Visualizing intracellulare rullante traffico da fluorescenza Lifetime Imaging microscopia

Riepilogo

Questo protocollo descrive un nuovo metodo che consente la visualizzazione quantitativa della formazione di complessi di proteine SNARE, basato sul trasferimento di energia per risonanza e la durata di fluorescenza imaging microscopia.

Abstract

Solubile N- ethylmaleimide sensibile della proteina (NSF) allegato proteina recettore (rullante) proteine di fusione sono la chiave per il traffico di membrana, come essi catalizzano la fusione della membrana all'interno delle cellule eucariotiche. Famiglia delle proteine SNARE è costituito da circa 36 diversi membri. Rotte di trasporto intracellulare specifico vengono catalizzate da specifici gruppi di 3 o 4 proteine SNARE che quindi contribuiscono alla specificità e fedeltà del traffico di membrana. Tuttavia, studiando la funzione precisa di proteine SNARE è tecnicamente impegnativo, perché le insidie sono molto abbondanti e funzionalmente ridondanti, con la maggior parte delle insidie avendo multipli e funzioni di sovrapposizione. In questo protocollo, è descritto un nuovo metodo per la visualizzazione della formazione del complesso SNARE in cellule vive. Questo metodo si basa su che esprimono le proteine SNARE C-terminale fuse a proteine fluorescenti e loro interazione di misura di energia di risonanza di Förster transfer (FRET) durata di fluorescenza impiegando imaging microscopia (FLIM). Montando gli istogrammi di corso della vita di fluorescenza con un modello di decadimento multicomponente, FRET-FLIM permette (semi-) stima quantitativa della frazione della formazione del complesso SNARE alle diverse vescicole. Questo protocollo è stato applicato con successo per prevedere la formazione del complesso SNARE alla membrana del plasma e alle endosomal scomparti in linee cellulari di mammifero e cellule del sistema immunitario primarie e può essere facilmente esteso per studiare funzioni rullante presso altri organelli in animale, pianta e cellule fungine.

Introduzione

Traffico di membrana è una caratteristica centrale delle cellule eucariotiche, dove vescicole di membrana bud fuori da un organello donatore e quindi spostarsi e fusibile con una destinazione organello^1,2. Fatta eccezione per i mitocondri, tutti questi passaggi di fusione della membrana vengono catalizzati dai membri della proteina SNARE famiglia^1,2. Famiglia delle proteine SNARE è costituito da circa 36 membri in cellule di mammiferi e circa 20 membri in lievito². Proteine SNARE contengono uno o due ~ 52 residui-lungo, in modo nativo non strutturate aree denominate SNARE-motivi. Proteine SNARE sono spesso legati alle membrane di un C-terminale dell'elica del transmembrane^1,2. Insidie possono essere classificati basato sui residui centrali che contribuiscono per il complesso SNARE in arginina (R) e glutammina (Q) insidie^1,2. Fusione della membrana è guidato dall'interazione di 3 o 4 insidie cognate che insieme contribuiscono 4 SNARE-motivi e sono distribuiti sopra il donatore e accettore della membrana^1,2. Un complesso SNARE è costituito da un motivo di R-rullante e tre motivi di Q-rullante (chiamati Qa, Qb e Qc). La formazione del complesso inizia alla N-termini di rullante-motivi, formando un cosiddetto trans-rullante-complessi e procede verso la C-termini, formando un fascio di arrotolato-arrotola α-elica stretto chiamato un cis-rullante-complesso. La formazione del complesso di persino un singolo complesso SNARE trascina le membrane donatore e accettore insieme e supera la barriera di energia per membrana fusion³.

Assegnazione di distinti complessi SNARE a vie di trasporto specifici all'interno delle cellule è spesso tecnicamente impegnativo. Sebbene insidie chiaramente contribuiscono alla specificità del traffico di membrane, sono promiscua, funzionalmente ridondanti e le loro funzioni si sovrappongono^1,2. Per questo motivo, esperimenti di perturbazione targeting insidie, come per knockout del gene, l'interferenza del RNA, l'introduzione del blocco anticorpi o con frammenti di rullante solubili che agiscono come dominanti negativi, spesso non risultano in fenotipi chiari come gli altri Insidie compensano^2,4. Inoltre, è difficile da differenziare passaggi fusione specifiche della membrana da eventi di traffici a Monte, perché insidie possono essere coinvolti in più percorsi di trasporto². Studi di localizzazione delle insidie di approcci di microscopia, utilizzando immunolabeling o fusione genetica di proteine reporter fluorescenti, soffrono di problemi che: (i) insidie individuare al più organelli come mediano spesso più traffici passi e (ii) loro localizzazioni non significano automaticamente che funzionalmente sono impegnati nella formazione del complesso SNARE. Infine, complessi SNARE possono essere identificati mediante esperimenti di immunoprecipitazione utilizzando una delle insidie come esca e altre insidie come obiettivi, ma questo non consente l'assegnazione di questi complessi di organelli specifici o rotte del narcotraffico. Così, attualmente, non esiste nessuna tecnica alternativa per visualizzare complessi SNARE con risoluzione organellari. Immunofluorescenza non è in grado di dimostrare le interazioni di rullante, ma può mostrare solo la presenza o l'assenza di co-localizzazione, mentre immunoprecipitazione può mostrare solo rullante interazioni in tutta la popolazione di cella ma non assegnare gli organelli dove questi verificarsi di interazioni.

Per superare queste limitazioni, un nuovo metodo che consente la visualizzazione quantitativa dei complessi SNARE all'interno di cellule vive con risoluzione organellari recentemente è stato sviluppato da Verboogen et al. ⁵ questo metodo è basato sull'espressione di paia di lacci con proteine fluorescenti spettralmente spostate fuse C-terminale a loro eliche transmembrane. Dopo il completamento della fusione della membrana e la formazione di un cis-rullante complesso, questi fluorofori alla C-termini delle eliche transmembrane immediatamente vengono accostate a vicenda. I fluorofori sono quindi ben all'interno della distanza di Förster (in genere < 5 nm), con conseguente FRET dal fluoroforo donatore verde-spostato al fluoroforo accettore rosso-spostato^5,6. FRET risultati nell'estinzione del fluoroforo donatore e un'aumentata emissione del fluoroforo accettore che può essere misurato dai rapporti dell'emissione donatore e accettore (raziometrici FRET). Tuttavia, raziometrico FRET tra due diverse molecole è impegnativo, a causa di livelli di cross-talk e diversi di fluorescenza del donatore e accettore insidie a diversi organelli e tra cellule^7,8. FRET può anche essere misurata dalla durata di fluorescenza, che è il tempo tra l'eccitazione e l'emissione di un fotone. Se il fluoroforo donatore può liberare la sua energia di FRET, questo risultato di processo concorrenti in un apparente accorciamento del ciclo di vita di fluorescenza. Ciò può essere misurata da FLIM^7,8. Durata FRET è molto più robusto di raziometrici FRET per misurare le interazioni tra due molecole diverse, come la durata di fluorescenza è una proprietà intrinseca di un fluoroforo ed è insensibile alla sua concentrazione. Inoltre, FRET è da approssimazione quantitativa, perché l'efficienza della FRET è inversamente proporzionale alla sesta potenza della distanza tra il donatore e accettore fluorofori (essenzialmente una funzione di passaggio). Quindi, montando gli istogrammi di vita di fluorescenza registrati da FLIM con un modello di decadimento doppio componente, FRET-FLIM consente la stima quantitativa (semi-) della frazione di molecole di rullante impegnati, la formazione del complesso SNARE⁵.

Recentemente, è stato utilizzato questo metodo di FLIM FRET da Verboogen et al. per visualizzare la formazione del complesso SNARE in cellule dendritiche primarie del sistema immunitario⁵. È stato dimostrato che, incontrando uno stimolo patogeno, cellule dendritiche reindirizzare loro traffico di membrane accompagnato da un complessante aumentata della proteina di membrana della vescicola-collegata di R-rullante (VAMP) 3 con il Qa-SNARE sintaxina 4 specificamente alla membrana del plasma. Questa maggiore formazione del complesso SNARE è probabilmente necessaria per soddisfare la maggiore capacità secretiva per la secrezione di citochine infiammatorie quali l'interleuchina-6⁵. Questo protocollo descrive le fasi sperimentali necessarie per l'acquisizione di FRET-FLIM dati per la visualizzazione e (semi-) misurazione quantitativa dei complessi SNARE.Viene spiegato come adattare gli istogrammi di vita di fluorescenza di cellule intere con mono - e bi-esponenziale funzioni di decadimento, conseguente la durata apparente fluorescenza come una stima quantitativa alle interazioni di rullante. In questo protocollo, la linea delle cellule HeLa ampiamente usato è utilizzata come esempio, ma il metodo può essere facilmente esteso per studiare complessi SNARE in altre cellule eucariotiche.

Protocollo

1. preparazione dei campioni microscopio

1. Espressione di Qa-SNARE sintaxina 4 fuso a mCitrine (sintaxina 4-mCitrine; fluoroforo donatore) e il R-rullante VAMP3 fusa a mCherry (VAMP3-mCherry)
   Nota: Altri Rullanti con proteine fluorescenti fuse a loro eliche transmembrane del C-terminale possono essere utilizzati anche. Invece di mCitrine-mCherry, altre coppie donatore-accettore di fluorofori spettralmente separati possono anche essere usato (ad es., CFP-YFP).
   1. Cellule HeLa di crescere e dividersi 900.000 cellule HeLa sopra tre 35 mm-diametro vetro fondo piatti per microscopia.
      Nota: In linea di principio, questo protocollo può essere adattato per altri tipi di cellule eucariotiche e piatti di microscopia.
      1. Mantenere le colture delle cellule HeLa in T75 boccette con 10 mL di glucosio elevato Dulbecco di medium dell'Aquila per volta (DMEM), supplementato con 10% siero fetale di vitello (FCS) e 1% antibiotico antimicotico (contenente amfotericina B, penicillina e streptomicina) a 37 ° C e 5% CO ₂ in un'incubatrice di coltura cellulare.
      2. Ricostituire il mezzo due volte a settimana e dividere le celle 01:10, una volta a settimana o quando le cellule raggiungono 85-90% confluenza al nuovo T75 boccette (500.000 cellule/boccetta, in media).
      3. Rimuovere il DMEM e lavare i monostrati di HeLa due volte con 8 mL di sterile tampone fosfato salino (PBS) per 3 min.
      4. Rimuovere il PBS e aggiungere 2 mL di PBS con acido etilendiamminotetracetico 2mm (ed).
      5. Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C e 5% di CO₂ in incubatrice della coltura cellulare e successivamente leggermente agitare la beuta per separare le cellule HeLa dalla parte inferiore del pallone.
      6. Lavare le cellule con 10 mL di medium, trasferire la sospensione in una provetta da 15 mL e rimuovere un'aliquota di 10 µ l per il conteggio.
      7. Diluire l'aliquota 1:1 con 0,4% trypan blu macchia e contare le celle con un emocitometro di Bürker⁹.
         Nota: Contare due 4x4 piazze e più il numero di cellulare di 10.000 per il numero di cellule/mL.
      8. Dopo cella contando, prendere 900.000 cellule dal tubo da 15 mL, li divide sopra i piatti di fondo di 3 vetro (Vedi punto 1.1.1) e preparare per la transfezione.
   2. Transfect le cellule di elettroporazione¹⁰ (Vedi Tabella materiali) con sintaxina 4-mCitrine costrutto (donatore solo, campione n. 1), sintaxina 4-mCitrine insieme VAMP3-mCherry (esempio n. 2) e sintaxina 3 fuso a sia mCitrine e mCherry ( Esempio n. 3).
      Nota: Altri metodi di transfezione delle cellule possono anche essere usato¹¹. Il costrutto di tandem in campione #3 è un controllo positivo per stimare la durata più breve si presenterebbe (cioè, massima si presenterebbe FRET).
2. Cultura che delle cellule durante la notte in alto glucosio DMEM fornito con 10% FCS e 1% antibiotico antimicotico a 37 ° C con 5% CO₂ in un'incubatrice di coltura cellulare.
3. DMEM di aspirare e lavare le cellule una volta con live cell imaging medio (140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 1mm MgCl₂, 20mm HEPES, pH = 7,4, mOsm = 300; Vedi Tabella materiali) per 2 min e successivamente posizionare le cellule nel fresco imaging medio.

2. registrazione dei dati FLIM

1. Posto n. 2 di campione sotto un microscopio confocale FLIM di dominio del tempo con una sorgente di eccitazione pulsato per il fluoroforo donatore (cioè, mCitrine) e acquisizione dati risolta nel tempo. Mantenere le cellule a 37 ° C con un piatto riscaldato.
   Nota: Il microscopio confocale utilizzato nel presente protocollo è dotato di un obiettivo a immersione in acqua NA 63 X 1,20, un laser a luce bianco (80 MHz pulsare, < durata impulso 100 ps), un tubo di fotomoltiplicatore (PMT) di fotoni e un Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC ) sistema (Vedi Tabella materiali per installazione specifico utilizzato). Altri microscopi FLIM possono anche essere usato (ad es., diodi di valanga del singolo-fotone (SPAD) invece di PMTs, singolo-lunghezza d'onda laser pulsati invece di un laser pulsato a luce bianca).
2. Selezionare una cella con espressione visibile della mCitrine e mCherry-etichettato proteine SNARE e registrare un'immagine confocale di 256 × 256 pixel con eccitazione simultanea dei due fluorofori prima di ogni misurazione di FLIM. Un passo del pixel di circa 2 volte più piccola di quanto la diffrazione limitata risoluzione spaziale del microscopio (~ 200 nm) dovrebbe essere usato. Per mCitrine, eccitare a 516 nm e raccogliere emissione da 521-565 nm; per mCherry, eccitare 610 nm e raccogliere emissione da 613-668 nm.
   Nota: Non non posizione l'imaging aereo troppo vicino alla parte inferiore del piatto (all'interno di ~ 2 µm di distanza), come questo si tradurrà in un picco di riflessione nell'istogramma di corso della vita di fluorescenza. Simultanea eccitazione del donatore e accettore fluorophores è preferito, come questo permette di superare il potenziale problema di movimento del campione. Tuttavia, eccitazione sequenziale può essere utilizzato come bene.
3. Record registrata un'immagine FLIM facendo Eseguire FLIM con l'immagine FLIM registrata con le stesse dimensioni e la risoluzione spaziale dell'immagine confocale al punto 2.2. Registrare i fotoni immagine almeno 50.000 per analisi FLIM di cellule intere, o almeno 400 fotoni/pixel. Solo eccitare il fluoroforo donatore di mCitrine e non il fluoroforo accettore di mCherry e così eccitare 516 nm e raccogliere emissione da 521-565 nm.
4. Ripetere i passaggi da 2.1-2.3 per più celle e per le altre campione n. 1 (solo donatore) e campione n. 3 (il costrutto di tandem mCitrine-mCherry).
5. Registrare una funzione di risposta dello strumento (IRF). Sintonizzare il monocromatore del rivelatore di emissione alla lunghezza d'onda di eccitazione (ad esempio, registrare emissioni da 510-550 nm) e quindi registrare un'immagine FLIM con dispersione indietro da un vetrino coprioggetto vetro pulito facendo clic sul pulsante Esegui FLIM. Utilizzare la stessa lunghezza d'onda di eccitazione (516 nm) e laser di potenza come utilizzato per registrare i dati di cella a passi 2.1-2.4.
   Nota: Se picchi multipli sono visibili in IRF o se il monocromatori di emissione non possono essere ottimizzato, l'IRF può anche essere misurata con una soluzione di colorante fluorescente con durata ultraveloce, per esempio estiguendo fluorescenza di un colorante organico in una satura acquoso soluzione di ioduro di potassio. Inoltre, non è strettamente necessario per registrare un IRF, perché la pendenza di decadimento degli istogrammi fluorescenza può anche essere montata senza deconvoluzione dell'IRF. Tuttavia, un IRF consente di correggere per le caratteristiche di temporizzazione del rivelatore del fotone utilizzato e quindi rende gli accoppiamenti degli istogrammi durata più accurato.

3.Conversione delle registrazioni del fotone a FLIM immagini

1. Scaricare e installare il software di conversione PT32ICS⁵.
   Nota: I dati di durata possono essere analizzati anche da altri software, tra cui software di diversi fornitori di microscopio.
2. Configurare il software di PT32ICS.
   1. Impostare la dimensione per dimensione 256 × 256 pixel tramite impostazioni | Dimensioni.
   2. Impostare il canale a 2 via impostazioni | Dimensioni.
      Nota: Il canale dell'emissione mCitrine dipende esclusivamente dalla configurazione del microscopio. Un canale sbagliato si tradurrà in un'immagine FLIM con nessun fotoni (cioè, nero immagine) e di conseguenza un vuoto 'LifetimeTable.txt'-file. Il canale corretto può essere identificato da trial-and-error.
   3. Impostare l'uscita di ImageJ (xyz) (o TRI2 (xyt)) per generare immagini FLIM (punto 3.4).
3. Premere convertire e caricare una o più tracce di fotone (file .pt3). Per selezionare più tracce di fotone, tenere premuto il tasto Ctrl .
   Nota: Il formato di .ptu 64 bit più recente può anche essere convertito.
4. Assicurarsi che il software di PT32ICS genera i seguenti file nella stessa cartella dove vengono salvati i file pt3: uno stack di fotone per .pt3 traccia di fotone in formato di immagine cytometry standard (ICS), file di una bitmap per la traccia di .pt3 fotone (BMP), un file di testo per conversione (_Report.txt) contenente le informazioni sulle statistiche di fotone (cioè, il numero totale di fotoni in ogni traccia del fotone di .pt3, la risoluzione di tempo del rivelatore) e un secondo file di testo per conversione (_LifetimeTable.txt) contenente il totale istogrammi di corso della vita di fluorescenza in formato delimitato da tabulazioni per ogni traccia del fotone di .pt3.
   Nota: Il file con estensione ICS può essere utilizzato per singolo pixel montaggio al fine di generare immagini FLIM, per esempio con TRI2 software^12,13 o la curva sottile montaggio libreria in FIJI ImageJ^14,15. Questo file può anche essere utilizzato per fasore analisi¹⁶, per esempio con il plugin di tempo Gated fasore per FIJI da Spechron. Il file bitmap non contiene nessuna informazione di vita. Il secondo file di testo viene utilizzato per l'analisi FLIM di cellule intere nel passaggio 4.

4. raccordo di istogrammi di vita di fluorescenza per l'analisi di cellule intere FLIM

Nota: Questo passaggio (riconducibili raccordo dell'IRF) richiede software in grado di raccordo riconducibili. Le piste degli istogrammi fluorescenza senza deconvoluzione dell'IRF di montaggio può essere fatto con altri software, come pure.

1. Aprire il programma di software analisi di dati in grado di montare con deconvoluzione (Tabella materiali) e importare il file di testo contenente l'istogramma per ogni traccia di fotone (_LifetimeTable.txt) via File | Importazione | Singola ASCII.
2. Riorganizzare la tabella tale che l'IRF è nella seconda colonna della tabella (mediante copia e Incolla). Posizionare l'IRF nella seconda colonna B accanto ai valori di tempo nella prima colonna A.
3. Determinare la qualità delle tracce registrate fotone selezionando tutte le colonne premendo Ctrl + A e selezionando trama | Multi-pannello | 9 pannello. Non analizzare le tracce di fotone con un picco di alta riflessione (Figura 4F).
4. Selezionare tutte le colonne contenenti gli istogrammi di qualità controllata vita che saranno montati così come l'IRF nella colonna B usando Ctrl chiave e caricare il montaggio non lineare tramite analisi | Montaggio | Curva non lineare Fit | Aprire la finestra di dialogo.
5. Caricare la funzione di forma deconvoluted (disponibile in 1 File supplementari) aggiungendo questa funzione al software di analisi (tramite categoria | Definito dall'utente | Funzione | Aggiungi). Selezionare il file di forma funzione 'FLIM_convoluted_IRF.fdf'. Questa funzione si inserisce gli istogrammi di corso della vita di fluorescenza con una funzione mono-esponenziale decadimento riconducibili con IRF (cioè, la seconda colonna B della tabella) (equazione 1):
   (Equazione 1)
   con t il tempo, τ la fluorescenza apparente vita, all'ampiezza e il y₀ l'offset.
   Nota: Un'altra opzione è per adattare gli istogrammi di vita con una funzione di forma bi-esponenziale (equazione 2):
   (Equazione 2)
   Fissando la durata del componente lenta (τ₁) per l'unica condizione di donatore (punto 1.1.2: esempio n. 1) e che del componente veloce (τ₂) per il costrutto di tandem (esempio n. 3), questo permette la stima della frazione di Proteine SNARE in complesso (F) le ampiezze del lento (A₁) e dei componenti veloce (A₂; si veda discussione; L'equazione 3):
   (Equazione 3)
   Il file di funzione adatta per montaggio bi-esponenziale riconducibili 'FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf' è disponibile in 2 File supplementari.
6. Selezionare montato curve | X tipo di dati come stesso come dati di Input.
   Nota: Questo si tradurrà in appropriato x-scala degli assi delle curve componibile.
7. Montare le curve premendo Fit.
   Nota: Questo convertirà la vestibilità e generare un 'foglio di relazione' nella matrice con una tabella contenente i corsi della vita di fluorescenza, offset e ampiezze. Genererà inoltre un foglio di dati con le curve di misura e i residui del fit.

Risultati

La spiegazione razionale del dosaggio per interazioni di rullante di FRET-FLIM di misura è illustrato nella Figura 1. La C-termini delle eliche transmembrane delle proteine SNARE cognate sono fusi a una coppia di proteine fluorescenti spettralmente spostate (ad es., mCitrine e mCherry). La formazione di un cis-rullante complesso sopra i risultati di fusione della membrana in queste proteine fluorescenti diventando immediatamente giustapposti a vicenda e FRET. La figura 2 Mostra immagini confocal rappresentative delle cellule HeLa esprimendo fluorescente etichettato proteine SNARE. Mostrato una cella esprimono la sintaxina 4-mCitrine (fluoroforo donatore) con VAMP3-mCherry (fluoroforo accettore), così come le condizioni di controllo delle cellule che esprimono solo la sintaxina 4-mCitrine costrutto (donatore solo; non FRET) e sintaxina 3 fuso a entrambi mCitrine e mCherry in tandem (maximal expectable FRET). La figura 3 Mostra l'accompagnamento fluorescenza durata e immagini FLIM generati inserendo gli istogrammi di corso della vita di ogni pixel con funzioni di decadimento mono-esponenziale (Figura 3A–B) e funzioni (decadimento bi-esponenziale Figura 3 - D). Figura 4A Mostra l'IRF della nostra impostazione misurato dallo scattering posteriore di un vetro di copertura del microscopio. In Figura 4B–E, istogrammi vita fluorescenza rappresentativo della cella intera analisi FLIM con accompagnamento fit curve per funzioni di decadimento mono-esponenziale sono illustrate. 4F figura viene illustrato un istogramma di vita fluorescente di un esperimento imaged troppo vicino alla superficie del vetro di copertura microscopio, risultante in un picco prominente riflessione. Figura 4 Mostra un istogramma di vita con il rappresentante in forma con una funzione di decadimento bi-esponenziale.

Figura 1: schema della logica per la visualizzazione di complessi SNARE di FRET. (A) modello strutturale della proteina di membrana della vescicola-collegata di insidie (proteina database 3HD7¹⁷) (VAMP) 2 neuronale (blu; R), sintaxina 1 (rosso; Qa-SNARE) e SNAP25 (verde; contiene sia un motivo di Qb - e Qc-rullante). Il C-terminale dell'elica del transmembrane di sintaxina-1 è coniugato a mCitrine (fluoroforo donatore; proteina database 3DQ1¹⁸). Il C-terminale dell'elica del transmembrane di VAMP2 è coniugato a mCherry (fluoroforo accettore; proteina database 2H5Q¹⁹). (B) schema di rullante mediata fusione della membrana con conseguente FRET. Dopo la fusione della membrana dalla formazione di un cis-complesso SNARE, le insidie sono giustapposti immediatamente a vicenda conseguente FRET. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: espressione di proteine SNARE fusa a proteine fluorescenti. Prima colonna: fluoroforo donatore, eccitato a 516 nm. Seconda colonna: fluoroforo accettore, eccitato a 610 nm. (A) donatore unica condizione. Confocale immagine rappresentativa di una cella di HeLa esprimendo la sintaxina 4-mCitrine (fluoroforo donatore; verde nell'Unione). Il canale di accettore (seconda colonna) Mostra il cross-talk di fluorescenza. (B) controllo negativo (nessun tasto). Confocale immagine rappresentativa di una cella di HeLa esprimendo entrambi sintaxina 4-mCitrine con VAMP3-mCherry (fluoroforo accettore; magenta a merge). (C) controllo positivo (maximal expectable FRET). Immagine rappresentativa confocal di una cella di HeLa esprimendo il tandem 3-mCitrine-mCherry sintaxina costruire. Si noti che il segnale di fluorescenza del mCitrine e mCherry segnali non aderisce più sovrapposizione, probabilmente a causa di una minore resistenza di mCitrine a degradazione lisosomiale rispetto al mCherry (Vedi sezione discussione). BF: campo luminoso. Scala bar, 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: immagini FLIM di formazione del complesso SNARE. (A) immagini di vita di fluorescenza rappresentativo delle cellule illustrate nella Figura 2. Le immagini sono state generate da prima convertire le tracce di fotone registrate da un sistema TCSPC (.pt3) per l'immagine cytometry standard (con estensione ICS) utilizzando il software PT32ICS. Singolo pixel montato vita di fluorescenza immagini poi sono stati generati utilizzando il software TRI2^12,13 con soglia da 15-100% di intensità, 7 circolare Pixelbinning e monoexponential algoritmo di adattamento (Marquardt). Il colore indica la durata media di fluorescente apparente. (B), FLIM immagini dove le immagini di vita di fluorescenza (mostrato nel pannello A) erano contorto con l'intensità di fluorescenza del fluoroforo donatore di mCitrine (illustrato nella Figura 2). La convoluzione è stata effettuata con FIJI ImageJ utilizzando una macro su ordine (Vedi Tabella materiali). (C) durata di fluorescenza e FLIM immagini della cellula HeLa che esprimono sia sintaxina 4-mCitrine e VAMP3-mCherry da pannelli A-B, ma ora con raccordo con curve di decadimento bi-esponenziale (con vite fissate le condizioni di controllo; vedere passo in 4,4 Protocol). I colori dei pixel indicano le frazioni stimate F di sintaxina 4 in complesso con VAMP3 (equazione 3). (D) come pannello B, ma per il bi-esponenziale in forma. La convoluzione è stata effettuata con FIJI ImageJ utilizzando una macro su ordine (Vedi Tabella materiali). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: cellula intera analisi FLIM. (A) la funzione di risposta dello strumento (IRF) del programma di installazione. L'IRF è stata misurata utilizzando la dispersione indietro sull'interfaccia vetro-acqua (usando un piatto di microscopia di vetro pulito contenente acqua).(B–E) Complesso delle cellule gli istogrammi di vita per le cellule mostrate in Figura 2 e Figura 3. Sono stati riuniti tutti i fotoni presenti nelle immagini. Le curve erano riconducibili con IRF e dotate di funzioni di decadimento mono-esponenziale (equazione 1). Per queste cellule, i corsi della vita di fluorescenza sono stati ottenuti di 2,82 ns (le cellule che esprimono solo sintaxina 4-mCitrine; donatore solo; pannello B), 2,09 ns (cellule cheesprimono sintaxina 4-mCitrine con VAMP3-mCherry; pannello C) e 2,08 ns (le cellule che esprimono la sintaxina 3 - mCitrine-mCherry tandem costruire; controllo FRET expectable massimale; pannello D). Gli intarsi Visualizza i grafici stessi, ma ora con scala logaritmica dell'asse y. Pannello E Mostra una sovrapposizione delle curve di decadimento dei pannelli B-D. (F) esempio di un istogramma di vita fluorescente registrato troppo vicino alla superficie del microscopio vetrini coprioggetto. Ciò provoca un picco di grande riflessione (raffigurato dall'area gialla ombreggiata). (G) stessa pannello C, ma ora opportuno con una curva di decadimento bi-esponenziale con vite fissa le condizioni di controllo (vedere punto 4.4 nel protocollo). Le ampiezze di digiuno (A₁) e lento (A₂) componenti erano 14,42 e 0,01, rispettivamente, risultante in una frazione di stimato di insidie nel complesso F di 0,99 (equazione 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementari 1. Funzione file FLIM_convoluted_IRF per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2. Funzione file FLIM_convoluted_IRF_biexp per favore clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Questo protocollo viene illustrato l'utilizzo del FLIM in apprensione per la visualizzazione delle interazioni SNARE sintaxina 4 e VAMP3 in cellule HeLa vive. Sintaxina 4 è una proteina di Qa-rullante localizzare prevalentemente sulla membrana plasmatica dove media esocitosi^1,2,20,21. VAMP3 è un R-rullante che principalmente è descritto per individuare a riciclare endosomal scomparti e media il traffico ad altri gli endosomi pure per quanto riguarda la membrana plasmatica^1,2,20. Tuttavia, il dosaggio di FRET-FLIM può essere facilmente adattato per lo studio di altre proteine SNARE. L'unica condizione è che queste trappole contengono un'elica transmembrana del C-terminale, che è il caso per la maggior parte delle proteine SNARE da lontano^1,2. Inoltre, il protocollo descritto qui può essere adattato per la visualizzazione dei complessi SNARE in qualsiasi tipo di cellula eucariotica, comprese piante e lievito. In questo protocollo, abbiamo usato l'accorciamento della vita di fluorescenza del fluoroforo donatore come una misura di FRET. Come un approccio complementare, della durata del fluoroforo accettore potrebbe essere esaminata, che fornisce la prova inequivocabile che trasferimento di energia di risonanza si verifica perché l'emissione sensibilizzato provoca una fase di netto aumento.

Attualmente, la tecnica FLIM FRET può non essere in grado di visualizzare complessi SNARE in compartimenti lisosomiale. Per il costrutto di 3-mCitrine-mCherry tandem sintaxina, la fluorescenza di mCherry si trovano spesso più accumulata in una zona di juxtanuclear, che probabilmente corrisponde ai compartimenti lisosomiale, considerando che il segnale di mCitrine è più abbondante nei cellulari periferia⁵. È stato osservato un accumulo di juxtanuclear simili di mCherry rispetto a mCitrine, quando le stesse proteine SNARE fuse a queste proteine fluorescenti erano co-espressi⁵. I lisosomi sono caratterizzati da un pH estremamente basso (< 4) e un'elevata attività degli enzimi proteolitici. L'accumulo di juxtanuclear di mCherry è probabilmente causato da una maggiore resistenza del fluoroforo mCherry a degradazione lisosomiale rispetto al fluoroforo mCitrine. Non è a causa di pH-tempra di mCitrine, come juxtanuclear accumulo di mCherry si verifica anche al momento della fissazione delle cellule⁵. Così, la tecnica FRET-FLIM sottovaluta la quantità di apprensione nelle regioni juxtanuclear (lisosomiali) e questo richiederebbe altre proteine reporter fluorescenti che sopravvivono ai termini duri all'interno dei lumen dei lisosomi.

FRET-FLIM in linea di principio permette di ottenere una stima quantitativa (semi-) della frazione di insidie nel complesso⁵. Come abbiamo spiegato in questo protocollo, ciò richiede il montaggio degli istogrammi di corso della vita di fluorescenza con funzioni di decadimento doppio-esponenziale (equazione 2), dove l'ampiezza della componente veloce è proporzionale alla frazione di insidie nel complesso ( L'equazione 3). Tuttavia, tale accessorio con un modello bi-componente è tecnicamente impegnativo. Raccordo con più parametri di forma gratuiti (due corsi della vita di fluorescenza e due ampiezze) richiede un numero molto grande di fotoni, soprattutto perché i parametri influenzano a vicenda e piccoli errori nel corso della vita influenzerà le ampiezze e vice versa. Per superare questi problemi di montaggio, le durate di fluorescenza del componente lenta possono essere fissate per la durata della condizione unico donatore (cioè, non FRET; solo mCitrine presenti) e quella del componente veloce alla durata del tandem costruire ( massima si presenterebbe FRET). Tuttavia, questo dovrebbe anche essere interpretato con cautela, perché le durate di fluorescenza non possono essere lo stesso come in questi stati di controllo e potrebbero deviare a causa di diverse ragioni (self-tempra, orientamento del dipolo, variazioni nel microambiente). Più complessi SNARE nelle immediate vicinanze (< 10 nm) può risultato in distanza-dipendente FRET, lo stesso principio che permette FRET essere utilizzato come un "righello molecolare", ma in questo caso, oscura la quantificazione di complessi SNARE. Inoltre, una stima quantitativa non è sempre significativa, perché le insidie con etichettate competono con endogeno SNAREs (senza etichetta). Di conseguenza, il livello di espressione di mCherry-labeled rullante è un determinante principale per la percentuale FRET⁵. A causa di tutti questi avvertimenti, si consiglia di montare gli istogrammi di vita fluorescente con una funzione di decadimento mono-esponenziale (equazione 1). Questo ha il vantaggio che non richiede alcuna conoscenza a priori dei tempi di vita e la vita fluorescente media apparente risultante fornisce una misura tinta per rullante complessanti⁵.

Tuttavia, si prevede che imaging FRET-FLIM quantitativo di modelli del due-componente raccordo avrà potenti applicazioni future. RULLANTE-codifica geni all'interno del cromosoma possono essere fuso con proteine reporter fluorescenti, ad esempio da CRISPR/CAS9. Questo provoca l'etichettatura fluorescente delle proteine SNARE endogene, con livelli di proteina endogena e senza sfondo delle insidie senza etichetta e quindi consente una stima quantitativa significativa della frazione di complessi SNARE di FRET-FLIM. Mentre i livelli di espressione delle insidie endogeni potrebbero essere piuttosto basso e dare relativamente basse segnali fluorescenti, si prevede che un numero sufficiente di fotoni possa essere ottenuto, soprattutto per l'intera cellula FLIM (che richiede solo pochi 1, 000s di fotoni). Inoltre, queste misurazioni FRET-FLIM possono essere eseguite con rivelatori di fotodiodo valanga più sensibili che comporterà anche i segnali di fluorescenza elevata e migliori statistiche di fotone.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine'	Addgene	ID 92422	Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).
Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry'	Addgene	ID 92423	Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).
Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry'	Addgene	ID 92426	Positive control for maximum achievable FRET.
Hela cells
35 mm glass bottom dishes	Willco Wells	HBST-3522	Other live cell imaging chambers will work as a substitute
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco, Life Technologies	31966-021
Fetal calf serum	Greiner Bio-one	758093
Antibiotic-antimycotic solution	Gibco, Life Technologies	15240-062	Pen/Strep will work as a substitute
Live cell imaging medium	Thermo Fisher Scientific	A14291DJ	Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented
Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective	Leica	SP8	Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used
Pulsed white light laser	Leica	SP8	Other pulsed laser sources can also be used
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system	PicoQuant	PicoHarp 300
PT32ICS conversion software			Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com
data analysis software programme capable of deconvolution	Originlabs	OriginPro 2016
Fiji ImageJ
Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity	Fiji ImageJ		Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com
Bürker Haemocytometer	VWR	630-1541
HeLa cells	ATCC	ATCC CCL-2
PBS	B Braun Melsungen  AG	362 3140
EDTA 2 mM	Merck	108417	CAS: 60-00-4
15 mL tubes	Greiner Bio-one	188271
Trypan blue	Sigma Aldrich	93595	CAS: 72-57-1
NEON cell electroporation device	Thermo Fisher Scientific	MPK5000S