Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Özet

Bu protokol bırakmak Förster rezonans enerji transferi ve floresan mikroskopi Imaging ömür boyu göre SNARE proteinlerin karmaşık oluşumu nicel görselleştirme için yeni bir yöntem açıklanır.

Özet

Ökaryotik hücrelerde membran füzyon katalizler çözünür N- ethylmaleimide hassas füzyon proteini (NSF) ek protein reseptörü (tuzak) proteinler membran kaçakçılığı için anahtar şunlardır. SNARE proteini aile 36 farklı üyeleri için oluşur. Belirli hücre içi ulaşım yolları böylece özgüllük katkıda 3 ya da 4 SNARE proteinler belirli kümelerini ve membran ticareti sadakat tarafından katalize. Çünkü tuzaklarına birden fazla olması ve işlevleri üst üste çoğu tuzaklarına ile son derece bol ve işlevsel olarak gereksiz, ancak, tuzak proteinlerin hassas işlev eğitim teknik olarak, meydan okuyor. Bu protokol için görselleştirme canlı hücrelerdeki SNARE karmaşık oluşumu için yeni bir yöntem açıklanır. Bu yöntem SNARE protein C-ölümcül floresan proteinler için erimiş ifade üzerinde temel alır ve onların etkileşim Förster rezonans enerji tarafından ölçme transfer (FRET) istihdam Floresans ömür mikroskobu (FLIM) görüntüleme. Floresans ömür boyu histogramlar özellikli bir uygulamasının çürüme yaklaştırarak, FRET-FLIM farklı veziküller (yarı-) kantitatif tahmini SNARE karmaşık oluşumu kısmını sağlar. Bu iletişim kuralı SNARE karmaşık oluşumu plazma zarı ve endosomal bölmeleri memeli hücre satırları ve birincil bağışıklık hücreleri görselleştirmek için başarıyla uygulandı ve SNARE işlevler diğer organelleri, çalışmaya kolayca genişletilebilir Hayvan, bitki ve mantar hücreleri.

Giriş

Membran kaçakçılığı nerede membran veziküller kapalı bir donör organel bud ve sonra taşımak ve bir hedef organel^1,2ile sigorta ökaryotik hücrelerin merkezi bir özelliktir. Mitokondri hariç, tüm bu membran füzyon adımları SNARE proteini aile^1,2üyeleri tarafından katalize. Memeli hücrelerinde yaklaşık 36 üye ve Maya²yaklaşık 20 üye SNARE proteini aile oluşur. TUZAK proteinler SNARE-motifler denilen bir veya iki ~ 52 artıkları-uzun, yerel olarak yapılandırılmamış bölgeler, içerir. TUZAK proteinler kez bir C-terminal transmembran heliks^1,2tarafından membranlar için gergin. Tuzaklarına katkıda bulundukları karmaşık tuzak arginin (R) ve glutamin (Q) tuzaklarına^1,2olarak Merkezi artıkları göre sınıflandırılabilir. Membran füzyon birlikte 4 SNARE-motifler katkıda bulunmak ve üzerinde donör ve alıcısı membran^1,2dağıtılan 3 ya da 4 soydaş tuzaklarına etkileşim tarafından tahrik edilmektedir. Bir tuzak kompleks bir R-tuzak motif ve üç Q-tuzak motifleri (kalite güvence, oyun kurucu ve Qc olarak adlandırılan) oluşur. Karmaşık oluşumu başlar SNARE-motifler, sözde transşekillendirme termini N-tuzak-karmaşık ve CISdenilen bir sıkı α-Helisel dolandı-bobin paket oluşturan C termini doğru gelirleri-tuzak-karmaşık. Hatta tek bir tuzak karmaşık karmaşık oluşumu donör ve alıcısı membranlar birlikte sürükler ve membran fusion³için enerji bariyeri üstesinden gelir.

Hücrelerin içindeki belirli ulaşım yolları ayrı SNARE kompleksleri atama kez teknik olarak zordur. Tuzaklarına açıkça kaçakçılığı membran özgüllük katkıda rağmen önüne gelenle yatıp kalkan, işlevsel olarak gereksiz olduğu ve bunların işlevlerini^1,2örtüşmesi. Bu nedenle, pertürbasyon deneyler tuzaklarına, gibi hedefleyerek gen nakavt, RNA müdahale, tanıtım antikorlar engelleme ya da baskın negatif hareket çözünür SNARE parçaları ile sık sık diğer açık fenotipleri neden değil Tuzaklarına telafi etmek^2,4. Ayrıca, tuzaklarına birden çok taşıma yolları²' dahil belirli membran füzyon adımları ters yönde kaçakçılığı olaylardan ayırt etmek zordur. Tuzaklarına yerelleştirme çalışmalarının mikroskobu yaklaşımlarla, immunolabeling veya floresan muhabir proteinler, genetik fusion kullanarak sorunları muzdarip bu: (i) tuzaklarına bulmak için birden fazla organelleri kez birden çok kaçakçılığı adımları ve (ii) arabuluculuk gibi onların yerelleştirmeler otomatik olarak işlevsel olarak tuzak karmaşık oluşumunda nişanlandıklarını anlamına gelmez. Son olarak, tuzak kompleksleri tuzaklarına birini kullanarak yem ve diğer tuzaklarına hedef olarak immunoprecipitation deneyler kullanılarak belirlenebilir ama bu özel organelleri veya ticaret yolları bu komplekslerin atama izin vermez. Böylece, şu anda, tuzak kompleksleri ile organellar kararlılık görselleştirmek için alternatif hiçbir tekniği yoktur. Ayirt SNARE etkileşimleri kanıtlamak mümkün değil ama sadece varlığı ya da yokluğu co yerelleştirme gösterebilir, immunoprecipitation sadece gösterebilir iken SNARE etkileşimler tüm hücre nüfus ama organelleri atamak değil nerede bunlar etkileşimler meydana gelir.

Bu sınırlamayı aşmak için tuzak kompleksleri organellar çözünürlük ile canlı hücrelerdeki nicel görselleştirme için izin veren bir roman yöntemi son zamanlarda Verboogen ve ark. tarafından geliştirildi ⁵ bu yöntemi C-ölümcül onların transmembran sarmal erimiş hayalice değiştirdi floresan proteinler ile tuzaklarına çiftlerini ifade üzerinde temel alır. Membran fusion ve CISoluşumu tamamlanmasından sonra-karmaşık tuzak, bu fluorophores C-termini transmembran sarmal, hemen birbirine bitişik. Fluorophores sonra iyi Förster mesafesindedir (genellikle < 5 nm), sonuçlanan FRET yeşil kaymıştır donör fluorophore gelen kırmızı kaymıştır alıcısı fluorophore^5,6. Donör fluorophore ve donör ve alıcısı emisyon (ratiometric perde) oranları ölçülebilir alıcısı fluorophore artan bir emisyon Şoklama sonuçlarındaki FRET. Ancak, ratiometric iki farklı molekül arasında perde, Floresans donör ve alıcısı tuzaklarına farklı organelleri ve hücreleri^7,8arasında çapraz-hadis ve farklı düzeylerde nedeniyle meydan okuyor. PERDE uyarma ve bir foton emisyon arasındaki zamanı Floresans Lifetime ölçülebilir. Donör fluorophore enerjisini tarafından serbest bırakabilirsiniz Eğer FRET, belirgin bir kısalma Floresans ömür boyu rakip bu işlem sonucu. Bu FLIM^7,8tarafından ölçülebilir. Ömür boyu perde perde ratiometric çok daha sağlam Floresans ömür boyu bir fluorophore, içsel bir özelliktir ve onun konsantrasyon için büyük küçük harf duyarlı olarak iki farklı molekül, arasındaki etkileşimler ölçmek için. Ayrıca, FRET yaklaşım nicel, çünkü FRET verimliliğini donör ve alıcısı fluorophores (aslında bir basamak fonksiyonu) arasındaki mesafe altıncı gücüne ters orantılıdır. Bu nedenle, bir çift bileşenli çürüme modeli ile FLIM tarafından kaydedilen Floresans ömür boyu histogramlar yaklaştırarak, FRET-FLIM (yarı-) kantitatif tahmini SNARE karmaşık oluşumu⁵' te nişanlı SNARE moleküllerin fraksiyonunun için sağlar.

Son zamanlarda, bu perde-FLIM yöntemi Verboogen vd tarafından kullanıldı SNARE karmaşık oluşumu birincil dendritik hücreler bağışıklık sistemi⁵görselleştirmek için. Bu patojen bir uyarıcı gelince, dendritik hücreler kendi membran ile özellikle, Qa-tuzak sözdiziminin 4 R-tuzak vezikül ilişkili membran proteini (VAMPİR) 3 artan bir kompleks eşliğinde ticareti yeniden yönlendirme olduğunu gösterildi Plazma zarı. Bu artan SNARE karmaşık oluşumu büyük olasılıkla İnterlökin-6⁵gibi inflamatuar sitokinlerin salgılanmasını artmış salgı kapasitesini karşılamak için gereklidir. Bu iletişim kuralı SNARE kompleksleri görselleştirme ve (yarı-) kantitatif ölçüm için FRET-FLIM veri edinimi için deneysel adımları açıklar.Bu nasıl için bütün hücreli Floresans ömür boyu histogramlar SNARE etkileşimlerine belirgin Floresans ömür boyu nicel bir tahmin olarak sonuçlanan mono ve BI üstel çürüme işlevleriyle uygun açıklanmıştır. Bu iletişim kuralı, yaygın olarak kullanılan HeLa hücre örnek olarak kullanılır, ancak yöntem SNARE kompleksleri diğer ökaryotik hücrelerde çalışma için kolayca genişletilebilir.

Protokol

1. mikroskop örnekleri hazırlanması

1. Qa-tuzak sözdiziminin 4 ifade mCitrine (sözdiziminin 4-mCitrine; donör fluorophore) erimiş ve R-tuzak VAMP3 mCherry (VAMP3-mCherry) erimiş
   Not: Diğer tuzaklarına onların C-terminal transmembran sarmal erimiş floresan proteinler ile de kullanılabilir. MCitrine-mCherry yerine hayalice ayrı fluorophores diğer donör-alıcısı çiftlerini de kullanılan (örneğin, CFP-YFP) olabilir.
   1. HeLa hücreleri büyümek ve üç 35 mm çaplı cam alt yemekleri mikroskopi için uygun üzerinden 900.000 HeLa hücreleri bölmek.
      Not: ilke olarak, bu iletişim kuralı diğer ökaryotik hücre tipleri ve mikroskopi yemekleri için adapte edilebilir.
      1. T75 Şişeler 10 mL Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM), % 10 fetal buzağı serum (FCS) ve % 1 antibiyotik antimycotic (içeren Amfoterisin B, penisilin ve streptomisin) 37 ° C'de ve % 5 ile desteklenmiş yüksek glikoz ile HeLa hücre kültürleri korumak CO ₂ hücre kültür kuluçka.
      2. Orta haftada iki kez doldurmak ve hücreleri 1:10 haftada bir kez veya hücreleri confluency yeni T75 şişeler (500.000 hücreler/flask, ortalama) % 85-90 ulaştığınız zaman bölünmüş.
      3. DMEM kaldırmak ve HeLa monolayers 8 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) 3 dakika ile iki kez yıkayın.
      4. PBS kaldırın ve PBS 2 mL 2 mM ethylenediaminetetraacetic asitle (EDTA) ekleyin.
      5. Hücreleri hücre kültür kuluçka 37 ° C ve % 5 CO₂ 5 min için kuluçkaya ve daha sonra hafifçe şişeye HeLa hücreleri balonun altından ayırmak için tahrik.
      6. Orta 10 mL ile hücreleri temizlemek, süspansiyon 15 mL tüp aktarmak ve sayımı için 10 µL aliquot kaldırmak.
      7. Aliquot 1: %0,4 trypan mavi leke ile 1 sulandırmak ve Bürker hemasitometre⁹hücreleri saymak.
         Not: 10.000 hücre/mL sayısı için tarafından iki 4 x 4 kareler ve birden çok hücre sayı saymak.
      8. Sonra sayım 15 mL tüp almak 900.000 hücreleri hücre (bkz. Adım 1.1.1) 3 cam alt yemekleri onları bölmek ve transfection için hazır olun.
   2. Hücre çoğalmasıyla¹⁰ tarafından transfect ( Tablo malzemelerigörmek) sahip sözdiziminin 4-mCitrine yapı (yalnızca, donör Örnek #1), sözdiziminin 4-mCitrine VAMP3-mCherry (örnek 2) ve sözdiziminin 3 ile birlikte erimiş mCitrine ve mCherry () için Örnek 3).
      Not: Diğer hücre transfection yöntemleri de kullanılan¹¹olabilir. Örnek #3 tandem inşa kısa ömrü expectable (Yani, maksimal expectable perde) tahmin etmek için olumlu bir denetimdir.
2. Yüksek glikoz % 10 FCS ve antibiyotik-antimycotic % 5 CO₂ hücre kültür kuluçka 37 ° C'de % 1 ile birlikte gelen DMEM hücreleri gecede kültür.
3. DMEM Aspire edin ve bir kez canlı hücre orta Imaging hücrelerle yıkayın (140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 20 mM HEPES, pH 7.4, mOsm = 300 =; Tablo reçetesibakın) 2 min için ve daha sonra hücreleri taze görüntülemede yer Orta.

2. veri yazmak için FLIM

1. Yer Örnek #2 saat-alan FLIM confocal mikroskop altında pulsed uyarma kaynağı ile donör fluorophore (örneğin, mCitrine) ve zaman çözülmüş veri toplama için. Isıtmalı bir sahne ile 37 ° C'de hücreler tutmak.
   Not: Bu protokol için kullanılan confocal mikroskop bir 63 X 1,20 NA su daldırma amacı ile de, bir beyaz ışık lazer bulunuyor (80 MHz darbe, < 100 ps darbe süresi), bir foton çarpanı tüp (PMT) ve bir Time-Correlated tek foton sayma (TCSPC ) sistemi ( Tablo malzemeler kullanılan özel kurulum için bakınız). Diğer FLIM mikroskoplar kullanılan (örneğin, PMTs, tek dalga boyu pulsed lazerler bir beyaz ışık pulslu lazer yerine yerine tek foton çığ diyotlar (SPAD)) da olabilir.
2. MCitrine ve mCherry etiketli SNARE proteinler görünür ifadesi içeren bir hücreyi seçin ve her FLIM ölçü önce her iki fluorophores aynı anda uyarma 256 × 256 piksel olan confocal bir resmi kaydetmek. Yaklaşık 2 kat kırınım mikroskop Uzaysal çözünürlük sınırlı daha küçük bir piksel adım (~ 200 nm) kullanılmalıdır. 516 nm ve 521-565 nm toplamak emisyon mCitrine için heyecanlandırmak; 613-668 nm 610 nm ve toplamak emisyon, mCherry için heyecanlandırmak.
   Not: görüntüleme uçak çok yakın çanak alt konum yapmak (içinde ~ 2 µm mesafe), bu bir yansıma tepe Floresans ömür boyu histogram da yol açar. Bu örnek hareket olası sorunu aşmak için donör ve alıcısı fluorophores eşzamanlı uyarma tercih edilen, önemlidir. Ancak, sıralı uyarma de kullanılabilir.
3. Kayıt aynı boyutlara ve confocal resmi olarak Uzaysal çözünürlük ile kaydedilen FLIM görüntü ile Çalıştırmak FLIM tıklayarak bir FLIM görüntü adım 2.2. Bütün hücre FLIM çözümleme veya en az 400 fotonlar/piksel görüntü en az 50.000 fotonlar kaydedin. Sadece mCitrine donör fluorophore ve değil mCherry alıcısı fluorophore heyecanlandıracak ve böylece 521-565 nm 516 nm ve toplamak emisyon, heyecanlandırmak.
4. Çoklu hücrelerdeki ve diğer örnek #1 (sadece donör) ve örnek #3 (mCitrine-mCherry tandem yapı) 2.1-2.3 adımları yineleyin.
5. Bir enstrüman yanıt işlevi (IRF) kaydedin. Uyarma dalga boyu (örneğin, 510-550 nm kayıt emisyon) için emisyon dedektörü monokromatör ayarlamak ve sonra geri bir temiz cam kapak kayma FLIM Çalıştırdüğmesini tıklatarak saçılma ile bir FLIM görüntü kaydetmek. Aynı uyarma dalga kullanın (516 nm) ve lazer gibi adımlar 2,1-2.4 hücre veri kaydetmek için kullanılan güç.
   Not: birden fazla doruklarına IRF içinde görünür durumdaysa ya da emisyon monochromators ayarlı, IRF da floresan boya ile ultrafast ömür boyu, bir çözüm ile örneğin bir organik boya ile doymuş bir sulu Floresans Şoklama tarafından ölçülebilir Potasyum iyodür çözüm. Ayrıca, Floresans histogramlar çürüme eğimi de IRF deconvolution monte edilebilir çünkü bir IRF kaydetmek için kesinlikle gerekli değildir. Ancak, bir IRF kullanılan foton dedektörü zamanlama özellikleri için düzeltmek için sağlar ve böylece ömür boyu histogramlar krizleri daha doğru olmasını sağlar.

3.Foton kayıtları FLIM görüntülere dönüştürme

1. Karşıdan yükleyip PT32ICS dönüşüm yazılım⁵.
   Not: Ömür boyu veri da bilgisayar yazılımı--dan çeşitli mikroskop satıcılar da dahil olmak üzere diğer yazılımlar tarafından analiz edilebilir.
2. PT32ICS yazılım yapılandırın.
   1. 256 × 256 piksel görüntü boyutu Ayarları üzerinden boyutu ayarlamak | Boyutu.
   2. 2 ayarları kanal ayarla | Boyutu.
      Not: Kanal mCitrine emisyon sadece mikroskop yapılandırmasına bağlıdır. Hatalı bir kanal bir FLIM görüntü yok fotonlar (Yani, siyah görüntü) ve sonuç olarak boş bir 'LifetimeTable.txt' neden olur-dosya. Doğru kanal deneme-yanılma tarafından tespit edilebilir.
   3. ImageJ (xyz) için Çıkış ayarla (veya TRI2 (xyt)) FLIM görüntüleri (Adım 3.4) oluşturmak için.
3. Convert tuşuna basın ve bir veya daha fazla foton izlemeler (.pt3 dosyaları) yükleyin. Birden fazla foton izleme seçmek için Ctrl tuşunu basılı tutun.
   Not: Daha yeni 64 bit .ptu biçimi de dönüştürülebilir.
4. PT32ICS yazılım pt3 dosyalarının kaydedildiği yer olarak aynı klasörde aşağıdaki dosyaları oluşturur emin olmak: bir foton yığın .pt3 foton izlemesinde resim sitometresi standart biçimi (.ics), .pt3 foton izleme (.bmp) her bir bit eşlem dosyası, metin dosyası dönüşüm başına ücret (_Report.txt) içeren bilgi içeren toplam foton istatistikleri (Yani, her .pt3 foton izleme, zaman çözünürlüğü Dedektör fotonlar toplam sayısı) ve ikinci bir metin dosyası dönüştürme (_LifetimeTable.txt) başına Floresans ömür boyu çubuk grafikler her .pt3 foton izleme için sekmeyle ayrılmış biçimde.
   Not: .ics dosyası FLIM görüntülerle, örneğin TRI2 yazılım^12,13 ya da Kütüphane FIJI ImageJ^14,15dakika sonra uygun ince eğri oluşturmak için uygun tek piksel için kullanılabilir. Bu dosyayı da Fazör analiz¹⁶için örneğin FIJI Spechron üzerinden zaman Gated Fazör eklentisi ile kullanılabilir. Bit eşlem dosyası ömür boyu bilgiler içermez. İkinci metin dosyası 4. adımda bütün hücreli FLIM analizi için kullanılır.

4. uygun floresan ömür boyu histogramlar bütün hücreli FLIM analizi için

Not: Bu adımı (deconvoluted provası IRF) yazılımı deconvoluted provası kapasitesine sahiptir gerektirir. IRF deconvolution olmadan Floresans histogramlar yamaçları uygun diğer yazılımlar ile de yapılabilir.

1. Veri analizi yazılım programı deconvolution (Malzeme tablo) ile uygun yetenekli açın ve her foton izleme (_LifetimeTable.txt) dosya üzerinden için çubuk içeren metin dosyası alma | Alma | Tek ASCII.
2. IRF ( Kopyala ve Yapıştırkullanarak) tablonun ikinci sütununda öyle ki tabloyu yeniden düzenlemek. IRF ikinci sütununda B a ilk sütunundaki zaman değerleri yanında yer
3. Ctrl + A tuşlarına basıp arsa seçerek tüm sütunları seçerek kaydedilen foton izlemeler kalitesini belirlemek | Paneli çoklu | 9 paneli. Foton izleri bir yüksek yansıma tepe (şekil 4F) ile analiz etmiyorsun.
4. Seçin Ctrl kullanarak B sütunundaki IRF yanı sıra monte edilebilir kalite kontrollü ömür boyu çubuk grafikler içeren tüm sütunları anahtar ve doğrusal olmayan uydurma analiz üzerinden yüklemek | Uygun | Doğrusal olmayan eğri Fit | Açık iletişim.
5. Analiz yazılımı için bu işlev ekleyerek deconvoluted uygun işlev ( ek dosya 1' kullanılabilir) yük ( Kategori üzerinden | Kullanıcı tanımlı | İşlev | Ekle). 'FLIM_convoluted_IRF.fdf' uygun işlev dosyayı seçin. Bu işlev uygun floresan ömür boyu histogramlar bir mono üstel çürüme fonksiyonu ile deconvoluted (Yani, tabloda ikinci sütun B) IRF ile (Denklem 1):
   (Denklem 1)
   t ile belgili tanımlık zaman, τ belirgin Floresans ömür boyu, A genlik ve y₀ uzaklık.
   Not: Başka bir ömür boyu histogramlar BI üstel uygun fonksiyon (Denklem 2) ile uygun seçenektir:
   (Denklem 2)
   Donör tek şart yavaş bileşenine (τ₁) ömrünü sabitleme tarafından (Adım 1.1.2: Örnek #1) ve hızlı bileşeninin (τ₂) tandem yapı (örnek 3) için bu kısmını tahmini sağlar TUZAK protein kompleksi (F) üzerinden genlikleri yavaş (A₁) ve hızlı bileşenleri (A₂; bkz: tartışma; Denklem 3):
   (Denklem 3)
   Deconvoluted BI üstel uygun 'FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf' için uygun fonksiyon dosyası ek dosya 2' kullanılabilir.
6. Seçin donatılmış eğrileri | Veri türü x olarak giriş veri olarak aynı.
   Not: Bu xuygun yol açar-monte eğrileri eksen ölçeklendirme.
7. Eğrileri uygunbasarak uygun.
   Not: Bu uygun dönüştürmek ve bir 'raporu sayfası' dizisinde Floresans yaşam süreleri, ofset ve genlikleri içeren bir tabloyla birlikte oluşturmak. Ayrıca monte eğrileri ve fazlalıklar uygun veri sayfasıyla oluşturacaktır.

Sonuçlar

SNARE etkileşimler tarafından FRET-FLIM ölçmek için tahlil mantığı şekil 1' de gösterilen. C-termini soydaş SNARE proteinlerin transmembran sarmal hayalice değiştirdi floresan proteinler (örneğin, mCitrine ve mCherry) bir çift için erimiş. CISoluşumu-hemen birbirine bitişik olmak floresan bu proteinler membran füzyon sonuçlarında üzerine karmaşık tuzak ve YIPRATMAK. Şekil 2 SNARE proteinler fluorescently etiketli ifade HeLa hücreleri temsilcisi confocal görüntüleri gösterir. Bir hücre (alıcısı fluorophore), VAMP3-mCherry ile ifade sözdiziminin 4-mCitrine (donör fluorophore) yanı sıra denetim koşulları sadece sözdiziminin 4-mCitrine yapý (donör sadece; hiçbir perde) ve her iki mCitrine için erimiş sözdiziminin 3 ifade hücre gösterilen ve tandem (maksimal expectable perde) mCherry. Şekil 3 eşlik eden floresan ömür boyu ve ömür boyu histogramlar mono üstel çürüme fonksiyonları (şekil 3A-B) ve BI üstel çürüme işlevleri () ile her pikselin yaklaştırarak oluşturulan FLIM görüntüler gösterir Şekil 3 c - D). şekil 4A bir mikroskop cam arka saçılma tarafından ölçülen bizim ayarlarına IRF gösterir. Şekil 4B-E, temsilcisi Floresans ömür boyu histogramlar tüm cep telefonu ile birlikte uyum eşlik eden FLIM analiz, mono-üstel çürüme işlevleri için eğrileri gösterilmektedir. Şekil 4F bir önde gelen yansıma zirveye çıkan mikroskop kapak cam yüzeye çok yakın yansıma bir deney floresan ömür boyu histogramını gösterir. Şekil 4 g ile BI üstel çürüme işlev sığdırmak temsilcisi ile ömür boyu histogramını gösterir.

Şekil 1: tuzak kompleksleri perde tarafından görüntülenmesi için mantığı düzeninin. (A)yapısal model nöronal tuzaklarına (protein veritabanı 3HD7¹⁷) vezikül ilişkili membran proteini (VAMPİR) 2 (mavi; R), sözdiziminin 1 (kırmızı; Qa-SNARE) ve SNAP25 (yeşil; her iki bir oyun kurucu ve Qc SNARE motif içerir). C-terminus transmembran heliks sözdiziminin-1, mCitrine (donör fluorophore; protein veritabanı 3DQ1¹⁸) Birleşik. C-terminus VAMP2 transmembran heliks, mCherry (alıcısı fluorophore; protein veritabanı 2H5Q¹⁹) Birleşik. (B) düzeni SNARE perde içinde sonucu membran füzyon aracılık. Membran füzyon oluşumu bir CIStarafından sonra-tuzak karmaşık, tuzaklarına hemen perde içinde kaynaklanan birbirine bitişik. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: ifade SNARE proteinlerin erimiş floresan proteinler için. İlk sütun: donör fluorophore, 516 heyecanlı nm. İkinci sütun: alıcısı fluorophore, 610 heyecanlı nm. (A)donör sadece durumu. Bir HeLa hücre ifade sözdiziminin 4-mCitrine (donör fluorophore; yeşil birleştirmede) temsilcisi confocal görüntüsü. Alıcısı kanal (ikinci sütun) floresan çapraz-talk gösterir. (B) negatif kontrol (FRET). Her iki sözdiziminin 4-mCitrine VAMP3-mCherry (alıcısı fluorophore; kırmızı mektup birleştirme işleminde) ile ifade bir HeLa hücre temsilcisi confocal görüntüsü. (C) pozitif kontrolü (maksimal expectable perde). Bir HeLa hücre ifade sözdiziminin 3-mCitrine-mCherry tandem temsilcisi confocal görüntüsünü oluşturun. MCitrine ve mCherry Floresans sinyalinin değil tamamen örtüşme, mCitrine mCherry için karşılaştırıldığında lizozomal bozulması için daha düşük bir direnç nedeniyle büyük olasılıkla sinyalleri Not (tartışma bölümüne bakın). BF: parlak alan. Ölçek çubukları, 20 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: FLIM görüntüleri SNARE karmaşık oluşumu. (A)temsilcisi Floresans ömür boyu görüntüleri Şekil 2' de gösterilen hücre. Görüntüleri bir TCSPC sistemi (.pt3) tarafından kaydedilen foton izlemeler dönüştürerek PT32ICS yazılımını kullanarak görüntü sitometresi için standart (.ics) oluşturuldu. Tek piksel görüntüleri daha sonra TRI2 yazılım^12,13 eşik 15-%100 yoğunluğu, 7 piksel dairesel binning ve monoexponential uygun algoritması (başta) ile kullanarak oluşturulan Floresans ömür boyu donatılmış. Rengi ortalama belirgin floresan ömür boyu gösterir. (B) FLIM görüntüleri nerede Floresans ömür boyu görüntüleri (gösterildiği Masası A) ( Şekil 2' de gösterilen) mCitrine donör fluorophore floresan yoğunluklarda ile kıvrık. Evrişim FIJI özel yapım bir makro kullanarak ImageJ ile gerçekleştirildi ( Tablo malzemelerigörmek). (C) floresan ömür boyu ve sözdiziminin 4-mCitrine ve VAMP3-mCherry A-B panelleri, ama şimdi BI üstel çürüme eğrileri ile uygun ile ifade HeLa hücre FLIM görüntüleri (bkz: ömürleriyle denetim koşulları için; sabit 4,4 inç adım iletişim kuralı). Tahmini kesirler F sözdiziminin 4 kompleks içinde VAMP3 ile piksel rengi belirtir (Denklem 3). (D) aynı panel B olarak ama BI üstel için uygun. Evrişim FIJI özel yapım bir makro kullanarak ImageJ ile gerçekleştirildi ( Tablo malzemelerigörmek). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: tüm cep telefonu FLIM analiz. (A) kurulum aracı yanıt fonksiyonu (IRF). IRF geri saçılma (su içeren bir temiz cam mikroskobu yemek kullanarak) cam-su arabirimi kullanılarak ölçüldü.(B-E) Bütün ömür boyu histogramlar Şekil 2 ve şekil 3' te gösterilen hücrelerin hücre. Tüm fotonlar görüntüleri mevcut havuzlu. Eğrileri ile IRF deconvoluted ve mono-üstel çürüme fonksiyonları (Denklem 1) ile donatılmış. Bu hücreler için 2,82 Floresans yaşam süreleri elde edilmiştir ns (ifade tek sözdiziminin 4-mCitrine; sadece donör; panel B hücreleri), 2.09 ns (sözdiziminin 4-mCitrine VAMP3-mCherry ile birlikte ifade hücreleri; Masası C) ve 2.08 ns (hücreleri ifade sözdiziminin 3 - mCitrine-mCherry tandem oluşturmak; maksimal expectable perde kontrolü; Panel D). Dişlerin ama şimdi y ekseni logaritmik ölçekleme ile aynı grafikler gösterirken. Panel E bir bindirme panelleri B-d çürüme eğrilerinin gösterir Bir floresan ömür boyu çubuk grafik örneği (F) mikroskop kapak notu yüzeye çok yakın kaydetti. Bir büyük yansıma tepe (sarı gölgeli alan tarafından tasvir) sonuçlanır. (G) şimdi ile yaşam süreleriyle BI üstel çürüme eğri uydurma ama C, panel gibi (bkz. Adım 4.4 protokolündeki) denetim koşulların sabit. Hızlı (A₁) ve yavaş (A₂) bileşenlerinin genlikleri 14.42 ve 0,01, sırasıyla, tuzaklarına karmaşık F 0,99 (Denklem 3) tahmini bir kısmını sonuçlanan idi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 1. İşlevi dosya FLIM_convoluted_IRF Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosyası 2. İşlevi dosya FLIM_convoluted_IRF_biexp Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Bu iletişim kuralı FRET-FLIM görselleştirme SNARE sözdiziminin 4 ve VAMP3 canlı HeLa hücreleri arasında bir köprü işlevi için kullanımı gösterilmiştir. Sözdiziminin 4 ağırlıklı olarak nerede ekzositozu^1,2,20,21aracılık eder plazma zarı bulma Qa-tuzak bir proteindir. VAMP3 esas olarak endosomal bölmeleri geri dönüştürme bulmak için açıklanan ve diğer endosomes de plazma zarı^1,2,20olarak kaçakçılığı aracılık eder R bir tuzak var. Ancak, FRET-FLIM tahlil diğer SNARE proteinler eğitimi için kolayca adapte edilebilir. Bu tuzaklarına hangi çoğu SNARE proteinler tarafından uzak^1,2için geçerli bir C-terminal transmembran heliks içeren tek durumdur. Ayrıca, burada açıklanan protokol SNARE kompleksleri bitki ve Maya da dahil olmak üzere herhangi bir ökaryotik hücre tipinde görselleştirme için adapte edilebilir. Bu protokol için donör fluorophore floresan ömrünü kısalma perde ölçüsü olarak kullanılan. Tamamlayıcı bir yaklaşım olarak alıcısı fluorophore ömrünü muayene, kesin kanıt bu rezonans enerji transferi sağlayan duyarlilasmis emisyon belirgin artış faz nedeniyle oluşur.

Şu anda, FRET-FLIM tekniği lizozomal bölmeleri SNARE kompleksleri görselleştirmek mümkün olmayabilir. Sözdiziminin 3-mCitrine-mCherry tandem inşa etmek için mCherry floresan kez mCitrine sinyal içinde cep daha bol ise büyük olasılıkla lizozomal bölmeleri için karşılık gelen bir juxtanuclear alanı, daha fazla birikmiş bulunabilir çevre⁵. Aynı SNARE protein flüoresan bu proteinler erimiş co ifade⁵yaşındayken mCitrine için karşılaştırıldığında mCherry benzer bir juxtanuclear birikimi gözlenmiştir. Organellerin karakterize tarafından son derece düşük bir pH (< 4) ve proteolitik enzim yüksek bir etkinlik. MCherry juxtanuclear birikimi büyük olasılıkla mCherry fluorophore mCitrine fluorophore göre lizozomal bozulması için daha yüksek bir direnç nedeniyle oluşur. MCherry juxtanuclear birikimi de hücreleri⁵fiksasyonu gerçekleştiği sırada için pH-Şoklama nedeniyle mCitrine, biri değil. Bu nedenle, FRET-FLIM tekniği FRET juxtanuclear (lizozomal) bölgelerde miktarı hafife ve bu organellerin sert şartları Lümen içinde hayatta diğer floresan muhabir proteinler gerektirir.

FRET-FLIM ilke (yarı-) kantitatif tahmin karmaşık⁵tuzaklarına fraksiyonunun elde etmek için izin verir. Bu protokol için açıklandığı gibi bu gerektirir Floresans ömür boyu histogramlar (Denklem 2), çift üstel çürüme işlevleriyle uygun hızlı bileşeni genliği tuzaklarına kısmını orantılı nerede karmaşık () içinde Denklem 3). Ancak, böyle uygun bir iki model ile teknik olarak zordur. Montaj birden fazla ücretsiz uygun parametreleri (iki floresan hayat ve iki genlikleri) ile çok sayıda fotonlar, özellikle parametreleri birbirlerini etkiler ve ömür boyu küçük hataları genlikleri ve Yardımcısı etkiler gerektirir çok yönlü. Bu uydurma sorunların üstesinden gelmek için Floresans yaşam süreleri yavaş bileşeninin donör tek şart (Yani, hiçbir FRET; sadece mCitrine mevcut) ömür boyu sabit olabilir ve bu tandem ömrünü hızlı bileşenine () inşa maksimal expectable perde). Floresans yaşam süreleri bu denetim durumları ile aynı olmayabilir ve birden çok nedenlerle (kendi kendine Şoklama, dipol yönlendirme, microenvironment değişimler) sapma çünkü ancak, bu aynı zamanda bakım ile yorumlanmalıdır. Yakın bir konumda birden fazla tuzak kompleksleri (< 10 nm) mesafe bağımlı perde, perde "moleküler cetvel" kullanılmak üzere izin verir aynı ilke sonuç ama bu durumda, gizlemektedir SNARE kompleksleri miktar. Çünkü etiketli tuzaklarına endojen (etiketsiz) tuzaklarına ile rekabet Ayrıca, nicel bir tahmin her zaman anlamlı değildir. Sonuç olarak, ifade mCherry etiketli SNARE yüzdesinin FRET⁵temel belirleyici düzeydir. Bu uyarılar yüzünden bu mono üstel çürüme fonksiyonu (Denklem 1) ile floresan ömür boyu histogramlar sığdırmak için tavsiye edilir. Bu yaşam bir temanın herhangi bir bilgi gerektirmez ve elde edilen belirgin ortalama floresan ömür boyu sağlam bir ölçü için tuzak kompleks⁵sağlar avantajı vardır.

Yine de, bu iki bileşenli uygun modelleri tarafından nicel FRET-FLIM görüntüleme güçlü gelecekteki uygulamalar olacaktır bekleniyor. TUZAK-encoding genlerin kromozom içinde floresan muhabir proteinler ile örneğin CRISPR/CAS9 tarafından erimiş. Bu endojen protein düzeyleri ve etiketsiz tuzaklarına, hiçbir arka plan ile endojen SNARE proteinlerin floresan etiketleme içinde neden olur ve böylece SNARE kompleksleri tarafından FRET-FLIM fraksiyonunun anlamlı bir nicel tahmini için sağlar. Endojen tuzaklarına ifade düzeyleri oldukça düşük olabilir ve vermek floresan sinyallerini nispeten düşük, bu fotonlar yeterli sayıda, özellikle tüm cep telefonu için (ki sadece birkaç 1.000 s fotonlar, gerektirir) FLIM elde edilebilir olduğunu bekleniyor. Ayrıca, bu perde-FLIM ölçümler de daha yüksek floresan sinyallerini ve daha iyi foton istatistikleri neden olur daha duyarlı çığ fotodiyot dedektörleri ile gerçekleştirilebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine'	Addgene	ID 92422	Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).
Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry'	Addgene	ID 92423	Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).
Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry'	Addgene	ID 92426	Positive control for maximum achievable FRET.
Hela cells
35 mm glass bottom dishes	Willco Wells	HBST-3522	Other live cell imaging chambers will work as a substitute
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco, Life Technologies	31966-021
Fetal calf serum	Greiner Bio-one	758093
Antibiotic-antimycotic solution	Gibco, Life Technologies	15240-062	Pen/Strep will work as a substitute
Live cell imaging medium	Thermo Fisher Scientific	A14291DJ	Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented
Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective	Leica	SP8	Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used
Pulsed white light laser	Leica	SP8	Other pulsed laser sources can also be used
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system	PicoQuant	PicoHarp 300
PT32ICS conversion software			Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com
data analysis software programme capable of deconvolution	Originlabs	OriginPro 2016
Fiji ImageJ
Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity	Fiji ImageJ		Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com
Bürker Haemocytometer	VWR	630-1541
HeLa cells	ATCC	ATCC CCL-2
PBS	B Braun Melsungen  AG	362 3140
EDTA 2 mM	Merck	108417	CAS: 60-00-4
15 mL tubes	Greiner Bio-one	188271
Trypan blue	Sigma Aldrich	93595	CAS: 72-57-1
NEON cell electroporation device	Thermo Fisher Scientific	MPK5000S