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要約

建設と操業追跡ナノスケール蛍光ことができるリアルタイム 3 D 単一粒子追跡顕微鏡プローブ高拡散速度と低い光子カウント率をこのプロトコルの詳細

要約

リアルタイム三次元単一粒子 (RT-3D-SPT) を追跡するセルラ システムにおける高速、3 D プロセスに光を当てる可能性があります。各種 RT 3 D SPT は、近年に前方を置かれているがユーザーは、課題のままに低い光子カウント レートでの粒子の拡散 3 D 高速を追跡します。さらに、RT 3 D SPT セットアップが一般に複雑で実装が困難生物学的問題への広範な応用を制限します。このプロトコルは、(10 kHz) まで低光子カウント レートで 3 D ダイナミック フォトン局在追跡 (3 D DyPLoT)、高拡散速度 (最大 20 μ m2/s) の粒子を追跡する名前付き RT 3 D SPT システムを提案します。3 D DyPLoT が 2次元電気光学偏向器 (2 D EOD) を採用し、単一焦点を当てたドライブに可変音響グラデーション (タグ) レンズ レーザー 3 D で動的にスポット。最適化された位置推定アルゴリズムを組み合わせると、3 D DyPLoT を高いトラッキング スピードと高い位置推定精度単一粒子にロックできます。単一励起と単一検出パス レイアウト、3 D DyPLoT は堅牢で簡単にセットアップです。このプロトコルでは、3 D DyPLoT ステップ バイ ステップを構築する方法について説明します。まず、光のレイアウトが記述されます。次に、システムは校正、走査線 190 nm の蛍光ビーズを圧電 nanopositioner を最適化します。最後に、リアルタイム 3 D の追跡能力を示すためには、110 nm の蛍光ビーズが水で追跡されます。

概要

高度なイメージング技術の出現は、分子レベルまでの細胞現象のより詳しい構造を表示するウィンドウを開いています。確率論的光再構成顕微鏡 (嵐)1,2,3、光重合のローカリゼーション顕微鏡 (パーム)4,5,6,7 等、照明顕微鏡 (SIM)8,9,10,11, 構造および誘導放出の枯渇顕微鏡 (STED)12,13、 14は、生きた細胞の機能と構造に前例のない詳細を提供する回折限界を越えるまで行っています。しかし、どのようにこれらのシステムの動作を完全理解構造情報と同様に、動的な情報が必要です。上記の超解像の方法は、空間分解能、時間分解能、ダイナミックなプロセスを検出できる時間の精度を制限することの間のトレードオフを含みます。空間精度と時間分解能の両方が RT 3 D SPT15,16,17,18,19,20を提供する方法 21,22,23,24,25,26,27,28,29。ここでは、我々 は区別を描く伝統的な 3 D SPT30と spt 上 RT-3D 伝統的な 3 D SPT が単に必要です (どちらか落射蛍光顕微鏡や共焦点の顕微鏡を使用して得ることができる 3次元画像データの時系列右の構成を与えられた)。伝統的な 3 D-SPT で粒子の座標は、軌道を作成する、各画像のスタックで粒子を検索し、連続ボリュームの場所を連結によってデータ収集後決定されます。これらのメソッドは、究極の時間分解能は体積のイメージング速度によって決定されます。共焦点顕微鏡は、これは簡単に数十秒秒のスケールで。落射蛍光メソッドは、前記軸位置情報を抽出することができますので、光路は操作され、時間の分解能は、カメラの露出や読み出し時間によって制限されます。これらの epifluorescent メソッドは、軸方向の情報を収集できる範囲に限られている、デザインと適応光学は 10 μ m またはより多くの31,32これらの範囲を拡張するフーリエ面相の最近の進歩のマスクが,33,34。

対照的に、RT 3 D SPT では、3 D 画像のスタックを取得し、事実の後の粒子を見つけることに依存しません。代わりに、単一ポイント探知器を介してリアルタイムの位置情報を抽出し、効果的にフィードバックが適用される高速圧電ステージを使用して対物レンズの焦点容積の粒子を「ロック」。これにより限られた粒子の位置の連続測定、だけでどのように多くの光子を収集することができます。また、このメソッドは、長い範囲に移動すると、粒子のスペクトルの尋問をできます。RT 3 D SPT 有効ナノスケール物質、粒子は継続的に検出、大型レーザー加工力を必要とせずリアルタイムまたは光で測定前記のフォース フリー光学トラップに似ている作品を強制します。考えると RT 3 D SPT 高速拡散オブジェクト (最大 20 μ m2/s)25,29低光子カウント レート20,29、3 つの次元での継続的な尋問のための手段を提供します 35、それの細胞内輸送、ligand 受容器のバインディング、および単一粒子の細胞のダイナミクスなど高速または一時的な生物学的プロセスにウィンドウを提供する必要があります。しかし、このポイントに RT 3 D SPT のアプリケーションはこの技術を進めるために働くグループの一握りに制限されています。

1 つの障壁は、RT 3 D SPT メソッドは、変化に必要な光のレイアウトの複雑さです。ほとんどのメソッドは、光フィードバックは圧電ステージによって提供されます。粒子は小さな動きの X、Y、または Z、シングル ポイント探知器からの読み出しエラー関数に変換され、供給として圧電 nanopositioner を高速で回す移動粒子の運動を効果的に対抗するためにサンプル対物レンズの相対的な場所にそれをロックします。X で小の位置の動きを測定する Y、および Z、複数検出器 (4 または 5 の実装に応じて)15,18,21または複数の励起スポット (2-4、低いどの場合も適用できます、ロックイン アンプを使用して、X を抽出して Y 位置回転レーザー スポット)25,28が適用されます。これら複数の検出、発光スポットの重複、システムの配置および保守が困難。

ここで、3 D DyPLoT29と呼ばれる簡略化された光学設計と高速ターゲット ロックの 3 D SPT 法を提案する.3 D DyPLoT は、高レート (50 kHz XY ・ Z 70 kHz) で客観的焦点音量を介し集光レーザー スポットを動的に移動する 2 D EOD とタグ レンズ36,37,38を使用します。レーザー焦点位置と光子の到着時間を組み合わせることにより、低光子カウント レートでも急速に得られる粒子の 3 D 位置。騎士のツアー パターン39 X Y 平面に 1 x 1 μ m の正方形のサイズでの 2D EOD ドライブのレーザーの焦点とタグ レンズは 2-4 μ m の範囲で軸方向にレーザーの焦点を移動します。3 D 粒子の位置は、最適化された位置推定アルゴリズム29,40 3 D で取得されます。3 D 動的に動いてレーザー スポット、フォトンカウンティング アバランシェ フォト ダイオード (APD)、実時間粒子位置の計算、圧電ステージ フィードバック、およびデータ記録からのコントロールは、フィールド プログラマブル ゲート アレイ (FPGA) で行われます。このプロトコルでは、ステップバイ ステップで、固定粒子を用いたキャリブレーション光学アライメントを含む 3 D DyPLoT 顕微鏡を構築する方法について説明し、最後に無料の粒子追跡。例として 110 nm 蛍光ビーズで追跡された継続的に水の分を一度に。

記載方法は、それがウイルス、ナノ粒子、エンドソームなど小胞など、低光レベルでの高速移動の蛍光プローブを継続的に監視する望まれる任意のアプリケーションに最適です。以前の方法と対照をなして単一励起とアラインメントや保守を簡単に作る、単一検出経路のみがあります。また、大規模な検知エリアはこの顕微鏡を簡単に拾う (10 kHz) まで低信号レベルで追跡する機能は、このメソッドは低光アプリケーション29に最適すぐに粒子を拡散できます。

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プロトコル

1 のレイアウトおよび配置をセットアップします。

  1. インストールおよび追跡励起のコリメーション レーザーします。
    1. 自作のマウントを使用して光学テーブルにレーザーを貼付します。マウントは、取り付けレーザー ヘッドおよび光学テーブルの穴が付いたシンプルなアルミ板です。レーザーは、安定性と放熱のため金属製のマウントにしっかりと固定する必要があります。この作品は、特定の蛍光体に合うか実験する波長を選択できますが照明 (図 1)、488 nm 固体レーザを使用してください。重要な要因は 2 つのデフレクタ間波長板によって主に決定される 2D EOD の作業範囲をレーザー波長に合わせて (図 1: W2)。488 nm レーザーは効果的に、緑または黄色蛍光蛋白質 (GFP/YFP)、生きているセル実験における一般的な蛍光タグであるを刺激できます。
    2. レーザー ビーム高さと誘電体ミラーのペアを使用して方向を調整 (図 1: M). レーザー光は光学テーブルに平行かどうかを確認し、適切な高さに調整します。
      注: 高さは顕微鏡プラットフォームに基づいて選択する必要があります。それ明示的には述べていませんが、このプロトコルで使われるそれ以降のすべてのミラーのこの高さを維持しなければなりません。
    3. コリメート レンズのペアを持つビーム (図 1: L1 と L2)。レンズの焦点距離は、2 D EOD の絞りでクリップされるレーザ スポットを避けるために慎重に選択必要があります。クリッピングは 2D EOD を通過した後レーザー ビーム形状の変化によって明白であります。コリメーションここの品質との相違は 2D EOD たわみ性を悪化する収差のレンズによって増幅されるため非常に重要です。理想的には、少なくとも 20 m のポイントにビームの集束によってビームをコリメートします。
  2. ピンホールを配置 (図 1: PH) 最初のコリメーション レンズの焦点に適切なサイズの (図 1: L1)。
    1. 適切なサイズのピンホールを選択します。ピンホールの大きさは、以下の計算に基づいて選択できます。
      figure-protocol-1268
      レーザーの波長λはfは最初のレンズの焦点距離、 Dは入射ビーム径。
    2. 3D 変換ステージ上ピンホールをマウントし、最初のコリメーション レンズの焦点を正確に配置できるようにします。
    3. ピンホールの位置を調整します。ピンホール後レーザー パワー メーターを置き、電源メーター読み出しを最大化するために XYZ のピンホールの位置を調整します。回折リングを観察すると、手前に 2 D EOD アイリス ブロックします。
  3. グラントムソン偏光板のインストール
    1. グラントムソン偏光板を置く (図 1: GP) 第二のコリメーション レンズ後 (図 1: L2) レーザー光の偏光をきれいにします。パワーメータを最大転送を見つけるに偏光板を回転させます。
  4. EODs のインストール
    1. 2 EODs を使用 (図 1: EOD1 & EOD2) X および Y の方向のレーザーをそらすために。ヨー、ピッチ、および各 EOD の高さを調整することによってレーザ伝送を最大化します。
    2. 互いに各デフ側に製造元から提供されるアライメント マーカーを使用して 2 つの EODs を合わせます。
    3. EOD の出力を検査する 2 D EOD のコント ローラーにテスト パターンを適用されます。下記 FPGA または関数発生器によって提供される簡単な正弦波でナイトツアー (図 2) を指定できます。ベスト パフォーマンスのため各偏向で偏向は圧電 nanopositioner の X または Y 方向に平行する必要があります。この方向は、トランス ミッション軸デフレクタの角度の方向によって決まります。たわみ方向を回転すると、2 D EOD を移動せず、ピエゾ nanopositioner 軸にたわみ軸を揃える 2 D EOD 後鳩プリズムを配置します。
  5. 半波長板のインストール
    1. 半波長板を配置 (図 1: W1) グラントムソン偏光板の間 (図 1: GP) と着信のレーザーに合わせて 2 D EOD 2D EOD のたわみ軸と偏光のビームします。2 D EOD 後長焦点レンズ (300 mm) を配置し、レーザーの焦点に sCMOS カメラを配置します。次に、騎士のツアー (図 2) 以下を生成する 2次元 EOD を入れます。半波長板を回してカメラの均等に正方形レーザ分布が観察されます。
  6. レンズのペアと中継レンズ組み合わせを費やすはりのインストール
    1. レンズのペアを配置 (図 1: L3 と L4) 対物レンズの背面の開口部に合わせてビームを展開する 2 D EOD 後 (図 1: OL) とレンズの別のペア (図 1: L5 と L6) に対物レンズに焦点面を中継します。必ずタグ レンズは、後の手順でそれらの間インストールされますとレンズのこれらの 2 つのペアの間の十分な余裕を確保してください。
  7. ダイクロイック フィルター、10/90 ビームスプリッター、フォーカシング レンズ、APD、対物レンズと蛍光発光フィルター検出経路を完了するインストールします。
    1. ダイクロイック フィルターをインストール (図 1: DC) 対物レンズに向かってレーザーを反映します。長いレンズの筒の上下に 2 つの菖蒲を使用する対物レンズの中心をまっすぐ通過するレーザーを合わせます。
    2. 10/90 ビームスプリッターをインストール (図 1: BS) によって光の 10% が、イメージング用 sCMOS カメラ (後述) と追跡のための APD を通過の 90% によって反映されます。
    3. APD を合わせます。対物レンズで観察にレーザーを集中します。Coverslip からリフレクションを使用して、目的の焦点で観察を置くと APD 読み出しの強度をチェックすべてダウン ストリーム要素を揃えます。ビームスプリッター後、レンズを中心に APD をインストール (図 1: L7) 3 D 変換段階で APD が続きます。目標からのレーザー反射レンズの中心を通るようなレンズを配置します。
APD の位置を上、レーザーの反射の強度を最大化する 3 D の位置を調整することによって最適化できます。APD の位置は、任意の方向に検出器位置の移動、強度が低下する最適な位置です。
  • Longpass 蛍光発光フィルターをインストール (図 1: F) ビームスプリッター反射・散乱光を削除する前に。
  • タグ レンズのインストール
    1. レンズの 2 つのペアのタグ レンズ (図 1間: L4 と L5) として前に言及し、図 1に示す。タグ センター レンズを垂直に通過するビームをヨー、ピッチ、高さおよび横の位置を調整します。

    • 2. 試料調製。

    1. 固定粒子の作製
      1. 190 nm の蛍光ビーズを希釈 〜 5 × 108ビーズ/mL の PBS の。圧電ステージのサンプル ホルダーに coverslip とマウントに 400 μ L ビーズ ソリューションを追加 (ビーズの量は、試料ホルダーに依存; ここで使用されるサンプル ホルダーの商工会議所の直径は 18 mm)。ここで使用されるビーズ、PBS によって発生する上、入金する粒子。
    2. 無料の移動粒子の作製
      1. 希釈する 110 nm の蛍光ビーズ 〜 5 × 108ビーズ/mL の DI 水で。観察に 400 μ L ビーズ ソリューションを追加し、圧電ステージのサンプル ホルダーにマウントします。

    3. トラッキング パラメーターを最適化します。

    1. ラスター スキャン固定粒子
      1. 顕微鏡に固定粒子サンプルを置きます。
      2. レーザー、マイクロポジショナー コント ローラー、ピエゾ nanopositioner コント ローラー、タグ レンズ コント ローラーおよび EOD コント ローラーを入れます。順序が重要ではないことに注意してください。閉ループにおける圧電 nanopositioner を実行します。
      3. ラスター スキャン プログラムを使用してカスタム スキャン ソフトウェア (図 S3、著者からの要求時に利用可能なソフトウェア)、騎士のツアー (図 2) で 2 D EOD をドライブ、APD からカウントを収集し、ドライブの圧電 XYZ のサンプルnanopositioner、位置計算 (図 S2) を実行するとします。ステップ サイズは 40 nm、スキャン範囲は 2 μ m。
        1. 目的のフォーカス、coverslip に配置、蛍光発光フィルターを削除し、マイクロポジショナーの Z 位置の機能として信号強度を最大化する、coverslip からレーザーの反射を使用します。後焦点面にサンプルを置くこと、蛍光発光フィルターを配置戻る。
        2. スキャナー用のプログラムを開きます。'開始'、'終了'、および 'ステップ' で数値を入力して、スキャン範囲とステップ サイズを設定します。最初大規模なスキャン範囲と粒子 (例えば、200 nm ステップ サイズ 10 × 10 μ m 幅) を検索する手順のサイズを設定します。粒子を検出、スキャン範囲を縮小、ステップ サイズ (例えば、100 nm ステップ サイズの 2 x 2 μ m 範囲) を減らします。蛍光フォーカスを見つけるために 3D ラスター スキャンを実行するには、'scan' をクリックします。
    2. タグ レンズの設定 (図 3を参照してください)
      1. タグ レンズ制御ソフトウェアをクリックします。順番を '接続'、'電源を入れます'] をクリックします。
      2. トリガー信号の出力の位相を変更するには、出力トリガー モードを変更する必要は。まずモードを 'RGB' から 'Multiplane' を変更し、それを戻します。今フェーズがすることができます (図 3 b) を変更します。
      3. 0 °、90 °、270 ° に出力の位相を設定します。経験的に動作するようにこれらの 3 つが見つかった位相空間をカバーする 3 つのフェーズを使用できますが (図 3 c)。
      4. 68,500 Hz の周波数設定を選択します。
      5. 最適な周波数を見つけることそれは周波数の検索範囲を変更する必要があります。'詳細'、'設定' をクリックします。変更、' Max。Freq(Hz)' 列の 0 には 70,000 Hz から 71,500 Hz の。これは、どのような周波数範囲が適切に調整できます。クリックして '校正を保存'、'Exit 校正' (図 3)。
      6. 新しいキャリブレーションを有効にするために、別の周波数 (たとえば、189,150 Hz) に共鳴を切り替え、68,500 Hz 周波数設定 (図 3e) に切り替えた。
      7. 35% に徐々 に振幅を変更します。「共鳴をロック」をクリックします。周波数がロックされている 'のロックを解除共鳴' (図 3 e) をクリックします。タグ レンズは今を使用する準備ができてです。
      8. F. 入力 x、y のスキャン範囲の調整、図 4 eで示すように、実際の位置に等しい位置推定に推定で使用されるパラメーターを変更して移動に XYZ のサンプルをスキャンする z 'scan' をクリック ボタン、粒子移動のレーザー スポット。粒子の位置レーザー フォーカスを介してスキャン位置推定ループ (図 S1) によって決定される推定のパーティクルの位置と一致します。推定位置と実際の位置 (図 4 d) との関係は、推定位置の画像 (図 4 階) から抽出できます。位置が同意しない場合は、位置推定ループ (図 S1) で使用されているレーザーの位置 (kc) の値を調整します。
      9. タグ レンズを揃える
        1. タグ レンズ コント ローラーがオフの場合、ラスター スキャン タグ レンズをインストールする前に、インストールのタグ レンズは同じに見える必要があります後を撮影した (後述) 粒子画像です。次に、位置やタグ レンズ (図 4) の角度を調整する z nanopositioner の目的を移動することによって走査蛍光粒子 Z スタックを実行します。Z 方向、Z 位置 (図 4 d) の関数として粒子の XY 位置に変更がないとき達成される XY 平面に粒子画像のドリフトがないタグ レンズの位置を調整します。追跡システムはタグ レンズの配置後に使用する準備ができています。
    3. SCMOS 粒子監視用カメラの設置
      1. 彼らは追跡されている間に粒子を可視化する sCMOS カメラを取り付けます。追跡システムのすべてのコンポーネントのインストールおよび最適化完了後にのみ、sCMOS をインストールします。
    顕微鏡に固定の蛍光粒子のサンプルを読み込むし、客観的焦点ボリュームの 1 つの粒子をロックする追跡プログラムを実行します。その後、100 ミリメートル焦点距離のレンズをインストール (図 1: L8) と sCMOS。粒子の画像は最小かつ最も明るいスポットに焦点を当てているので、sCMOS の位置を調整します。

    4 自由にナノ粒子を拡散リアルタイム 3 D トラッキング

    1. 無料入れて、110 nm は、顕微鏡の粒子サンプルを移動します。
    2. レーザー、マイクロ位置決めコント ローラー、ピエゾ nanopositioner コント ローラー、タグ レンズ コント ローラーおよび EOD コント ローラーを入れます。オープン ループで圧電 nanopositioner を実行します。3.2 の手順に従ってタグ レンズ ソフトウェアを設定します。
    3. 開き、追跡ソフトウェア (著者からの要求時に使用可能) を実行します。セクション 3 で発見された最適化された値に位置推定パラメーターを設定します。
    4. 目的のフォーカス、coverslip に配置、蛍光発光フィルターを削除し、マイクロポジショナーの Z 位置の機能として信号強度を最大化する、coverslip からレーザーの反射を使用します。Coverslip を見つけた後、coverslip からソリューションにレーザーを集中する焦点位置 15 μ m を増加します。場所は、蛍光発光フィルターをバックアップします。
    5. 積分制御定数を設定します。低値から開始して、パーティクルの位置読み出しの振動を見ることができるまで、ゆっくりと増やして、積分制御定数を設定できます。振動が観測されて、一度振動を引き起こす値の 80% に不可欠なコントロールの定数を設定します。典型的な値は、'積分ゲイン' XY の 0.012 と z '積分ゲイン' 0.004 前後になる予定します。
    6. 'トラックしきい値' と 'トラック最小' 追跡しきい値を設定し、'検索'、' 自動トラック ' をクリックして追跡実験を開始します。終端トラッキングのしきい値がバック グラウンド レベルよりわずかに高い設定し、トラッキングをトリガーのしきい値は背景に比べて約 2 倍。ここでは、追跡のトリガーのしきい値は 3 kHz で、軌道を終了するためのしきい値は、1.5 kHz。

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    結果

    固定粒子 (図 4) をスキャンと自由に拡散 110 nm 蛍光粒子追跡 (図 5) 上記のプロトコルを次に行った。同時にパーティクルの計算をする各ポイントでのスキャン位置を推定しながら圧電 nanopositioner と箱の光子を移動することによって粒子のスキャンを行ったでも強度 (図 4 a) の正方形で示し、推定位置 x...

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    ディスカッション

    3 D の単一粒子追跡方法の多くの品種は、近年浮上している堅牢なリアルタイムで追跡の簡単なセットアップと低い光子カウント料金で高速三次元拡散はまだ重要な生物学への応用を制限の挑戦問題。3 D DyPLoT メソッドは、いくつかの方法でこれらの課題をこのプロトコルのアドレスで説明します。まず、励起と検出経路はシンプルで堅牢な合わせを作る他の実装に比較して大幅簡素化します?...

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    開示事項

    著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

    謝辞

    この作品は、によって、国立医学研究所の一般的な受賞番号 R35GM124868 の下で健康の国民の協会のデューク大学にサポートされていました。

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    資料

    NameCompanyCatalog NumberComments
    2D Electro-optic Deflector ConOpticsM310A2 required
    Power supply for EODConOptics412Converts FPGA ouput to high voltage for EOD
    TAG  LensTAG OpticsTAG 2.0Used to deflect laser along axial direction
    XY piezoelectric nanopositionerMadCity LabsNano-PDQ275HSUsed for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in 
    Z piezoelectric nanoposiitonerMadCity LabsNano-OP65HSUsed to move the objective lens to follow the diffusing particle
    MicropositionerMadCity LabsMicroDriveUsed to coarsely position sample and evaluate
    Objective LensZeissPlanApoHigh numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss
    sCMOS cameraPCOpco.edge 4.2Used to monitor the particle's position
    APDExcelitasSPCM-ARQH-15Lower dark counts beneficial
    Field programmable gate arrayNational InstrumentsNI-7852r
    SoftwareNational InstrumentsLabVIEW
    Tracking excitation laserJDSUFCD488-30
    LensThorLabsAC254-150-A-MLL1
    LensThorLabsAC254-200-A-MLL2
    PinholeThorLabsP75SPH
    Glan-Thompson PolarizerThorLabsGTH5-AGT
    Half-wave plateThorLabsWPH05M-488WP
    LensThorLabsAC254-75-A-MLL3
    LensThorLabsAC254-250-A-MLL4
    LensThorLabsAC254-200-A-MLL5
    LensThorLabsAC254-200-A-MLL6
    Dichroic MirrorChromaZT405/488/561/640rpcDC
    Fluorescence Emission FilterChromaD535/40mF
    10/90 beamsplitterChroma21012BS
    PBSSigmaD8537
    190 nm fluorescent nanoparticlesBangs laboratoriesFC02F/9942
    110 nm fluorescent nanoparticlesBangs laboratoriesFC02F/10617
    CoverslipFisher Scientific12-545A
    PowermeterThorlabsPM100D
    CMOSThorlabsDCC1545M
    IrisThorlabsSM1D12D
    MicroscopeMad City LabsRM21

    参考文献

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