تصور داخل الخلايا المطوقة الاتجار بواسطة عمر Fluorescence التصوير المجهري

Summary

ويصف هذا البروتوكول أسلوب جديد يسمح للتصور الكمي من تشكيل معقدة من البروتينات الفخ، استناداً إلى نقل الطاقة الرنين فورستر، وعمر fluorescence التصوير المجهري.

Abstract

القابلة للذوبان ن-اثيلماليميدي الانصهار الحساسة البروتين (NSF) مرفق البروتين مستقبلات (الفخ) البروتينات هي المفتاح للغشاء الاتجار بالأشخاص، كما أنها تحفيز الانصهار غشاء داخل الخلايا حقيقية النواة. وتتكون الأسرة البروتين الفخ حوالي 36 عضوا مختلفة. طرق النقل داخل الخلايا المحددة هي تحفزها مجموعات معينة من البروتينات الفخ 3 أو 4 وبالتالي تسهم في خصوصية والإخلاص للاتجار بغشاء. ومع ذلك، دراسة دقيقة وظيفة البروتينات الفخ تقنيا تحدي، نظراً للافخاخ وفرة عالية ووظيفيا زائدة عن الحاجة، مع معظم الافخاخ لها متعددة ومهام متداخلة. ويرد في هذا البروتوكول، وأسلوب جديد للتصور من الفخ تشكيل المعقدة في الخلايا الحية. يستند هذا الأسلوب على الإعراب عن البروتينات الفخ ج-شفاء تنصهر فيها البروتينات الفلورية وقياس التفاعل بينهما بالطاقة الرنين فورستر نقل (بكى) عمر fluorescence توظيف التصوير المجهري (فليم). باحتواء رسوم بيانية عمر الأسفار مع نموذج تسوس متعددة المكونات، يسمح فليم الحنق (شبه-) تقدير كمي لجزء صغير تشكيل معقدة الفخ في حويصلات مختلفة. هذا البروتوكول قد تم تطبيقها بنجاح على تصور الفخ تشكيل معقدة في غشاء البلازما وفي مقصورات اندوسومال في خطوط خلايا الثدييات والخلايا المناعية الأولية، ويمكن تمديدها سهولة لدراسة مهام الفخ في العضيات الأخرى في الحيوان والنبات، والخلايا الفطرية.

Introduction

غشاء الاتجار هو سمة أساسية من خلايا حقيقية النواة، حيث غشاء الحويصلات برعم الخروج من عضية مانحة ثم الانتقال إلى وتلتحم مع^1،عضية هدف². باستثناء الميتوكوندريا، جميع الخطوات الانصهار الأغشية هي تحفزها أعضاء الأسرة^1،البروتين الفخ². وتتكون الأسرة البروتين كمين حوالي 36 عضوا في خلايا الثدييات وحوالي 20 عضوا في الخميرة². الفخ البروتينات تحتوي على واحد أو اثنين ~ 52 المخلفات-منذ فترة طويلة، وغير منظم أصلاً المناطق، تسمى الفخ-زخارف. غالباً ما يتم المربوطة البروتينات الفخ للأغشية قبل اللولب transmembrane طرفية ج^1،2. ويمكن تصنيف الافخاخ استناداً إلى بقايا المركزية أنها تسهم في كمين المعقدة في ارجينين (R) والجلوتامين (Q) الافخاخ^1،2. غشاء الانصهار تحركها التفاعل بين 3 أو 4 من الافخاخ المشابهة التي تسهم الفخ 4-زخارف معا وتوزع على كل من الجهات المانحة ويقبلون غشاء^1،2. يتكون مجمع فخ واحد الفخ آر عزر وثلاثة زخارف ف الفخ (يطلق عليها سؤال وجواب، Qb، ومراقبة الجودة). يبدأ تشكيل معقدة في N-تيرميني للفخ الزخارف، تشكل ما يسمى ترانس-الفخ-المعقدة، وتمضي نحو ج تيرميني، تشكيل مجموعة لفائف ملفوف α-حلزوني ضيق يسمى رابطة الدول المستقلة-الفخ-المعقدة. تستمر في الأغشية المانحين ويقبلون معا تشكيل معقدة حتى الفخ واحدة معقدة ويتغلب على الحاجز الطاقة للغشاء الانصهار³.

تعيين متميزة الفخ مجمعات لطرق النقل محددة داخل الخلايا هو التحدي غالباً من الناحية الفنية. على الرغم من وضوح تسهم الافخاخ خصوصية غشاء الاتجار بالأشخاص، هم مختلط، وظيفيا زائدة عن الحاجة، وتداخل وظائفها^1،2. وبسبب هذا، تجارب اضطراب استهداف الافخاخ، كما هو الحال بخروج المغلوب الجينات، تدخل الجيش الملكي النيبالي، والأخذ بعرقلة الأجسام المضادة، أو مع أجزاء الفخ القابلة للذوبان بوصفها السلبيات الغالبة، وكثيراً ما لا ينتج واضحة تعمل كغيرها تعويض الافخاخ^2،4. وعلاوة على ذلك، من الصعب التفريق بين الغشاء محددة الانصهار الخطوات التمهيدية الاتجار الأحداث، لأن الافخاخ التي يمكن أن تشارك في عدة طرق النقل². دراسات الترجمة من الافخاخ بالنهج مجهرية، باستخدام إيمونولابيلينج أو الانصهار الوراثية إلى البروتينات الفلورية مراسل، وتعاني من المشاكل التي: الافخاخ (ط) تحديد موقع على العضيات متعددة كما أنها كثيرا ما التوسط متعددة الخطوات الاتجار بالبشر، و (الثاني) تعريب بهم لا يعني تلقائياً كانوا يشاركون في تشكيل معقدة الفخ وظيفيا. أخيرا، يمكن تحديد المجمعات الفخ استخدام تجارب إيمونوبريسيبيتيشن باستخدام واحدة من الافخاخ كالطعم والأفخاخ الأخرى كأهداف، ولكن هذا لا يسمح بإحالة هذه المجمعات على العضيات محددة أو طرق الاتجار. وهكذا، في الوقت الراهن، هناك لا تقنية بديلة لتصور مجمعات الفخ مع القرار أورجانيلار. الفلورة ليس قادراً على إثبات التفاعلات الفخ ولكن يمكن أن تظهر فقط في وجود أو عدم وجود تعريب المشارك، بينما إيمونوبريسيبيتيشن فقط يمكن أن تظهر التفاعلات الفخ في كل خلية السكان ولكن عدم تعيين العضيات فيها هذه تحدث التفاعلات.

وللتغلب على هذه القصور، وضعت مؤخرا طريقة جديدة تسمح للتصور الكمي من مجمعات الفخ داخل الخلايا الحية بالقرار أورجانيلار فيربوجين et al. ⁵ يستند هذا الأسلوب في التعبير عن أزواج من الافخاخ مع طيفيا تحول البروتينات الفلورية تنصهر فيها على لوالب transmembrane ج-لا شفاء منها. بعد الانتهاء من الغشاء الانصهار وتشكيل رابطة الدول المستقلة-الفخ معقدة، وهذه فلوروفوريس في ج-تيرميني لوالب transmembrane فورا جنبا إلى جنب مع بعضها البعض. ثم يتم فلوروفوريس مسافة فورستر (عادة < 5 نانومتر)، مما أدى إلى الحنق من فلوروفوري الأخضر تحول الجهات المانحة إلى^5،فلوروفوري يقبلون تحول أحمر⁶. تآكل النتائج في تبريد fluorophore المانحين وزيادة انبعاث من fluorophore يقبلون الذي يمكن أن يقاس من نسب انبعاثات البلدان المانحة ويقبلون (راتيوميتريك بكى). ومع ذلك، راتيوميتريك الحنق بين اثنين من جزيئات مختلفة يمثل تحديا، بسبب الأسفار عبر الحديث ومختلف مستويات الافخاخ المانحين ويقبلون في العضيات المختلفة وبين الخلايا^7،8. ويمكن أيضا قياس الحنق من عمر الأسفار، وهو الوقت بين الإثارة وانبعاث الفوتون. إذا fluorophore المانحة يمكن الإفراج عن الطاقة بالحنق، هذه النتيجة العملية المتنافسة في الظاهر تقصير عمر الأسفار. وهذا يمكن أن يقاس فليم^7،8. عمر الحنق أقوى كثيرا من راتيوميتريك الحنق لقياس التفاعل بين اثنين من جزيئات مختلفة، كما عمر fluorescence خاصية ذاتية فلوروفوري وغير مبال بتركيزه. وعلاوة على ذلك، بكى أنه حسب تقريب الكمية، كفاءة الحنق تناسبا عكسيا مع القوة السادسة من المسافة بين فلوروفوريس المانحة ويقبلون (دالة خطوة أساسا). ولذلك، باحتواء رسوم بيانية في عمر fluorescence سجلتها فليم مع نموذج تسوس مزدوجة-المكون، يسمح فليم الحنق للتقدير (شبه-) الكمية لجزء صغير جزيئات الفخ تشارك في تشكيل معقدة كمين⁵.

في الآونة الأخيرة، استخدمت هذا الأسلوب فليم الحنق فيربوجين et al. لتصور تشكيل الفخ المعقدة في الخلايا الجذعية الابتدائي المناعي⁵. وقد تبين أن الخلايا الجذعية توجيهه عند مواجهة حافزا المسببة للأمراض، على غشاء الاتجار برفقة إلى زيادة من البروتين المرتبط حويصلة غشاء الفخ آر (الرقعة) 3 مع سينتاكسين سؤال وجواب-الفخ 4 على وجه التحديد غشاء البلازما. يرجح أن المطلوب تشكيل معقدة زيادة هذا الفخ لتلبية زيادة القدرة الافرازية لإفراز السيتوكينات الالتهابية مثل انترلوكين-6⁵. ويصف هذا البروتوكول التجريبي الخطوات اللازمة للحصول على البيانات فليم الحنق للقياس الكمي والتصور (شبه-) مجمعات الفخ.هو شرح كيفية تناسب المدرج الإحصائي عمر fluorescence كامل الخلية مع وظائف الاضمحلال الأسى أحادية وثنائية، أسفر عن عمر fluorescence الظاهر كتقدير كمي للتفاعلات الفخ. في هذا البروتوكول، خط الخلية هيلا المستخدمة على نطاق واسع ويستخدم كمثال، ولكن يمكن تمديدها الطريقة سهولة لدراسة المجمعات الفخ في الخلايا حقيقية النواة الأخرى.

Protocol

1-إعداد العينات المجهر

1. تنصهر فيها التعبير عن سؤال وجواب-الفخ سينتاكسين 4 مسيتريني (سينتاكسين 4-مسيتريني؛ فلوروفوري المانحة) وتنصهر VAMP3 R-الفخ إلى متشيري (VAMP3-متشيري)
   ملاحظة: أخرى الافخاخ مع البروتينات الفلورية تنصهر فيها على لوالب transmembrane ج-الطرفية يمكن أيضا استخدامها. بدلاً من مسيتريني-متشيري، كما يمكن أزواج يقبلون المانحة الأخرى fluorophores طيفيا المنفصلة المستخدمة (مثلاً، يفب الحراجية المعتمدة).
   1. تنمو خلايا هيلا وتقسيم خلايا هيلا 900,000 على مدى ثلاثة 35 مم الزجاج أسفل الأطباق الملائمة للفحص المجهري.
      ملاحظة: من حيث المبدأ، هذا البروتوكول يمكن تكييفها لأنواع الخلايا حقيقية النواة والاطباق مجهرية أخرى.
      1. الحفاظ على الثقافات الخلية هيلا في قوارير T75 مع 10 مل من ارتفاع الجلوكوز دولبيكو للمتوسطة "تعديل النسر" (دميم)، وتستكمل مع 10% مصل العجل الجنين (FCS) و 1% مضاد حيوي فطري (التي تحتوي على الامفوتريسين ب والبنسلين وستربتوميسين) عند 37 درجة مئوية و 5% أول أكسيد الكربون ₂ في حاضنة ثقافة خلية.
      2. تجديد في المتوسط مرتين في أسبوع وتقسيم الخلايا 01:10 مرة واحدة في أسبوع أو عندما تصل الخلايا إلى 85-90% كونفلوينسي جديدة T75 قوارير (500,000 الخلايا/قارورة، في المتوسط).
      3. إزالة دميم وتغسل مونولاييرس هيلا مرتين مع 8 مل مالحة مخزنة الفوسفات العقيمة (PBS) لمدة 3 دقائق.
      4. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني مع حمض الإيثيلين 2 مم (يدتا).
      5. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ في خلية ثقافة حاضنة وتحرض في وقت لاحق طفيفة قارورة لفصل خلايا هيلا من أسفل قارورة.
      6. طرد الخلايا مع 10 مل متوسطة ونقل التعليق إلى أنبوب 15 مل وإزالة قاسمة 10 ميليلتر للعد.
      7. تمييع قاسمة 1:1 مع 0.4% تريبان الأزرق وصمة عار وحساب الخلايا مع هيموسيتوميتير Bürker⁹.
         ملاحظة: عد المربعات اثنين 4 × 4 ومتعددة عدد الخلايا ب 10 آلاف لعدد خلايا/مل.
      8. بعد خلية العد، تأخذ الخلايا 900,000 من أنبوب 15 مل، تفرق بينهما عبر الأطباق أسفل الزجاج 3 (راجع الخطوة 1.1.1)، والتحضير تعداء.
   2. ترانسفيكت الخلايا انهانسر¹⁰ (انظر الجدول للمواد) مع بناء 4-مسيتريني سينتاكسين (المانحة فقط، نموذج #1)، سينتاكسين 4-مسيتريني جنبا إلى جنب مع VAMP3-مشري (نموذج رقم 2)، وسينتاكسين 3 تنصهر فيها (مسيتريني ومشري نموذج #3).
      ملاحظة: يمكن أيضا أن تستخدم¹¹أساليب تعداء الخلايا الأخرى. بناء جنبا إلى جنب في عينة #3 عنصر إيجابي لتقدير أقصر مدة يمكن (أي، بكى أ القصوى).
2. الخلايا بين عشية وضحاها في ارتفاع الجلوكوز دميم المتوفرة مع السفح 10% و 1% مضاد حيوي فطري في 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ في حاضنة ثقافة خلية الثقافة.
3. نضح دميم وتغسل الخلايا مرة واحدة مع خلية يعيش التصوير المتوسطة (140 ملم كلوريد الصوديوم، 2.5 ملم بوكل، 1.8 مم كاكل₂، 1 مم مجكل₂، 20 مم حبيس، pH = 7.4، موسم = 300؛ انظر الجدول للمواد) لمدة 2 دقيقة وبعد ذلك وضع الخلايا في تصوير جديدة المتوسطة.

2-تسجيل البيانات فليم

1. المكان عينة #2 تحت مجال وقت فليم مجهر [كنفوكل] مع مصدر إثارة نابض fluorophore المانحة (أي، مسيتريني) والحصول على البيانات وقت حلها. تبقى الخلايا عند 37 درجة مئوية مع مرحلة ساخنة.
   ملاحظة: المجهر [كنفوكل] المستخدمة في هذا البروتوكول هي مجهزة 63 × 1.20 نا الماء غمر هدف، ليزر ضوء أبيض نابض (80 ميغاهيرتز النبض، < مدة النبضة 100 ps)، أنبوب مضاعف فوتون (PMT)، وتيميكوريلاتيد واحدة فوتون العد (تكسبك ) نظام (انظر الجدول للمواد للإعداد المحددة المستخدمة). يمكن أيضا أن تكون مجاهر فليم الأخرى المستخدمة (مثلالثنائيات الانهيار واحد-فوتون (سباد) بدلاً من بمتس، واحد-الطول الموجي الليزر النبضي بدلاً من ليزر نابض الضوء الأبيض).
2. حدد خلية تتضمن التعبير المرئية مسيتريني والبروتينات الفخ المسمى مشري وتسجيل صورة [كنفوكل] 256 × 256 بكسل مع الإثارة المتزامنة لكلا فلوروفوريس قبل كل قياس فليم. خطوة بكسل من حوالي 2-fold أصغر من الحيود محدودة القرار المكانية المجهر (~ 200 nm) ينبغي استخدامها. مسيتريني، تثير في 516 نيوتن متر وجمع الانبعاثات من 521-565 نانومتر؛ مشري، تثير في الانبعاثات نانومتر وجمع 610 من 613-668 شمال البحر الأبيض المتوسط.
   ملاحظة: لا موقف الطائرة التصوير قريبة جداً من الجزء السفلي من الطبق (داخل ~ 2 ميكرومتر المسافة)، وهذا سيؤدي إلى ذروة تفكير في الرسم البياني عمر الأسفار. الإثارة المتزامنة من فلوروفوريس المانحة ويقبلون المفضل، وهذا ما يسمح للتغلب على هذه المشكلة المحتملة لحركة عينة. ومع ذلك، يمكن استخدام الإثارة متتابعة كذلك.
3. سجل صورة فليم عن طريق النقر فوق تشغيل فليم مع الصورة فليم يجري تسجيلها بنفس الأبعاد والقرار المكانية كالصورة [كنفوكل] سجلت في الخطوة 2، 2. سجل الفوتونات الصورة 50,000 على الأقل لتحليل فليم كامل الخلية، أو على الأقل 400 بيكسل الفوتونات. إلا تثير fluorophore المانحة مسيتريني ولا فلوروفوري يقبلون مشري، وهكذا تثير في 516 نانومتر وجمع الانبعاثات من 521-565 نانومتر.
4. كرر الخطوات من 2.1-2.3 لخلايا متعددة ونموذج #1 (المانحة فقط) ونموذج #3 (بناء جنبا إلى جنب مسيتريني-مشري) الأخرى.
5. تسجيل دالة رد صك (المتكامل). لحن monochromator كاشف الانبعاثات إلى الطول الموجي الإثارة (مثلاً، سجل الانبعاثات من 510-550 نيوتن متر) وسجل ثم صورة فليم مع تناثر مرة أخرى من زلة غطاء زجاج نظيفة بواسطة النقر فوق الزر تشغيل فليم. استخدام نفس الموجه الإثارة (516 nm) والليزر الطاقة المستخدمة لتسجيل بيانات الخلية في خطوات 2.1-2.4.
   ملاحظة: إذا كانت قمم متعددة مرئية في إطار الموارد المتكاملة أو إذا كان لا يمكن ضبطها مونوتشروماتورس الانبعاثات، إطار الموارد المتكامل يمكن أيضا أن تقاس مع إيجاد حل لصبغة الفلورسنت مع عمر فائق السرعة، على سبيل المثال fluorescence تبريد لصبغ العضوية في المشبعة مائي حل يوديد البوتاسيوم. وعلاوة على ذلك، ليس من دقة المطلوبة لتسجيل إطار الموارد المتكامل، لأنه يمكن أيضا تركيبها المنحدر تسوس المدرج الإحصائي الأسفار دون deconvolution من إطار الموارد المتكاملة. ومع ذلك، المتكامل تمكن من تصحيح للخصائص تستخدم للكشف عن فوتون توقيت ومما يجعل النوبات من رسوم بيانية عمر أكثر دقة.

3.تحويل التسجيلات فوتون للصور فليم

1. تحميل وتثبيت برنامج التحويل PT32ICS⁵.
   ملاحظة: يمكن أيضا أن تحلل من قبل البرامج الأخرى، بما في ذلك البرمجيات من العديد من الموردين مجهر البيانات مدى الحياة.
2. تكوين البرنامج PT32ICS.
   1. تعيين الحجم إلى 256 × 256 بكسل حجم الصورة عن طريق إعدادات | حجم.
   2. تعيين القناة 2 عن طريق إعدادات | حجم.
      ملاحظة: قناة انبعاث مسيتريني تعتمد حصرا على تكوين المجهر. قناة خاطئ سينتج صورة فليم مع لا الفوتونات (أي، أسود الصورة)، ونتيجة لذلك فارغة 'LifetimeTable.txt'--ملف. يمكن تحديد القناة الصحيح من خلال التجربة والخطأ.
   3. تعيين الإخراج إلى إيماجيج (xyz) (أو TRI2 (زيت)) لتوليد الصور فليم (الخطوة 3، 4).
3. اضغط على تحويل وتحميل آثار فوتون واحد أو أكثر (ملفات.pt3). لتحديد عدة آثار فوتون، إبقاء الضغط على المفتاح Ctrl .
   ملاحظة: تنسيق.ptu 64 بت أحدث يمكن أيضا تحويل.
4. التأكد من أن البرنامج PT32ICS يقوم بإنشاء الملفات التالية في نفس المجلد الذي يتم حفظ ملفات pt3 فيه: مكدس فوتون واحد كل.pt3 فوتون التتبع في صورة تنسيق قياسي الخلوي (.ics)، وملف صورة نقطية واحد لكل.pt3 فوتون التتبع (.bmp)، ملف نصي كل تحويل تتضمن معلومات (_Report.txt) عن الإحصاءات فوتون (أي، العدد الإجمالي للفوتونات في كل.pt3 فوتون التتبع، حل وقت كاشف)، وملف نصي ثاني كل تحويل (_LifetimeTable.txt) التي تحتوي على إجمالي الأسفار عمر المدرج الإحصائي في تنسيق المفصول لكل تتبع فوتون.pt3.
   ملاحظة: يمكن استخدام ملف.ics لواحد بكسل المناسب بغية توليد الصور فليم، على سبيل المثال مع TRI2 البرمجيات^،من¹²¹³ أو منحنى سليم تركيب المكتبة في "فيجي إيماجيج"^14،15. يمكن أيضا استخدام هذا الملف ل تحليل مطوار¹⁶، على سبيل المثال مع البرنامج المساعد "مطوار بوابات الزمن" لفيجي من سبيتشرون. ملف صورة نقطية يحتوي على أية معلومات مدى الحياة. يتم استخدام الملف النصي الثاني لتحليل فليم كامل الخلية في الخطوة 4.

4-تركيب Fluorescence عمر رسوم بيانية لتحليل فليم كامل الخلية

ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة (تركيب ديكونفولوتيد إطار الموارد المتكامل) برمجيات قادرة على تركيب ديكونفولوتيد. يمكن أن يتم تركيب منحدرات رسوم بيانية الأسفار دون deconvolution من إطار الموارد المتكاملة مع البرامج الأخرى، وكذلك.

1. فتح برنامج حاسوبي تحليل البيانات قادرة على احتواء مع deconvolution (جدول المواد) واستيراد الملف النصي الذي يحتوي على الرسم البياني لكل فوتون التتبع (_LifetimeTable.txt) عن طريق الملف | الاستيراد | واحد ASCII.
2. إعادة تنظيم الجدول أن يتم إطار الموارد المتكامل في العمود الثاني من الجدول (باستخدام نسخ و لصق). ضع إطار الموارد المتكاملة في العمود الثاني ب جوار قيم الوقت في العمود الأول ألف
3. تحديد نوعية آثار فوتون مسجل بتحديد كافة الأعمدة بالضغط على Ctrl + A وتحديد الأرض | لوحة متعددة | الفريق 9. غير أن تحليل آثار فوتون مع ذروة انعكاس عالية (الشكل 4F).
4. حدد كافة الأعمدة التي تحتوي على رسوم بيانية تسيطر على نوعية الحياة التي سيتم تركيبها فضلا عن إطار الموارد المتكامل في العمود B باستخدام Ctrl الرئيسية وتحميل التركيب غير الخطية عبر التحليل | ومن المناسب | منحنى غير الخطية تناسب | فتح مربع الحوار.
5. تحميل وظيفة تناسب ديكونفولوتيد (متوفر في التكميلية ملف 1) عن طريق إضافة هذه الوظيفة إلى تحليل البرمجيات (عبر الفئة | المعرف من قبل المستخدم | وظيفة | إضافة). حدد وظيفة احتواء ملف 'FLIM_convoluted_IRF.fdf'. هذه الدالة يناسب المدرج الإحصائي عمر الأسفار مع دالة تحلل أسي مونو ديكونفولوتيد مع إطار الموارد المتكاملة (أي، العمود الثاني في الجدول باء) (المعادلة 1):
   (المعادلة 1)
   مع تي في الوقت، τ fluorescence الظاهر عمر و ألف السعة y₀ الإزاحة.
   ملاحظة: خيار آخر لاحتوائه رسوم بيانية مدى الحياة مع وظيفة تناسب بي أسي (المعادلة 2):
   (المعادلة 2)
   عن طريق تحديد عمر المكون بطيء (τ₁) للجهات المانحة والشرط الوحيد (الخطوة 1.1.2: نموذج #1) وأن عنصر سريع (τ₂) إلى بناء جنبا إلى جنب (نموذج رقم 3)، وهذا ما يسمح تقدير جزء صغير من البروتينات الفخ في مجمع (F) من الاتساع بطء (أ₁) ومكونات سريعة (₂؛ انظر المناقشة؛ المعادلة 3):
   (المعادلة 3)
   تتوفر وظيفة احتواء الملف لتركيب بي أسي ديكونفولوتيد 'FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf' في التكميلية الملف 2.
6. حدد مزودة منحنيات | × نوع البيانات نفسه كإدخال البيانات.
   ملاحظة: سيؤدي هذا في مناسبة العاشر-محور مقياس المنحنيات المجهزة.
7. تناسب المنحنيات بالضغط على صالح.
   ملاحظة: هذا سيتم تحويل الاحتواء وإنشاء ورقة تقرير في الصفيف مع جدول يحتوي على إعمار الأسفار، والإزاحة، والاتساع. كما فإنه سيتم إنشاء ورقة بيانات مع منحنيات المجهزة والمتخلفات يصلح ل.

النتائج

ويرد الأساس المنطقي للفحص لقياس التفاعلات الفخ بالحنق فليم في الشكل 1. ج-تيرميني لوالب transmembrane المشابهة الفخ البروتينات تنصهر فيها زوج طيفيا تحول البروتينات الفلورية (مثلاً، مسيتريني ومشري). تشكيل رابطة الدول المستقلة-الفخ المعقدة على غشاء نتائج الانصهار في هذه البروتينات الفلورية تصبح فورا جنبا إلى جنب مع بعضها البعض، وتآكل. ويبين الشكل 2 الصور [كنفوكل] الممثل من خلايا هيلا معربا عن البروتينات الفخ المسمى فلوريسسينتلي. سيظهر خلية يعبرون عن سينتاكسين 4-مسيتريني (المانحة fluorophore) مع VAMP3-متشيري (fluorophore acceptor)، فضلا عن مراقبة ظروف الخلايا معربا عن بناء 4-مسيتريني سينتاكسين (المانحة فقط؛ لا الحنق) وسينتاكسين 3 تنصهر فيها كل مسيتريني فقط ومتشيري بالترادف (الحنق أ القصوى). ويبين الشكل 3 المصاحبة fluorescence عمر وفليم الصور المولدة بتركيب المدرج الإحصائي مدى الحياة لكل بكسل مع وظائف تحلل أسي مونو (الشكل 3 ألف–ب) و (وظائف تحلل أسي بي الشكل 3 - د)- الشكل 4A يظهر إطار الموارد المتكامل للإعداد لدينا تقاس بنثر مرة أخرى من الزجاج غطاء المجهر. في الشكل 4B–ه، الأسفار الممثل عمر المدرج الإحصائي الخلية كله تحليل فليم جنبا إلى جنب مع المصاحبة لتناسب تظهر المنحنيات لوظائف تحلل أسي مونو. 4F الرقم يظهر الرسم بياني عمر فلورسنت من تجربة مصورة قريبة جداً إلى سطح الزجاج غطاء المجهر، أسفر عن ذروة انعكاس بارز. يبين الشكل 4 الرسم بياني مدى حياة مع الممثل تتناسب مع دالة تحلل أسي بي.

رقم 1: مخطط للأساس المنطقي لتصور مجمعات الفخ بالحنق. (أ) نموذج الهيكلية من البروتين غشاء المرتبطة حويصلة الافخاخ (بروتين قاعدة البيانات 3HD7¹⁷) الخلايا العصبية (الرقعة) 2 (أزرق؛ R)، سينتاكسين 1 (الأحمر؛ قاسناري)، و SNAP25 (أخضر؛ ويحتوي على كل فكرة فخ Qb ومراقبة الجودة). ج-المحطة الحلزون ترانسميمبراني سينتاكسين-1 هو مترافق إلى مسيتريني (fluorophore المانحة؛ البروتين قاعدة البيانات 3DQ1¹⁸). ج-المحطة الحلزون ترانسميمبراني من VAMP2 هو مترافق إلى مشري (fluorophore يقبلون؛ البروتين قاعدة البيانات 2H5Q¹⁹). (ب) "مخطط لكمين" وساطة غشاء الانصهار أدى الحنق. بعد الانصهار الغشاء بتشكيل رابطة الدول المستقلة-الفخ معقدة، والأفخاخ مباشرة جنبا إلى جنب بعضها البعض أدى الحنق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: تعبير البروتينات الفخ تنصهر فيها البروتينات الفلورية. العمود الأول: fluorophore المانحين، متحمس في 516 نيوتن متر. العمود الثاني: fluorophore يقبلون، متحمس في 610 نيوتن متر. المانحة (أ) حالة فقط. صورة الممثل [كنفوكل] خلية هيلا معربا عن سينتاكسين 4-مسيتريني (fluorophore المانحة؛ الأخضر في دمج). قناة يقبلون (العمود الثاني) يبين الأسفار عبر الحديث. (ب) مراقبة سلبية (لا الحنق). صورة الممثل [كنفوكل] خلية هيلا معربا عن كلا سينتاكسين 4-مسيتريني مع VAMP3-مشري (fluorophore يقبلون؛ أرجواني في دمج). (ج) مراقبة إيجابية (الحنق أ القصوى). بناء الصورة [كنفوكل] الممثل من خلية هيلا معربا عن سينتاكسين 3-مسيتريني-مشري جنبا إلى جنب. علما بأن إشارة مسيتريني ومشري fluorescence إشارات هل لا تماما التداخل المحتمل بسبب مقاومة أقل من مسيتريني لتعويض تدهور بالمقارنة إلى مشري (انظر القسم المناقشة). فرنك بلجيكي: حقل مشرق. تغيير حجم أشرطة، 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: صور فليم لتشكيل معقد الفخ- (أ) الأسفار الممثل عمر الصور من الخلايا هو مبين في الشكل 2. الصور تم إنشاؤها بواسطة تحويل أولاً آثار فوتون المسجلة بنظام تكسبك (.pt3) للصورة الخلوي القياسية (.ics) باستخدام البرمجيات PT32ICS. مزودة بكسل واحد عمر fluorescence الصور ثم تم إنشاؤها باستخدام^12،البرمجيات TRI2¹³ مع مستوى العتبة من كثافة 15 – 100%، binning بكسل دائرية 7 ومونوكسبونينتيال المناسب خوارزمية (ماركوارت). اللون يشير إلى متوسط عمر الفلورسنت الظاهر. (ب) فليم الصور حيث كانت ملتف الصور مدى الحياة الفلورية (تظهر في لوحة A) مع شدة الأسفار من fluorophore المانحة مسيتريني (كما هو موضح في الشكل 2). وأجرى الالتواء مع فيجي ImageJ استخدام ماكرو مصنوعة خصيصا (انظر الجدول للمواد). (ج) عمر الأسفار والصور فليم الخلية هيلا معربا عن سينتاكسين 4-مسيتريني و VAMP3-مشري من لوحات ألف وباء، ولكن الآن مع المناسب مع منحنيات تحلل أسي ثنائية (مع عمر ثابت لشروط المراقبة؛ انظر الخطوة 4.4 في البروتوكول). تشير الألوان بكسل إلى كسور المقدرة و سينتاكسين 4 في مجمع مع VAMP3 (3 المعادلة). (د) تتناسب مع نفس الفريق ب، ولكن لاسي بي. وأجرى الالتواء مع فيجي ImageJ استخدام ماكرو مصنوعة خصيصا (انظر الجدول للمواد). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: كل خلية التحليل فليم. (أ) وظيفة رد الصك (المتكامل) الإعداد. إطار الموارد المتكاملة كانت تقاس باستخدام نثر مرة أخرى على الواجهة الزجاجية-المياه (باستخدام طبق مجهرية زجاج نظيفة التي تحتوي على المياه).(ب–ه) أسرة الخليوي المدرج الإحصائي مدى الحياة للخلايا هو مبين في الشكل 2 و الشكل 3. تم تجميع جميع الفوتونات الموجودة في الصور. المنحنيات ديكونفولوتيد مع إطار الموارد المتكاملة ومزودة بوظائف تحلل أسي مونو (المعادلة 1). لهذه الخلايا، تم الحصول على إعمار الأسفار من 2.82 ns (الخلايا معربا عن سينتاكسين فقط 4-مسيتريني؛ والمانحين فقط؛ والفريق ب)، 2.09 ns (الخلايا المشترك معربا عن سينتاكسين 4-مسيتريني مع VAMP3-مشري؛ الفريق ج)، و 2.08 ns (الخلايا معربا عن سينتاكسين 3- بناء الترادف مسيتريني-متشيري؛ مراقبة الحنق أ القصوى؛ لوحة د). وتظهر تطعيم نفس الرسوم البيانية، ولكن الآن مع مقياس لوغاريتمي المحور ص. تظهر اللوحة الإلكترونية تراكب منحنيات الاضمحلال من ألواح د ب (و) مثال على الرسم البياني عمر الفلورسنت سجلت قريبة جداً إلى السطح بكشف غطاء المجهر. هذه النتائج في ذروة انعكاس كبير (يصور بالمنطقة المظللة بالأصفر). (ز) نفس لوحة ج، لكن الآن المناسب مع منحنى تحلل أسي ثنائية مع عمر ثابت لظروف التحكم (راجع الخطوة 4.4 في البروتوكول). الاتساع السريع (A₁) وبطء (أ₂) مكونات كانت 14.42 و 0.01، على التوالي، أسفر عن جزء المقدرة من الافخاخ معقدة و 0.99 (3 المعادلة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التكميلية الملف 1. وظيفة الملف FLIM_convoluted_IRF اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية الملف 2. وظيفة الملف FLIM_convoluted_IRF_biexp اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

هذا البروتوكول يوضح استخدام فليم الحنق للتصور من الفخ التفاعلات بين سينتاكسين 4 و VAMP3 في الخلايا الحية من الحلة. 4 سينتاكسين بروتين سؤال وجواب-فخ غالباً تحديد موقع في غشاء البلازما حيث أنها تتوسط الرقابة^1،2،،من²⁰²¹. VAMP3 هو فخ آر الذي يوصف أساسا لتحديد موقع في إعادة تدوير المقصورات اندوسومال ويتوسط الاتجار إلى اندوسوميس الأخرى، وكذلك فيما يتعلق بغشاء البلازما^1،2،20. مع ذلك، يمكن مقايسة الحنق فليم سهولة تكييفها لدراسة البروتينات الفخ الأخرى. والشرط الوحيد أن تتضمن هذه الافخاخ اللولب ترانسميمبراني ج-طرفية، مما هو الحال بالنسبة لمعظم البروتينات الفخ ب أقصى^1،2. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تكييفها لتصور مجمعات الفخ في أي نوع من خلايا حقيقية النواة، بما في ذلك النباتات والخميرة البروتوكول هو موضح هنا. في هذا البروتوكول، استخدمنا تقصير عمر fluorescence fluorophore المانحة كمقياس للحنق. كنهج تكميلي، يمكن دراسة عمر fluorophore يقبلون، الذي يوفر دليلاً لا لبس فيه على أن نقل الطاقة الرنين يحدث لأنه يسبب انبعاث وعي مرحلة صعود متميزة.

حاليا، أسلوب فليم الحنق قد لا قادراً على تصور مجمعات الفخ في المقصورات الليزوزومية. لبناء 3-مسيتريني-مشري جنبا إلى جنب سينتاكسين، الأسفار مشري غالباً ما يمكن المتراكمة أكثر في منطقة جوكستانوكلير، التي يرجح أن يناظر المقصورات الليزوزومية، بينما إشارة مسيتريني أكثر وفرة في الخلوي هامش⁵. ولوحظ إلى تراكم جوكستانوكلير مماثلة من متشيري مسيتريني بالمقارنة مع، عندما كانت نفس الفخ البروتينات تنصهر فيها هذه البروتينات الفلورية شارك أعرب⁵. ليسوسوميس تتميز بدرجة حموضة منخفضة للغاية (< 4) وارتفاع نشاط الإنزيمات بروتيوليتيك. الأرجح بسبب تراكم جوكستانوكلير مشري مقاومة أعلى من fluorophore مشري لتعويض تدهور بالمقارنة مع فلوروفوري مسيتريني. ليس بسبب تبريد درجة الحموضة من مسيتريني، كما جوكستانوكلير تراكم متشيري كما يحدث عند تثبيت الخلايا⁵. وهكذا، تقنية فليم الحنق يقلل مقدار الحنق في مناطق جوكستانوكلير (الليزوزومية) وهذا يتطلب البروتينات مراسل الفلورية الأخرى التي تعيش ظروف قاسية داخل لومن lysosomes.

يسمح فليم الحنق من حيث المبدأ الحصول على تقدير (شبه-) كمية لجزء صغير الافخاخ في مجمع⁵. كما شرحنا في هذا البروتوكول، وهذا يتطلب تركيب رسوم بيانية عمر الأسفار مع وظائف تحلل أسي مزدوج (المعادلة 2)، حيث السعة للمكون سريعة غير متناسب إلى جزء صغير الافخاخ في مجمع ( المعادلة 3). بيد أن مثل هذه المناسب مع نموذج العنصر الثاني تحديا من الناحية التقنية. المناسب مع معلمات تناسب حرة متعددة (اثنين fluorescence عمر وهما ستريك) يتطلب عددا كبيرا جداً من الفوتونات، خاصة وأن المعلمات سوف تؤثر على بعضها البعض، وسوف تؤثر على الأخطاء الصغيرة في العمر ستريك ونائب بالعكس. للتغلب على هذه المشاكل المناسب، يمكن أن تكون ثابتة إعمار fluorescence المكون بطيئة إلى العمر من المانحين والشرط الوحيد (أي، لا بكى؛ فقط مسيتريني الحالية) وأن عنصر السرعة إلى عمر جنبا إلى جنب بناء ( بكى أ القصوى). ومع ذلك، هذا ينبغي أيضا تفسير بعناية، نظراً لإعمار الأسفار قد لا تكون هي نفسها كما هو الحال في هذه الدول المراقبة، ويمكن أن تنحرف بسبب أسباب متعددة (تبريد ذاتي، التوجه ثنائي القطب، والاختلافات في المكروية). عدة مجمعات الفخ مقربة (< 10 نانومتر) يمكن أن يسفر عن الحنق تعتمد على المسافة، المبدأ نفسه الذي يسمح الحنق تكون بمثابة "مسطرة جزيئي"، لكن في هذه الحالة، يحجب التحديد الكمي لمجمعات الفخ. وعلاوة على ذلك، تقدير كمي ليست دائماً مجدية، سبب الافخاخ المسمى تتنافس مع الافخاخ الذاتية (غير مسمى). نتيجة لذلك، مستوى التعبير الفخ المسمى مشري هو أحد المحددات رئيسية للنسبة المئوية الحنق⁵. وبسبب كل هذه المحاذير، من المستحسن لاحتوائه رسوم بيانية عمر الفلورسنت مع دالة تحلل أسي مونو (المعادلة 1). وهذا له ميزة أن أنها لا تتطلب أي معرفة مسبقة العمر وعمر الفلورسنت متوسط الظاهر الناتج يوفر مقياس صلبة للفخ إلى⁵.

ومع ذلك، من المتوقع أن كمية الحنق فليم التصوير بواسطة نماذج ملائمة المكون الثاني سيكون لها تطبيقات قوية في المستقبل. يمكن أن تنصهر الفخ-ترميز الجينات داخل الكروموسوم مع مراسل الفلورسنت البروتينات، على سبيل المثال قبل كريسبر/CAS9. هذا ينتج في وصفها الفلورسنت البروتينات الفخ الذاتية، مع مستويات البروتين الذاتية وأي خلفية من الافخاخ غير مسمى، ومما يسمح بتقدير كمي هادف لجزء صغير مجمعات الفخ بالحنق فليم. بينما مستويات التعبير الافخاخ الذاتية قد تكون منخفضة جداً وتعطي نيون إشارات منخفضة نسبيا، فمن المتوقع أن عددا كافياً من الفوتونات يمكن الحصول على، خاصة بالنسبة للخلية كله فليم (الذي يتطلب فقط بضع 1000 من الفوتونات). وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء هذه القياسات فليم الحنق مع أكثر حساسية أجهزة الكشف الضوئي الانهيار الجليدي الذي سيؤدي أيضا إلى أعلى fluorescence إشارات وإحصاءات فوتون أفضل.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine'	Addgene	ID 92422	Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).
Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry'	Addgene	ID 92423	Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).
Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry'	Addgene	ID 92426	Positive control for maximum achievable FRET.
Hela cells
35 mm glass bottom dishes	Willco Wells	HBST-3522	Other live cell imaging chambers will work as a substitute
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco, Life Technologies	31966-021
Fetal calf serum	Greiner Bio-one	758093
Antibiotic-antimycotic solution	Gibco, Life Technologies	15240-062	Pen/Strep will work as a substitute
Live cell imaging medium	Thermo Fisher Scientific	A14291DJ	Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented
Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective	Leica	SP8	Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used
Pulsed white light laser	Leica	SP8	Other pulsed laser sources can also be used
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system	PicoQuant	PicoHarp 300
PT32ICS conversion software			Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com
data analysis software programme capable of deconvolution	Originlabs	OriginPro 2016
Fiji ImageJ
Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity	Fiji ImageJ		Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com
Bürker Haemocytometer	VWR	630-1541
HeLa cells	ATCC	ATCC CCL-2
PBS	B Braun Melsungen  AG	362 3140
EDTA 2 mM	Merck	108417	CAS: 60-00-4
15 mL tubes	Greiner Bio-one	188271
Trypan blue	Sigma Aldrich	93595	CAS: 72-57-1
NEON cell electroporation device	Thermo Fisher Scientific	MPK5000S