsphase des Trigger-Signals zu ändern, ist es notwendig, ändern Sie den Trigger-Ausgabemodus. Ändern Sie zunächst den Modus von "RGB", "Multiplane" und ändern Sie es zurück. Jetzt kann die Phase geändert (Abb. 3 b).
      3. Festlegen der Ausgangsphase 0°, 90° und 270 ° sein. Während alle drei Phasen, die den Phasenraum decken verwendet werden können, sind diese drei auch empirisch arbeiten gefunden (Abb. 3 c).
      4. Wählen Sie die 68.500 Hz-Frequenz-Einstellung.
      5. Um die optimale Frequenz zu finden ist es oft notwendig, um den Frequenzbereich Suche ändern. Klicken Sie auf "erweitert", "einstellen". Änderung der ' Max. Freq(Hz) "der Spalte 0 von 70.000 Hz 71.500 Hz. Dies kann eingestellt werden, in welchem Frequenzbereich geeignet ist. Klicken Sie auf "Kalibrierung speichern", "Exit Kalibrierung" (Abbildung 3d).
      6. Um die neue Kalibrierung wirksam zu machen, wechseln Sie die Resonanz auf eine andere Frequenz (z. B. 189.150 Hz) und wechselte dann zurück zu den 68.500 Hz-Frequenz-Einstellung (Abbildung 3e).
      7. Ändern Sie die Amplitude allmählich auf 35 %. Klicken Sie auf "Sperren Resonanz". Nachdem die Frequenz gesperrt ist, klicken Sie auf "Entsperren Resonanz" (Abbildung 3e). Das TAG-Objektiv ist nun einsatzbereit.
      8. Kalibrieren, ändern Sie die Parameter, die bei der Schätzung verwendet werden, um die geschätzte Position gleich der realen Position machen, wie in Abbildung 4e, f. Eingabe der Scanbereich von x, y und z und klicken Sie dann auf "Scan" Taste zum Scannen der Probe in XYZ zu bewegen die Partikel über die beweglichen Laserspot. Die Position des Partikels sollten wie durch Laserfokus gescannt wird mit der geschätzten Partikel Position bestimmt durch die Position Schätzung Schleife (Abbildung S1) übereinstimmen. Die Beziehung zwischen dem geschätzten und echte Position (Abbildung 4D) kann geschätzte Position Bilder (Abb. 4f) entnommen werden. Wenn die Positionen nicht einverstanden sind, passen Sie die Werte der Laserposition (Ck) in die Position Schätzung Schleife (Abbildung S1) verwendet.
      9. Richten Sie TAG Objektiv
        1. Wenn der TAG Objektiv Controller deaktiviert ist, gescannt das Raster Partikelbilder (siehe unten), die vor der Installation TAG Objektiv und nach Installation TAG Objektiv identisch aussehen sollte. Als nächstes führen Sie fluoreszierende Partikel Z-Stapel-Scannen durch verschieben das Ziel mit der Z-Nanopositionierer Tune Position und Winkel der TAG Objektiv (Abbildung 4). Optimieren Sie die Position der Linse TAG bis gibt es kein Drift in den Partikel-Bildern in XY-Ebene entlang der Z-Richtung, die erreicht wird, wenn es keine Änderung in der XY-Position des Partikels in Abhängigkeit von der Z-Position (Abbildung 4D). Das Tracking-System ist nach dem Ausrichten des Objektivs TAG einsatzbereit.
    3. Installation von sCMOS Kamera zur Überwachung der Partikel
      1. Installieren Sie eine sCMOS Kamera um Partikel zu visualisieren, während sie verfolgt werden. Installieren Sie die sCMOS erst, nachdem alle Komponenten von der Tracking-System installiert und optimiert haben.
    Laden Sie eine feste fluoreszierende Partikel-Probe auf dem Mikroskop und führen Sie das Tracking-Programm, ein Teilchen in der objektiven fokalen Volumen zu sperren. Installieren Sie dann die 100 mm Brennweite (Abbildung 1: L8) und sCMOS. Einstellen Sie die sCMOS Position, so dass das Bild des Partikels, der kleinsten und hellsten Stelle fokussiert ist.

    (4) in Echtzeit 3D-Tracking von frei diffundierende Nanopartikel

    1. Setzen die 110 nm frei beweglichen Teilchen Probe am Mikroskop.
    2. Laser, Mikro-Positionierer Controller Piezo Nanopositionierer Controller, TAG Objektiv Controller und EOD Controller einschalten. Führen Sie die Piezo-Nanopositionierer im Open-Loop. Stellen Sie die TAG Objektiv Software gemäß Schritt 3.2.
    3. Öffnen Sie, und führen Sie die Tracking-Software (verfügbar auf Anfrage von den Autoren). Legen Sie die Position Schätzung Parameter auf die optimierten Werte, die in Abschnitt 3 gefunden wurden.
    4. Um das Deckglas im Mittelpunkt des Ziels zu platzieren, entfernen Sie die Fluoreszenz Emission Filter und verwenden Sie die Reflexion des Lasers aus dem Deckglas zu, um die Signalintensität in Abhängigkeit von der Z-Position der Micropositioner zu maximieren. Erhöhen Sie nach der Feststellung des Deckglases die Fokus Position 15 µm Laser entfernt das Deckglas und in die Lösung zu konzentrieren. Fluoreszenz Emission Filter wieder einsetzen.
    5. Die integrierte Steuerung Konstanten festgelegt. Die integrierte Steuerung Konstanten können eingestellt werden, beginnend bei einem niedrigen Wert und langsam erhöhen, bis die Schwingungen in der Partikel Positionsanzeigen gesehen werden können. Sobald Schwingungen zu beobachten sind, festgelegt die ganzheitliche Steuerung konstanten zu 80 % des Wertes der Schwingungen verursacht. Typische Werte werden um 0,012 für XY "integraler Gain" und 0,004 für Z "integralen Verstärkung".
    6. Die Tracking-Schwellen in 'Track Schwelle' und "Track Minimum" eingestellt und die Tracking-Experiment starten, indem Sie auf "Suchen" und "Auto Track". Die Schwelle für die abschließenden Verfolgung liegt etwas höher als der Hintergrund-Ebene und die Schwelle zur Auslösung von Tracking ist etwa doppelt so hoch als der Hintergrund. Hier die Schwelle zur Auslösung von Tracking 3 kHz und der Schwellenwert für die Beendigung der Flugbahn ist 1,5 kHz.

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    Ergebnisse

    Feste Partikel (Abbildung 4) scannen und frei diffundierende 110 nm fluoreszierende Partikel tracking (Abbildung 5) wurden nach der oben genannten Protokolls durchgeführt. Das Teilchen Scannen erfolgte durch den piezoelektrischen Nanopositionierer und bin Photonen bewegen, während gleichzeitig Berechnung des Partikels Position an jedem Punkt im Scan geschätzt. Der Scan Bild zeigt ein Quadrat von sogar Intensität (

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    Diskussion

    Obwohl viele Sorten von 3D Einzelkorn tracking-Methoden in den letzten Jahren entstanden sind, ist robuste Echtzeitverfolgung von high-Speed 3D Diffusion bei niedrigen Photon Zählraten mit einer einfachen Einstellung immer noch eine Herausforderung, die ihre Anwendung auf wichtige biologische Grenzen Probleme. Die 3D-DyPLoT-Methode beschrieben in dieser IP-Adressen diese Herausforderungen in mehrfacher Hinsicht. Erstens sind die Anregung und Erkennung Wege vereinfacht erheblich im Vergleich zu anderen Implementierungen ...

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    Offenlegungen

    Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

    Danksagungen

    Diese Arbeit wurde durch das National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Prämiennummer R35GM124868 und von der Duke University unterstützt.

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    Materialien

    NameCompanyCatalog NumberComments
    2D Electro-optic Deflector ConOpticsM310A2 required
    Power supply for EODConOptics412Converts FPGA ouput to high voltage for EOD
    TAG  LensTAG OpticsTAG 2.0Used to deflect laser along axial direction
    XY piezoelectric nanopositionerMadCity LabsNano-PDQ275HSUsed for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in 
    Z piezoelectric nanoposiitonerMadCity LabsNano-OP65HSUsed to move the objective lens to follow the diffusing particle
    MicropositionerMadCity LabsMicroDriveUsed to coarsely position sample and evaluate
    Objective LensZeissPlanApoHigh numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss
    sCMOS cameraPCOpco.edge 4.2Used to monitor the particle's position
    APDExcelitasSPCM-ARQH-15Lower dark counts beneficial
    Field programmable gate arrayNational InstrumentsNI-7852r
    SoftwareNational InstrumentsLabVIEW
    Tracking excitation laserJDSUFCD488-30
    LensThorLabsAC254-150-A-MLL1
    LensThorLabsAC254-200-A-MLL2
    PinholeThorLabsP75SPH
    Glan-Thompson PolarizerThorLabsGTH5-AGT
    Half-wave plateThorLabsWPH05M-488WP
    LensThorLabsAC254-75-A-MLL3
    LensThorLabsAC254-250-A-MLL4
    LensThorLabsAC254-200-A-MLL5
    LensThorLabsAC254-200-A-MLL6
    Dichroic MirrorChromaZT405/488/561/640rpcDC
    Fluorescence Emission FilterChromaD535/40mF
    10/90 beamsplitterChroma21012BS
    PBSSigmaD8537
    190 nm fluorescent nanoparticlesBangs laboratoriesFC02F/9942
    110 nm fluorescent nanoparticlesBangs laboratoriesFC02F/10617
    CoverslipFisher Scientific12-545A
    PowermeterThorlabsPM100D
    CMOSThorlabsDCC1545M
    IrisThorlabsSM1D12D
    MicroscopeMad City LabsRM21

    Referenzen

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