JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

İnşaat ve gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme mikroskop izleme Nano floresan yetenekli probları yüksek diffusive hızları ve düşük foton sayısı oranları bu protokolü ayrıntıları.

Özet

Gerçek zamanlı üç boyutlu tek parçacık (RT-3D-SPT) izleme hücresel sistemlerinde hızlı, 3D işlemler ışık potansiyeline sahiptir. Her ne kadar son yıllarda çeşitli RT-3D-SPT yöntemler ileri koymak, yüksek hızlı izleme düşük foton sayısı oranları parçacıklar Difüzyon 3D bir meydan kalır. Ayrıca, RT-3D-SPT kurulumları genellikle biyolojik ilgili sorunların yaygın uygulama sınırlama uygulamak, zor ve karmaşık. Bu iletişim kuralı düşük foton sayısı hesaplı (aşağı 10 kHz) 3D dinamik foton yerelleştirme hangi parçacıklar (en fazla 20 µm2/s) yüksek diffusive hız ile izleyebilirsiniz izleme (3D-DyPLoT), adlı bir RT-3D-SPT sistemi sunar. Akort akustik degrade (TAG) objektif bir tek odaklı sürücü lazer nokta dinamik olarak 3D ve 3D-DyPLoT bir 2D elektro-optik saptırıcı (2D-EOD) istihdam. Bir en iyi duruma getirilmiş konum tahmin algoritması ile birlikte, 3D-DyPLoT yüksek izleme hız ve yüksek yerelleştirme hassasiyet ile tek parçacıklar üzerine kilitleyebilirsiniz. Tek uyarma ve tek algılama yol yerleşim nedeniyle, 3D-DyPLoT sağlam ve kurulumu kolay. Bu iletişim kuralı, 3D-DyPLoT adım adım inşa anlatılmaktadır. İlk olarak, optik düzen açıklanmıştır. Ardından, sistemi kalibre edilmiş ve 190 nm floresan boncuk piezoelektrik nanopositioner ile tarama raster tarafından optimize edilmiştir. Son olarak, gerçek zamanlı 3D yetenek izleme göstermek için 110 nm floresan boncuk suda izlenir.

Giriş

Gelişmiş görüntüleme teknikleri ortaya çıkması tüm yol aşağı moleküler seviyede hücresel olayların her zamankinden daha detaylı yapısını görmek için bir pencere açtı. Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)1,2,3, fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu (PALM)4,5,6,7 gibi yöntemleri , yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM)8,9,10,11ve uyarılmış emisyonu tükenmesi mikroskobu (STED)12,13, 14 kadar yapısı ve fonksiyonu canlı hücre benzersiz detay sunmak için kırınım sınırını aşan gitti. Ancak, nasıl bu sistemlerinden davranır tam anlayış dinamik bilgi hem de yapısal bilgi gerektirir. Yukarıda listelenen süper çözünürlük yöntemleri Uzaysal çözünürlük ve zamansal çözünürlük, hangi ile dinamik süreçler probed zamansal hassas sınırlama arasında bir denge içerir. Sağlar yüksek uzaysal duyarlık ve zamansal çözünürlük RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20bir yöntem 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Burada, bir ayrım çizmek arasında geleneksel 3D-SPT30 ve RT-3D-SPT. geleneksel 3D-SPT sadece (ve ya kullanarak confocal mikroskop ya da bir epifluorescence mikroskobu alınan üç boyutlu görüntü verilerini bir saat serisi gerektirir «««verilir) doğru yapılandırma. Geleneksel 3D SPT içinde parçacık koordinatlarını veri toplama sonra parçacık her görüntü yığınında bulma ve art arda gelen birimler yerlerde birleştirerek oluşan bir yörünge oluşturmak için belirler. Bu yöntemler için nihai zamansal çözünürlük hacimsel görüntüleme hızı tarafından belirlenir. Kolayca saniye saniye onlarca ölçekte bu confocal mikroskoplar için. Neyin Aksiyel konum bilgileri elde edilebilir böylece optik yol manipüle, epifluorescence yöntemleri için zamansal çözünürlük fotoğraf makinesi Pozlama veya okuma zaman sınırlıdır. Bu epifluorescent yöntemler üzerinde eksenel bilgiler toplanabilir aralığında sınırlıdır, Fourier uçak aşamasında son ilerleme maskeleri rağmen tasarım ve adaptif optik uzanan bu aralıklar 10 µm veya daha fazla31,32 , 33 , 34.

Buna ek olarak, RT-3D-SPT bir 3D görüntü yığını edinme ve parçacıklar aslında sonra bulma dayanmaz. Bunun yerine, gerçek zamanlı konum bilgileri tek nokta dedektörleri ile elde edilir ve geri bildirim için etkili bir şekilde "kullanımı ile bir yüksek hızlı piezoelektrik sahne objektif lens odak hacmine parçacık kilit" uygulanır. Bu parçacığın konum sınırlı sürekli ölçümü sadece kaç fotonlar toplanabilir tarafından sağlar. Ayrıca, uzun aralıklarında hareket ederken bu yöntem parçacık spektral sorgulama sağlar. RT-3D-SPT etkin inşaat benzer-e doğru neyin parçacık sürekli probed ve büyük lazer gücü gerek kalmadan gerçek zamanlı veya optik ölçülen Nano nesneleri, kuvvet-Alerjik optik tuzak zorlar. Verilen bu RT-3D-SPT hızlı diffusive nesneleri (ilâ 20 µm2/s)25,29 düşük foton sayısı oranları20,29üç boyutlu olarak sürekli sorgulama için bir araç sağlar, 35, bunu sağlamak bir pencere içine hızlı veya geçici biyolojik süreçlerin hücre içi kargo taşımacılığı, ligand-reseptör bağlama ve tek virions ekstrasellüler dinamikleri gibi. Ancak, şu ana kadar RT-3D-SPT uygulanması bu teknoloji ilerlemek için çalışma grupları avuç sınırlı olmuştur.

Çeşitlidir RT-3D-SPT yöntemler tarafından gerekli optik düzen karmaşıklığı bir engeldir. En yöntemleri için optik görüş piezoelektrik bir sahne ile sağlanır. İçinde X, Y veya Z, dökümanları tek nokta dedektörleri üzerinden hata işlevleri için dönüştürülür ve de beslenen parçacık yapar küçük hareketleri olarak piezoelektrik nanopositioner için yüksek hızlı içinde açmak parçacığın hareketi, etkili bir şekilde karşı koymak için örnek taşır yerde objektif lens göreli kilitleme. X, küçük pozisyonel hareketleri ölçmek için Y ve Z, birden çok Dedektörler (4 veya 5 uygulama bağlı olarak)15,18,21 ya da birden çok uyarma noktalar (2-4, hangi daha düşük eğer uygulanabilir bir amplifikatör kilit-in X ayıklamak için kullanılır ve bir döner kullanarak Y konumunu lazer nokta)25,28 uygulanır. Bu birden fazla algılama ve emisyon noktalarından örtüşme sistemleri hizalayın ve korumak zor yapmak.

Burada, biz 3D-DyPLoT29denen bir basitleştirilmiş optik tasarımı ile yüksek hızlı hedefe kitlendik 3D-SPT yöntemi mevcut. 3D-DyPLoT dinamik olarak odaklı lazer nokta yüksek bir oranı (50 kHz XY, 70 kHz Z) objektif odak seste aracılığıyla taşımak için bir 2D EOD ve etiket objektif36,37,38 kullanır. Lazer odak konumu ve foton varış saati birleştiren parçacığın 3B konumlandırma hızla bile düşük foton sayısı oranları elde edilecek sağlar. 1 x 1 µm X-Y düzlemde bir kare boyutu ile bir şövalyenin Tur Model39 ' lazer odak 2D EOD sürücüler ve etiket objektif lazer odak aralığı 2-4 µm ile eksenel yönde hareket eder. 3D parçacık pozisyon bir en iyi duruma getirilmiş konum tahmin algoritması29,40 3D ile elde edilir. Çığ fotodiyot (APD), gerçek zamanlı parçacık pozisyonu hesaplama, piezoelektrik sahne geri bildirim ve veri kayıt sayma 3D dinamik olarak hareketli lazer nokta, foton kontrolünü bir alan programmable gate array (FPGA) yapılmaktadır.Bu iletişim kuralı, biz 3D-DyPLoT mikroskop optik uyum, kalibrasyon ile sabit parçacıklar, dahil olmak üzere adım adım inşa etmek nasıl açıklar ve nihayet parçacık izleme ücretsiz. Bir gösteri 110 nm floresan boncuk sürekli suda dakika bir anda için takip.

Burada açıklanan yöntemi nerede sürekli virüsler, nano tanecikleri ve veziküller gibi endosomes gibi düşük seviyelerde hafif, hızlı hareket eden floresan sonda izlemek için istenen herhangi bir uygulama için ideal bir seçim var. Önceki yöntemler aksine, yalnızca bir tek uyarma ve tek algılama yolu, hizalama ve bakım basit yapma işte. Ayrıca, kolayca düşük sinyal seviyeleri (aşağı 10 kHz), izleme özelliği bu yöntem düşük ışık uygulamaları29için ideal yapar iken hızlı parçacıklar, difüzyon kadar almak bu mikroskop büyük algılama alanı sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Kur düzeni ve uyum

  1. Lazer yükleme ve kolimasyon izleme uyarma
    1. Lazer optik tabloda bir ev inşa bağlama yoluyla yapıştırmayın. Montaj delikleri lazer baş ve optik tablo için montaj ile basit alüminyum plakadır. Lazer sıkıca istikrar ve ısı dağıtımı için metal bir takma iliştirilmesi gerekir. Dalga boyu belirli bir fluorophore uygun veya deneme için seçilmiş olsa bu iş için 488 nm katı hal lazer aydınlatma (şekil 1) için kullanın. Lazer dalga boyu öncelikle iki yansıtıcılar arasında dalga plaka belirlenir 2D-EOD çalışma aralığı uygun önemli bir faktördür (şekil 1: W2). 488 nm lazer etkili ortak Floresan Etiketler canlı hücre deneylerde olan yeşil veya sarı floresan protein (GFP/YFP), heyecanlandırmak.
    2. Lazer ışını yükseklik ve Dielektrik aynalar bir çift kullanarak yönünü ayarlamak (şekil 1: M). lazer ışını optik tabloya paralel olduğundan emin olun ve uygun yüksekliğe ayarlayın.
      Not: Yüksekliği mikroskop platformu dayalı seçilmelidir. Açıkça değil belirtilecektir rağmen bu yükseklik bu protokol için kullanılan tüm sonraki aynalar için sağlanmalıdır.
    3. Bir çift lens ile ışın collimate (şekil 1: L1 ve L2). Lensler odak uzunlukları 2D EOD diyafram tarafından kırpılan lazer nokta önlemek için dikkatle seçilmelidir. Kırpma 2D EOD geçtikten sonra değişiklik lazer ışını şekli ile belirgindir. Burada kolimasyon kalitesi çok önemli çünkü anomalileri tarafından sonraki lensler AMPLİFİKATÖRLÜ olacaktır ve herhangi bir sapma 2D-EOD saptırma performansı bozulacaktır. İdeal olarak, ışın demeti bir noktaya en az 20 m odaklanarak collimate.
  2. Bir iğne deliği yerleştirin (şekil 1: PH) ilk kolimasyon lens odak, uygun büyüklükte (şekil 1: L1).
    1. Uygun ölçekli bir iğne deliği seçin. İğne deliği boyutu aşağıdaki hesaplama göre seçilebilir:
      figure-protocol-2119
      Lazer, dalga boyu λ nerede f ilk lens odak uzaklığı ise D giriş ışın çapı.
    2. İğne deliği ve sondaj ilk kolimasyon lens odak tam olarak yerleştirilebilir bir 3B Çevirme sahnede bağlarsınız.
    3. İğne deliği ve sondaj konumunu ayarlamak. Lazer güç metre sonra iğne deliği yerleştirin ve XYZ güç metre okuma en üst düzeye çıkarmak için iğne deliği konumu ayarlayın. Kırınım halkası gözlem yapılırsa, 2D-EOD önce yerleştirilen bir iris ile engelleyiniz.
  3. Montajı Glan-Thompson polarize
    1. Glan-Thompson polarize koymak (şekil 1: GP) sonra ikinci kolimasyon lens (şekil 1: L2) lazer ışını kutuplaşma temizlemek için. En fazla iletim ile yeti ölçme aygıtı bulmak için polarize döndürün.
  4. EODs kurulumu
    1. 2 EODs kullanın (şekil 1: EOD1 & EOD2) X ve Y yönde lazer saptırmak için. Lazer iletim yaw, zift ve her EOD yüksekliğini ayarlayarak en üst düzeye çıkarmak.
    2. İki EODs saygı ile her yansıtıcı kenarında üretici tarafından sağlanan hizalama işaretçisi kullanarak hizalayın.
    3. Bir sınama deseni EOD çıktısını denetlemek için 2D EOD denetleyicisine uygulamak. Bu da aşağıda açıklanan FPGA veya basit bir sinüs dalga bir işlev üreteci tarafından sağlanan üzerinden şövalyenin tur (Şekil 2) olabilir. En iyi performans için her yansıtıcı tarafından saptırma piezo nanopositioner X ya da Y yönünü paralel olmalıdır. Bu yönde iletim eksen yansıtıcılar açısal yönünü tarafından dikte edilir. 2D EOD hareket ettirmeden saptırma yönde döndürmek için piezo nanopositioner eksenleri saptırma eksenleri hizalamak için 2D EOD sonra bir güvercin prizma yerleştirin.
  5. Yarım dalga plaka yükleme
    1. Bir yarı-dalga tabak yerleştirin (şekil 1: W1) Glan-Thompson polarize arasında (şekil 1: GP) ve gelen lazer hizalamak için 2D EOD 2D EOD saptırma eksen ile polarizasyon ışınlayın. Uzun odak lens (300 mm) 2D-EOD sonra yerleştirin ve sCMOS fotoğraf makinesini de lazer odak yerleştirin. Daha sonra (Şekil 2) açıklanan şövalyenin Tur oluşturmak için 2D EOD açın. Bir eşit kare lazer dağıtım fotoğraf makinesinde gözlenen kadar yarım dalga plaka döndür.
  6. Objektif çift ve geçiş objektif çift sokmaksızın bir kiriş montajı
    1. Lensler bir çift koyun (şekil 1: L3 ve L4) sonra objektif lens arka diyafram doldurmak için ışın genişletmek için 2D EOD (şekil 1: OL) ve başka bir çift lens (şekil 1: L5 ve L6) için geçiş için mikroskop objektif odak düzlemi. ETİKET objektif bir sonraki adımda aralarında yüklü olarak lensler bu iki çift arasında yeterli yer bıraktığınızdan emin olun.
  7. Dikroik filtre, 10/90 ışın bölücü, objektif, APD, objektif lens ve floresan emisyon filtre algılama yolu tamamlamak için odaklanarak yükleyin.
    1. Dikroik filtre kurun (şekil 1: DC) lazer objektif lens doğru yansıtacak. Düz bir uzun lens tüp alt ve üst iki süsen kullanarak objektif lens Merkezi aracılığıyla gitmek için lazer hizalayın.
    2. 10/90 ışın splitter kurun (şekil 1: BS) tarafından hangi % 10'u ışık görüntüleme için bir sCMOS kamera (aşağıda açıklanmıştır) ve takibi için APD için üzerinden geçer yüzde 90'ını yansıtır.
    3. APD hizalayın. Bir coverslip üzerine lazer tarafından objektif lens odak. Coverslip gelen yansıma tüm alt öğeleri de objektif odak bir coverslip koyarak ve APD okuma yoğunluğunu kontrol hizalamak için kullanın. Işın splitter sonra objektif odak APD kurun (şekil 1: L7) APD tarafından bir 3B Çevirme Sahne Alanı'nda izledi. Öyle ki amaç lazer yansımayı lens merkezinden gider objektif getirin.
APD pozisyon coverslip lazer yansıması dan yoğunluğu en üst düzeye çıkarmak için 3B konumlandırma ayarlayarak optimize edilebilir. Ne zaman bir hareket dedektörü konumu herhangi bir yönde yoğunluğu azalır en uygun konumda APD konumdur.
  • Longpass floresan emisyon filtre kurun (şekil 1: F) yansıyan ve dağınık ışık kaldırmak için ışın ayırıcı önce.
  • Yükleme etiketi lens
    1. ETİKET objektif lensler iki çift arasında yer ( şekil 1arasında: L4 ve L5) olarak daha önce bahsedilen ve gösterilen şekil 1. Öyle ki ışın dik merkezi etiketi lens aracılığıyla geçer yaw, pitch, yükseklik ve yatay pozisyon ayarlayın.

    • 2. numune hazırlama.

    1. Sabit parçacık hazırlık
      1. 190 nm floresan boncuk için seyreltik ~ 5 × 108 boncuk/mL PBS içinde. Piezoelektrik sahne örnek sahibinin 400 µL boncuk çözüm coverslip ve bağlama üzerine ekleyin (Boncuk hacmi örnek tutucu üzerinde bağlıdır; burada kullanılan örnek sahibi odası çapı 18 mm olduğunu). Burada kullanılan boncuklar için PBS üzerinde coverslip yatırmak parçacıklar neden olur.
    2. Ücretsiz hareketli parçacık hazırlık
      1. 110 nm floresan boncuk için seyreltik ~ 5 × 108 boncuk/mL DI su ile. 400 µL boncuk çözüm bir coverslip üzerine ekleyin ve piezoelektrik sahne örnek tutucu monte.

    3. izleme parametrelerini optimize edin

    1. Raster tarama sabit parçacıklar
      1. Sabit parçacık örnek mikroskobunun koymak.
      2. Lazer, micropositioner denetleyicisi, piezo nanopositioner denetleyicisi, etiket objektif denetleyicisi ve EOD denetleyicisi üzerinde açın. Not sırası önemli değildir. Piezo nanopositioner kapalı döngüde çalışacak.
      3. Raster tarama 2D-bomba imha bir şövalyenin tur (Şekil 2) sürücüler, APD sayıları toplar, piezo sürücüler bir özel tarama yazılım programı (Şekil S3, yazılım yazarlar gelen istek üzerine mevcuttur), kullanarak XYZ örnek nanopositioner ve pozisyon hesaplama (Şekil S2) gerçekleştirir. Adım boyutudur 40 nm ve tarama aralığı olduğunu 2 µm.
        1. Coverslip de objektif odak yerleştirmek için Floresans emisyon filtreyi kaldırmak ve lazer coverslip gelen yansıma micropositioner Z konumunu bir fonksiyonu olarak sinyal şiddeti en üst düzeye çıkarmak için kullanın. Odak düzlemi, örnek yerleştirdikten sonra Floresans emisyon filtre geri yerleştirin.
        2. Tarama programını açın. Tarama aralığı ve adım boyu 'Başlat', 'son' ve 'adım' sayıyı yazarak ayarlayın. Önce bir büyük tarama aralığı ve bir parçacık (örneğin, 10 x 10 µm Aralık 200 nm adım boyu ile) bulmak için adım boyu ayarlayın. Parçacık bulma sonra tarama aralığı daraltmak ve adım boyu (örneğin, 2 x 2 µm Aralık 100 nm adım boyu ile) azaltın. Floresan odak bulmak için 3D raster tarama gerçekleştirmek için 'Tarama' düğmesini tıklatın.
    2. (Ayrıca bkz: şekil 3) etiket objektif ayarları
      1. ETİKET objektif kontrol yazılımı üzerinde'yi tıklatın. ', 'Güç' Bağlan' sırayla tıklatın.
      2. Tetikleyici sinyalleri çıktı aşaması değiştirmek için çıkış tetik modunu değiştirmek gereklidir. Önce 'Multiplane' dan 'RGB' moduna değiştirin ve sonra tekrar değiştir. Şimdi aşama olabilir (şekil 3b) değişti.
      3. Çıkış Faz 0 °, 90 ° ve 270 ° olarak ayarlayın. Faz uzayı kapsayan herhangi bir üç aşamada kullanılabilir ise, bu üç de ampirik çalışmaya bulunur (şekil 3 c).
      4. 68,500 Hz frekans ayarı seçin.
      5. Uygun frekans bulmak için genellikle frekans arama aralığı değiştirmek gereklidir. ', 'Ayarı' İleri' seçeneğini tıklatın. Değişim ' Max. Freq(Hz)' sütun 0 70.000 Hz 71,500 Hz. Bu-ebilmek var olmak ayarlamak ne olursa olsun frekans aralığı uygundur. Tıklayın 'Kalibrasyon Kaydet', 'Exit kalibrasyon' (şekil 3d).
      6. Yeni bir ayar etkin kılmak için başka bir frekans (örneğin, 189,150 Hz) rezonans geçin ve sonra 68,500 Hz frekans ayarları geri (şekil 3e) değiştirdim.
      7. Genlik yavaş yavaş % 35'e değiştirin. 'Rezonans kilitle' tıklatın. Frekans kilitlendikten sonra 'Rezonans' (şekil 3e) kilidini aç'ı tıklatın. ETİKET objektif artık kullanıma hazırdır.
      8. F. tarama aralığını x, y giriş kalibre, tahmininde tahmini konumu şekil 4eiçinde gösterildiği gibi gerçek konumuna eşit hale getirmekte kullanılan parametrelerini değiştirmek için ve z ve o zaman tıkırtı 'Tarama' düğme taşımak için XYZ örnekte taramak için parçacık hareketli lazer nokta üzerinden. Lazer odak taranmış parçacık konumunu konum tahmini döngü (Şekil S1) tarafından belirlenen tahmini parçacık pozisyonla anlaşmalıdırlar. Tahmini konumu ve gerçek konumu (şekil 4 d) arasındaki ilişki (şekil 4f) tahmini konumu görüntülerden elde edilebilir. Pozisyonlar kabul etmiyorsanız, konum tahmini döngü (Şekil S1) kullanılan lazer pozisyon (ck) değerlerini ayarlamak.
      9. ETİKET objektif Hizala
        1. ETİKET objektif denetleyicisi kapalıyken, raster (aşağıda açıklanmıştır) parçacık görüntüleri etiketi lens takmadan önce ve sonra yükleme etiketi objektif aynı görünmelidir alınan inceden inceye gözden geçirmek. Ardından, floresan parçacık Z yığın amacı konumu ve etiket lens (şekil 4) açısını ayarlamak için z nanopositioner ile hareket ettirerek tarama gerçekleştirin. Kalmayıncaya kadar hiçbir drift parçacık Albümdeki parçacık XY pozisyonu Z konumunu (şekil 4 d) bir fonksiyonu olarak herhangi bir değişiklik olduğunda elde Z yönünde boyunca XY düzlemde etiketi objektif konumunu ayarlamak. İzleme sistemi etiketi objektif hizalamasını sonra kullanıma hazırdır.
    3. Parçacık izlemek için sCMOS kamera kurulumu
      1. Onlar izleniyorsa iken parçacıklar görselleştirmek için bir sCMOS kamera yükleyin. Sonra sadece tüm bileşenleri izleme sisteminin optimize ile yüklenip sCMOS yükleyin.
    Sabit floresan parçacık örnek mikroskop üzerine yük ve objektif odak hacminde bir parçacık kilitlemek için izleme programını çalıştırın. Daha sonra 100 mm odak uzaklığı objektif yükleyin (şekil 1: L8) ve sCMOS. Böylece görüntü parçacık en küçük ve en parlak noktanın üzerine odaklanmıştır sCMOS pozisyonunu ayarlayýn.

    4. serbestçe nano tanecikleri Difüzyon gerçek zamanlı 3D izleme

    1. Yerine 110 nm ücretsiz parçacık örnek üzerinde mikroskop hareket.
    2. Lazer, mikro-Pozisyoner denetleyicisi, piezo nanopositioner denetleyicisi, etiket objektif denetleyicisi ve EOD denetleyicisi açın. Piezo nanopositioner açık döngüde çalışacak. ETİKET lens yazılım adım 3.2 göre ayarlayın.
    3. Açın ve izleme yazılımı (yazarlar gelen istek üzerine mevcuttur) çalıştırın. Konumu, Bölüm 3'te bulunan en iyi duruma getirilmiş değerlerine tahmini parametreleri ayarlayın.
    4. Coverslip de objektif odak yerleştirmek için Floresans emisyon filtreyi kaldırmak ve lazer coverslip gelen yansıma micropositioner Z konumunu bir fonksiyonu olarak sinyal şiddeti en üst düzeye çıkarmak için kullanın. Coverslip bulduktan sonra lazer coverslip uzak ve çözüm içine odaklanmak için odak pozisyon 15 µm artırın. Floresans emisyon filtre geri yer.
    5. Dahili kontrol sabitler ayarlayın. Dahili kontrol sabitler düşük bir değer başlangıç ve salınım parçacığın konum dökümanları içinde görülebilir kadar yavaş yavaş artan ayarlayabilirsiniz. Salınımlarını gözlenen sonra dahili kontrol sabitler titreşimler neden değeri % 80'i için ayarlayın. Tipik değerleri 0.012 XY 'ayrılmaz kazanç' ve 'ayrılmaz kazanç' Z için 0,004 civarında olacak.
    6. İzleme eşikleri 'Parça eşik' ve 'Parça en az' ve 'Ara' ve 'Auto Track' tıklayarak izleme deneme başlayın. Eşik Sonlandırıcı takibi için biraz arka plan düzeyi daha yüksek ayarlanır ve izleme tetikleme için eşik yaklaşık iki kat arka plan daha yüksektir. Burada, izleme tetikleme için eşik 3 kHz ve yörünge sona erdirmek için eşik 1.5 kHz.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Sonuçlar

    Sabit parçacık (şekil 4) tarama ve izleme serbestçe akışkanın 110 nm floresan parçacık (şekil 5) Yukarıdaki protokol sonrası yapıldı. Parçacık tarama tarama, her bir noktada pozisyon aynı anda parçacığın hesaplama tahmini piezoelektrik nanopositioner ve depo gözü fotonlar hareket tarafından gerçekleştirildi. Bir kare bile yoğunluk (şekil 4a) tarama görüntü gösterir ve ...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Tartışmalar

    3D tek parçacık yöntemleri izleme birçok çeşidi son yıllarda ortaya çıkan, yüksek hızlı 3D Difüzyon düşük foton sayısı hesaplı basit bir kurulum ile sağlam gerçek zamanlı izleme hala önemli biyolojik onun uygulamaya sınırlayan bir meydan okuma olsa da sorunları. 3D-DyPLoT yöntemi bu iletişim kuralı adreslerini bu sorunlar çeşitli yollarla nitelendirdi. İlk olarak, uyarma ve algılama yolları büyük ölçüde basit ve sağlam hizalama yapma diğer uygulamaları ile karşılaştırıldığ...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Açıklamalar

    Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

    Teşekkürler

    Bu eser tarafından Ulusal Genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası R35GM124868 altında ve Duke Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Malzemeler

    NameCompanyCatalog NumberComments
    2D Electro-optic Deflector ConOpticsM310A2 required
    Power supply for EODConOptics412Converts FPGA ouput to high voltage for EOD
    TAG  LensTAG OpticsTAG 2.0Used to deflect laser along axial direction
    XY piezoelectric nanopositionerMadCity LabsNano-PDQ275HSUsed for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in 
    Z piezoelectric nanoposiitonerMadCity LabsNano-OP65HSUsed to move the objective lens to follow the diffusing particle
    MicropositionerMadCity LabsMicroDriveUsed to coarsely position sample and evaluate
    Objective LensZeissPlanApoHigh numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss
    sCMOS cameraPCOpco.edge 4.2Used to monitor the particle's position
    APDExcelitasSPCM-ARQH-15Lower dark counts beneficial
    Field programmable gate arrayNational InstrumentsNI-7852r
    SoftwareNational InstrumentsLabVIEW
    Tracking excitation laserJDSUFCD488-30
    LensThorLabsAC254-150-A-MLL1
    LensThorLabsAC254-200-A-MLL2
    PinholeThorLabsP75SPH
    Glan-Thompson PolarizerThorLabsGTH5-AGT
    Half-wave plateThorLabsWPH05M-488WP
    LensThorLabsAC254-75-A-MLL3
    LensThorLabsAC254-250-A-MLL4
    LensThorLabsAC254-200-A-MLL5
    LensThorLabsAC254-200-A-MLL6
    Dichroic MirrorChromaZT405/488/561/640rpcDC
    Fluorescence Emission FilterChromaD535/40mF
    10/90 beamsplitterChroma21012BS
    PBSSigmaD8537
    190 nm fluorescent nanoparticlesBangs laboratoriesFC02F/9942
    110 nm fluorescent nanoparticlesBangs laboratoriesFC02F/10617
    CoverslipFisher Scientific12-545A
    PowermeterThorlabsPM100D
    CMOSThorlabsDCC1545M
    IrisThorlabsSM1D12D
    MicroscopeMad City LabsRM21

    Referanslar

    1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
    2. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
    3. Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
    4. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
    5. Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
    6. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
    7. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat. Methods. 5 (5), 417(2008).
    8. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044(2011).
    9. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods. 6 (5), 339(2009).
    10. Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
    11. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
    12. Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED). Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).
    13. Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).
    14. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
    15. Welsher, K., Yang, H. Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles. Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).
    16. Welsher, K., Yang, H. Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy. Faraday Discuss. 184 (0), 359-379 (2015).
    17. Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking. J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).
    18. Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles. Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).
    19. Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts. Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901(2006).
    20. Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions. ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).
    21. Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells. Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).
    22. Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. Three-dimensional tracking of individual quantum dots. Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).
    23. McHale, K., Mabuchi, H. Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope. Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).
    24. McHale, K., Mabuchi, H. Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm. J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).
    25. McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking. Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).
    26. Juette, M. F., Bewersdorf, J. Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution. Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).
    27. Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bräuchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking. ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).
    28. Perillo, E. P., Liu, Y. -L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -K., Hung, M. -C., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, (2015).
    29. Hou, S., Lang, X., Welsher, K. Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot. Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).
    30. Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).
    31. Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions. Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).
    32. Lee, H. -lD., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision. Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701(2012).
    33. Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).
    34. Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzanò, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges. Optica. 4 (3), 367-373 (2017).
    35. Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynnå, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606(2017).
    36. Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing. Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).
    37. Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics. BIOMEDO. 17 (5), (2012).
    38. Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens. Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).
    39. Wang, Q., Moerner, W. E. Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap. Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).
    40. Fields, A. P., Cohen, A. E. Optimal tracking of a Brownian particle. Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).
    41. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Yeniden Basımlar ve İzinler

    Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

    Izin talebi

    Daha Fazla Makale Keşfet

    Biyom hendisliksay 131tek par ac k izlemeoptik mikroskobuFloresang r nt leme sistemlerioptik tuzaklaroptik3D izlemeger ek zamanl par ac k izleme

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Gizlilik

    Kullanım Şartları

    İlkeler

    Bize Ulaşın

    KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

    JoVE HABER BÜLTENLERİ

    Araştırma

    Eğitim

    Yazarlar

    Kütüphaneciler

    JoVE Hakkında

    Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır