تركيب 10 نانومتر فونكتيوناليزيد المغلفة البوليمر جزيئات الذهب لاستهداف البطانة وإيصال الأدوية

Summary

يصف لنا طريقة توليف متوافق حيويا 10 نانومتر جسيمات نانوية الذهب، فونكتيوناليزيد بطلاء بولي الإثيلين غليكول إلى السطح. يمكن أن تكون هذه الجزيئات المستخدمة في المختبر و في فيفو لتقديم العلاجات ممنوع نانوية الهاتف الخلوي والخلية التي يصعب الوصول إليها مع أحجام نانوحبيبات التقليدية.

Abstract

وقد استخدمت الجسيمات النانوية الذهبية (أونبس) على نطاق واسع في البحوث الطبية بسبب حجمها وتوافق مع الحياة، والسطح قابل للتعديل. تسليم المخدرات واستهداف محددة بعض التطبيقات لهذه أونبس، ولكن خصائص دفاعية تعوق امتصاص غشائي مصفوفات خارج الخلية الجسيمات. لمعالجة هذه المسألة، ونحن تصف أسلوب توليف للجسيمات النانوية الذهبية أولتراسمال لتحسين أداء الأوعية الدموية، مع المجموعات الوظيفية للتخصيص وأطوال البوليمر لإدخال مزيد من التعديلات. بروتوكول غلة 2.5 نانومتر أونبس التي هي توج مع كلوريد فوسفونيوم تيتراكيس (هيدروكسيميثيل) (تهبك). الاستعاضة عن تهبك بالوظيفية المتغايرة البولي إثيلين غليكول (شماعة) على السطح أونب يزيد نصف قطرها هيدرودينامية إلى 10.5 نيوتن متر مع توفير المجموعات الوظيفية المختلفة على السطح. ويتضمن الجزء الأخير من البروتوكول إضافة اختيارية فلوروفوري للسماح أونبس تصور تحت الأسفار لتعقب امتصاص نانوحبيبات. واستخدمت الغسيل الكلوي وليوفيليزيشن لتنقية وعزل في أونبس. يمكن تصور هذه الجسيمات النانوية الفلورسنت في تجارب في المختبر و في فيفو سبب متوافق حيويا تحقيقات شماعة الطلاء ونيون. بالإضافة إلى ذلك، مدى حجم هذه الجسيمات النانوية تجعلها مرشح مثالي للتدقيق في جليكوكاليكس دون تعطيل وظيفة المفرج المعتادة، مما قد يؤدي إلى تحسين أداء والمداواة.

Introduction

وقد طبقت جسيمات نانوية لإيصال الأدوية، وتصوير لقدرته على التنقل من خلال الهيئة للوصول إلى المناطق المستهدفة للفائدة^1،2. قد تتراكم داخل الأورام عن طريق المفرج راشح الجسيمات أو المعربة فيها overexpressed يجند مستهدفة ومكشوف. الذهب، على وجه التحديد، أصبحت مادة نانوحبيبات شائعة استخدام بسبب خصائصه الكيميائية والفيزيائية الفريدة التي تؤثر في النقل والإفراج عن المداواة³. وهو مادة نانوحبيبات فعالة لأنه يمكن تعديل سطحه لربط ثيولس الذهب عالية توافق مع الحياة بسبب لها سمية منخفضة⁴. أونبس هي قادرة على أن شركات الأدوية الجزيئية البيولوجية الكبيرة، وقد نجحت في إيصال الببتيدات والأحماض النووية والبروتينات، مما يسمح أونبس أن تكون مواتية لاستهداف^2،4.

ولسوء الحظ، أعاق فعالية إيصال المخدرات نانوحبيبات جليكوكاليكس سلبا على التهمة الموجهة إليه، وهو معطف خارج الخلية في غشاء خلايا الثدييات الأكثر وأحجام مسام من^5،شمال البحر الأبيض المتوسط يصل إلى 7⁶. هذا الحجم المسام أصغر من معظم شركات العقاقير نانوحبيبات، الذي يكون عادة بأقطار تتراوح ما بين 50-200 نانومتر. تحت ظروف المرض، تصبح هذه المسام جليكوكاليكس أكبر نظراً لتدهور وزيادة النفاذية عبر الخلايا البطانية. بيد أن معظم جسيمات نانوية لا تزال كبيرة جداً للاستفادة من هذا التغيير الهيكلي في جليكوكاليكس. أحد آثار هذا عدم تطابق حجم هو أن جزيئات تقليديا الحجم لا يتفاعل إيجابيا مع الخلايا البطانية التي تبطن الأوعية الدموية. وهذا يؤثر على إيصال الجزيئات التي تدار عن طريق الوريد في البطانة، وأيضا يمكن أن يقال عن الجسيمات النقل عن طريق الدم الدماغ حاجز^7،،من^89،10.

نهج واحد لمكافحة هذه المشكلة استخدام جسيمات أصغر لتمرير من خلال مسام صغيرة في جليكوكاليكس. هنا، نحن توليف من 10.5 نانومتر أولتراسمال الذهب نانوحبيبات، التي عادة ما ينبغي أن تردعه جليكوكاليكس سليمة وصحية. حالما يبدأ جليكوكاليكس للخطر، ينبغي نانوحبيبات بسهولة اختراق الخلايا عن طريق زيادة حجم المسام. البروتوكول في هذه الورقة تفاصيل توليفة من أولتراسمال الأساسية الذهب المغلفة مع الوتد، مما يزيد في توافق مع الحياة ويقلل من إزالة النظامية⁴. يمكن أن تحتوي شماعة أيضا عدة أنواع من المجموعات الوظيفية، فتح قنوات لتصريف استهداف يغاندس، فلوروفوريس، والمداواة. وتشير النتائج المنشورة سابقا إلى أن هذه الجسيمات النانوية أولتراسمال تميل إلى تناول أكثر تفضيلاً في مناطق جليكوكاليكس بطانية تعطل وظيفة حتى بدون أي نشطة تستهدف^4،11. وهذا يشير إلى جدوى وأهمية الاستفادة من جزيئات حجم الصحيح لطلبات التسليم. ويقدم البروتوكول التالي التوليف وتنقية وتوصيف أونبس المغلفة بشماعة (شماعة-أونب)، مع مناقشة للخياطة في المجموعات الوظيفية والاقتران لتطبيقات أخرى.

Protocol

1-إعداد أو شراء الأسهم الحلول (ليتم تخزينها في درجة حرارة الغرفة أو المجمدة حتى الاستخدام)

1. إعداد حل أسهم هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) 1 م بحل 400 مجم هيدروكسيد الصوديوم في 10 مل من الماء عالي النقاوة في درجة حرارة الغرفة، وخلط المواد جيدا.
   ملاحظة: يتم تعريف الماء عالي النقاوة كالماء دون الشوائب مثل الجسيمات، والبكتيريا، نوكليسيس، أيونات، أو آثار للمواد العضوية. ويستخدم نظام تنقية للحصول على الماء عالي النقاوة، أسفر عن المقاومة لتصل إلى 18.2 mΩ·cm، مما يشير إلى تلوث أنيونى منخفضة. لا ينصح باستخدام المياه عالي النقاوة المعبأة متوفرة تجارياً. من الآن فصاعدا، هذا الماء عالي النقاوة سوف يكون يشار إلى الماء، ما لم يحدد خلاف ذلك.
2. تحضير هيدروكسيد الصوديوم 6 م حل أسهم بتذويب 2.4 غ من هيدروكسيد الصوديوم في 10 مل الماء، وتخزين الحل في درجة حرارة الغرفة.
3. تحضير حلاً أسهم 250 ملم من حمض تشلورووريك (حوكل₄) بإذابة 1 ز المجففة حوكل₄ في 10.16 مل من الماء. تمييع 1 مل من 250 مم حوكل₄ مع 9 مل من الماء للحصول على تركيز العامل 25 مم حوكل₄. تخزين الحل₄ حوكل في درجة حرارة الغرفة.
4. إعداد المخزن مؤقت كربونات 0.1 متر عند درجة الحموضة 8.8، بحل بيكربونات الصوديوم ملغ 84 في 10 مل من الماء وضبط درجة الحموضة إلى 8.8 بإضافة هيدروكسيد الصوديوم م 6 من الخطوة 1، 2. تخزين المخزن المؤقت كربونات في درجة حرارة الغرفة.
5. مزيج 20 مل تيترازوليوم الملح مركب، 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS)، مع عامل استقرار، فينازيني اثوسولفاتي (PES) (انظر الجدول للمواد). تخزين الخليط MTS/الدائرة العامة في مختبرين (بحد أقصى 10 دورات تجميد أذاب) في-20 درجة مئوية في الظلام.

2-تجميع النوى نانوحبيبات الذهب

1. تعد حلاً تهبك مخفف بإضافة 12 ميليلتر من 80% تهبك في المياه إلى 1 مل من الماء في أنبوب ميكروسينتريفوجي في درجة حرارة الغرفة.
2. تأمين قارورة 100 مل قاع جولة على مركز لوحة إثارة المغناطيسية. صب 45 مل الماء في قارورة ويحرك الماء 300 لفة في الدقيقة باستخدام شريط إثارة مغناطيسية صغيرة على شكل بيضة. إضافة 0.5 مل من هيدروكسيد الصوديوم م 1 و 1 مل من المخفف تهبك الحل. تواصل إثارة رد فعل الخليط بشدة لمدة 5 دقائق.
3. مواصلة إثارة الخليط وإضافة 2 مل 25 مم حوكل₄ الحل. سيتم تغيير لون الخليط من الأصفر إلى البنى الداكن في غضون ثوان، مشيراً إلى تشكيل تهبك توج أونبس مع شحنة سالبة. يقلب الخليط 15 دقيقة إضافية للسماح باكتمال تشكيل النوى الذهب.

3-إضافة كورونا البوليمر حولها جسيمات نانوية الذهب

1. خلال فترة 15 دقيقة هو موضح في الخطوة 2، 3، إعداد شماعة الحلول بحل كل ما يلي في 1 مل من الماء في قارورة زجاج مل 4: 30 ملغ NH₂-ربط-ش؛ 7.5 ملغ م-شماعة-ش؛ 7.5 ملغ COOH شماعة ش.
   ملاحظة: ينبغي أن تكون تركيزات الناتجة م 8.8 NH₂-ربط-ش، 3.75 M m شماعة ش، و 3.75 م COOH-شماعة-ش.
2. بعد تخفيض سرعة الحل في قارورة قاع الجولة إثارة إلى 100 دورة في الدقيقة، إضافة شماعة توج الحلول لحل تهبك أونبس دروبويسي. تواصل يحرك الخليط بلطف بين عشية وضحاها، في درجة حرارة الغرفة، لضمان كفاءة إزالة تهبك والاستعاضة الوتد.
3. ح 72 القادمة، استخدم غشاء السليولوز استقطاع وزن الجزيئي كاتشين 12-14 دياليزي الخليط المقلبة ضد دلو 4 لتر من المياه أثارت 60 لفة في الدقيقة. ربط نهايات الأغشية بمشابك الغسيل الكلوي ونقل الحل عن طريق ماصة.
   ملاحظة: هذه عملية غسيل الكلي مع الغشاء استقطاع كاتشين 12-14 فقط يزيل شماعة الممتص وتهبك وغيرها الكواشف، قبل نشرها على طول تدرج التركيز.
4. للحفاظ على ارتفاع تركيز التدرج وتشجيع نشر المستمر، تغيير الماء كل 2 ح لأول ح 6 وكل ح 6-12 ح 66 المتبقية.
   ملاحظة: الغرض من هذا الجدول تغير المياه هو لاحتواء الانتشار السريع الذي يحدث مبكرا بسبب التركيز العالي في البداية ضمن العينة. عملية الغسيل الكلوي المذكورة أعلاه أوراق الحل نانوحبيبات شبه المنقي، لأنه لا يمكن تمرير جسيمات نانوية ورواسب والمجاميع، وغيرها من الشوائب كبيرة الحجم من خلال مسام الغشاء استقطاع كاتشين 12-14.
5. تصفية الحل نانوحبيبات شبه المنقاة في أنبوب 50 مل مخروطية استخدام عامل تصفية حقنه 0.2 ميكرون لإزالة رواسب المتبقية، والمجاميع، وغيرها من الشوائب كبيرة الحجم.
6. ضع الأنبوبة المخروطية في ثلاجة-80 درجة مئوية ويسمح الحل أونب سي (شماعة-أونب) المنقي لتجميد لحوالي 5 ساعات.
7. استخدام تجميد مجفف لتنقية شماعة-أونب ليوفيليزي.
8. تخزين جافة، وتنقية شماعة-أونب في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

4-التصريف Fluorophores استخدام إستر N-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS) على المجموعات₂ NH على شماعة-أونب

1. تأمين قارورة 50 مل قاع جولة على مركز لوحة إثارة المغناطيسية. ملء قارورة مع 18 مل من الماء ويقلب الماء 100 لفة في الدقيقة باستخدام قضيب من إثارة مغناطيسية على شكل بيضة.
2. وزن 2 مغ من شماعة-أونب المجففة بالتبريد في أنبوب مخروطي مل 4، استخدام مقياس benchtop عالية دقة. استخدام بندقية مكافحة ساكنة للقضاء على التهمة ثابتة والتشبث من مسحوق أونب شماعة على سطح الأنبوب. إضافة 2 مل الماء إلى الأنبوب. صب مل 2 الحل شماعة-أونب في قارورة أسفل جولة للمزيد من إعادة تشكيل في إجمالي 20 مل من الماء. تواصل إثارة المخلوط 100 لفة في الدقيقة باستخدام قضيب من إثارة مغناطيسية على شكل بيضة.
3. أضف 1 مل من 0.1 متر، الرقم الهيدروجيني 8.8 كربونات المخزن المؤقت إلى 20 مل أونب المعاد تشكيلها الوارد في قارورة قاع الجولة. يواصل التحريك.
4. إضافة 5 ميليلتر إستر النظام الصحي الوطني فلورسنت 10 ملغ/مل في ثنائي ميثيل سلفوكسيد.
   ملاحظة: يمكن استخدام أي صبغة الفلورسنت في هذه العملية. إثارة شماعة الفلورسنت بين عشية وضحاها. يبقيه في درجة حرارة الغرفة والمشمولة في إحباط.
5. ح 72 القادمة، إزالة الزائدة فلوروفوريس باستخدام البروتوكول هو موضح في الخطوة 3، 3. باختصار، دياليزي المقلبة المخلوط باستخدام دلو 4 لتر من الماء وغشاء السليولوز استقطاع وزن الجزيئي كاتشين 12-14. تغيير الماء كل ح 2 6 الأولى ح وكل ح 6-12 ح 66 المتبقية.
6. الحصول على 1 مل الحل شماعة أونب نيون المنقي، لاستخدامها لتوصيف هو موضح أدناه في القسم 5. تجميد وليوفيليزي الحل المتبقية للحصول على جسيمات نانوية مضيئة في شكل مسحوق للتخزين في 4 درجات مئوية، كما هو موضح في الخطوات 3.5-3.7.
7. استخدام عامل تصفية حقنه 0.2 ميكرون لتعقيم وإزالة أي رواسب يحتمل تشكيلها مرة واحدة لتطبيقات ثقافة الخلية.

5-وصف فلوري سي الذهب جسيمات نانوية

1. باستخدام مجهر إلكتروني (TEM) لتصور جوهر نانوحبيبات الذهب وقياس الأحجام
   1. إسقاط 10 ميليلتر الحل شماعة أونب نيون المنقي على شبكة تيم مش الكربون المغلفة.
   2. وبعد 5 دقائق، استخدام قطعة من ورق الترشيح الفتيل السائل الزائدة بعيداً عن حافة الشبكة تيم بعناية حتى فيلم يتضمن فلوري أونبس شماعة تركت وراءها.
   3. عرض نيون شماعة-أونبس في 80 كيلو فولت وفي تكبير من 50,000-150، 000. التقاط الصور الرقمية.
      ملاحظة: فقط الذهب الأساسية ستكون مرئية لشماعة ليس إلكترون كثيفة على ال.
   4. استخدام برنامج قياس، ضبط مقياس القياس في ارتباط إلى شريط مقياس. حساب أقطار النوى الذهب حوالي الساعة 20، ومن ثم تحديد القطر متوسط الأساسية الذهب.
      ملاحظة: نظام التصوير تيم تلقائياً يضع شريط مقياس على الصور الرقمية.
2. قياس حجم نانوحبيبات هيدرودينامية استخدام تشتت الضوء الحيوي (DLS)
   1. نقل 1 مغ أونبس المغلفة تهبك المجففة بالتبريد في أنبوب ميكروسينتريفوجي استخدام النهج المذكور في الخطوة 4، 2. نقل 1 مغ أونب شماعة المجففة بالتبريد في أنبوب منفصل. أضف 1 مل من الماء لكل أنبوبة ونقل كل حل أونب 1 مل بلاستيك الشفاف.
   2. ضع ومبومو في صك DLS وقياس أقطار هيدرودينامية كروية باستخدام البرمجيات محلل الجسيمات التي هي في صلب نظام دائرة الأراضي والمساحة.
   3. ارسم أقطار هيدرودينامية المقاسة استخدام تنسيق الرسم بياني.
      ملاحظة: سوف تجميع الرسم البياني جسيمات نانوية حسب الحجم. سيتم توضيح أكبر مجموعة من جسيمات نانوية قطر التي تصف حجم أونبس توليفها في هذا البروتوكول.
3. تأكيد الأسفار فلوروميتريك
   ملاحظة: نفس العينة وومبومو من الخطوة 5.2 استخدامها لقياس الإشارات الفلورسنت.
   1. إزالة ومبومو من دائرة الأراضي والمساحة وإدراج في سبيكتروفلوروميتير. تعيين الطول الموجي الإثارة إلى 633 نانومتر وقراءة الأسفار المنبعثة إشارات على طول نطاق الطول موجي من 650-800 نانومتر.
   2. التأكد من أن الذروة حوالي 665 شمال البحر الأبيض المتوسط، الذي يرتبط إلى ذروة الانبعاث لدائرة الصحة الوطنية.
      ملاحظة: ضبط أطوال موجية الإثارة والانبعاثات وفقا فلوروفوري المستخدمة في العملية.
4. النظام التجاري المتعدد الأطراف الاعتداء¹¹ تقييم توافق مع الحياة
   1. في أسفل 96-جيدا واضحة عقيمة أنسجة ثقافة التعامل مع لوحة، "الماصة؛" 100 ميليلتر من المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو (دميم؛ وتستكمل مع 10% الجنين البقري 1% ومصل البنسلين/ستربتوميسين) و 3.2 × 10³ خلايا في كل بئر.
      ملاحظة: تستخدم في هذه الدراسة، الفئران وسادة الدهون خلايا بطانية. وتستخدم مجموعة آبار 21 للسماح ب 3 replicates لكل من تركيزات مختلفة نانوحبيبات 7 (راجع الخطوة 5.4.3 لتركيزات محددة من الفائدة).
   2. السماح للخلايا أن تنمو إلى كونفلوينسي في أول أكسيد الكربون₂ يسيطر حاضنات الرطوبة و 5% في 37 درجة مئوية¹¹.
   3. إعداد أنابيب ميكروسينتريفوجي الفردية، كل منها يحتوي على 300 ميليلتر من دميم مع جسيمات نانوية تركيزات مختلفة. تتطلب هذه الدراسة 7 أنابيب مختلفة من دميم مع تركيزات شماعة-أونب التالية: 0 ميكروغرام/مل 10 ميكروغرام/مل، 50 ميكروغرام/مل، 100 ميكروغرام/مل، 250 ميكروغرام/مل، 500 ميكروغرام/مل و 1,000 ميكروغرام/مل.
   4. نضح دميم من الأنبوب. سد الآبار في ثلاث نسخ مع 100 ميليلتر دميم الوسائط التي تحتوي على 0، 10، 50، 100، 250، 500، أو 1,000 ميكروغرام/مل من أونب.
   5. السماح للخلايا والجسيمات النانوية لاحتضان شارك لمدة محددة سلفا من الوقت، هنا لح 16.
   6. قرب نهاية فترة الحضانة، ذوبان الجليد الخليط MTS/الدائرة من الخطوة 1، 5.
   7. وبعد الحضانة، نضح دميم وجسيمات نانوية فضفاضة المرفقة مع وقف التنفيذ، ومن الآبار. إضافة 100 ميليلتر من دميم الطازجة جنبا إلى جنب مع 20 ميليلتر من حل MTS/الدائرة العامة للحصول على 1:5 MTS/الدائرة العامة لنسبة دميم وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. احتضان الخلايا مع MTS/الدائرة العامة في 37 درجة مئوية ح 2.
      ملاحظة: هذه المرة حضانة ح 2 يتحدد النشاط الأيضي للخلايا البطانية ويمكن أن يزاد إلى ما يصل إلى 4 س لأنواع الخلايا الأخرى. ضمن فترة ح 2، النظام التجاري المتعدد الأطراف يتم استقلاب خلايا بطانية إلى formazan الملونة التي تختلط مع دميم. سوف يتجلى توافق مع الحياة من شماعة-أونب واحتمال بقاء الخلية مع formazan ملونة أكثر. سيظهر سمية شماعة-أونب وفرصة أن تموت الخلايا بلون أقل كثافة.
   8. القيام بتحليل اللونية لكل بئر بقراءة امتصاص في 492 شمال البحر الأبيض المتوسط مع قارئ لوحة متوافقة.
   9. لكل تركيز نانوحبيبات، حساب امتصاص متوسط من امتصاص ثلاث قيم. القسمة امتصاص متوسط القيمة التي تم الحصول عليها من معدل امتصاص في الآبار التي تحتوي على جسيمات نانوية ميكروغرام/ملليلتر 0.
      ملاحظة: هذه الآبار التي تحتوي على لا أونبس بمثابة الضوابط لحساب النسبة المئوية الخلية جدوى استجابة للعلاج نانوحبيبات تدار في آبار أخرى.
5. الأسفار مجهرية [كنفوكل] تقييم امتصاص نانوحبيبات في خلايا بطانية ملتصقة مع جليكوكاليكس سليمة أو اختلال¹¹
   1. لوحة خلايا بطانية على كوفيرسليبس زجاج معقمة 12 مم البذور 1.0 × 10⁴ خلايا/سم² الفئران الدهون وتغذية الخلايا مع دميم وتستكمل مع 10% الجنين البقري 1% ومصل البنسلين/ستربتوميسين. السماح للخلايا أن تنمو إلى كونفلوينسي كاملة في الرطوبة وأول أكسيد الكربون₂ يسيطر حاضنات في 37 درجة مئوية، لمدة 3 أيام تقريبا.
   2. إضافة العلاجات لتعديل جليكوكاليكس، إذا كان ذلك ممكناً. على سبيل المثال، العلاج ح 2 من خلايا بطانية مثقف مع 2.5 × 10^-6 وحدة دولية هيباريناسي الثالث الإنزيم يحط في جليكوكاليكس بالتحديد ناهضة عنصرها كبريتات heparan.
      ملاحظة: يمكن أن تكون على غرار جليكوكاليكس صحية بزراعة الخلايا البطانية كما هو موضح في الخطوة 5.5.1 دون إضافة إنزيمات تدهور.
   3. مع جليكوكاليكس بطانية ترك سليمة أو المقدمة المختلة وظيفيا، احتضان خلايا بطانية مع أونبس الفلورية في 550 ميكروغرام/مل ح 16 أو غيرها الوقت المطلوب.
   4. تغسل بلطف الخلايا مع 2 مل من 37 درجة مئوية 1% ألبومين المصل البقري في الفوسفات مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني؛ والتي تحتوي على 100 مغ/لتر من الكالسيوم والمغنيسيوم 100 مغ/لتر). غمر الخلايا في 2 مل بارافورمالدهيد 2% و 0.1% جلوتارالديهيدي في برنامج تلفزيوني، وتسمح للخلايا لإصلاح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   5. إزالة الحل تحديد ألدهيد وغسل الخلايا مع درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني لمدة ثلاث دورات 5-دقيقة.
   6. قبل تطبيق جسم الأولية، كشف خلايا بطانية لمصل الماعز 2% في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لمنع مواقع الربط غير محددة. يجب أن تغطي الخلايا تماما بعرقلة الحل.
   7. احتضان خلايا بطانية بين عشية وضحاها مع 1% مكافحة heparan كبريتات جسم الأولية في مصل الماعز 2% في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لتسمية عنصر كبريتات heparan جليكوكاليكس. التأكد من وجود الخلايا الثابتة على اتصال مع الحل الضد تماما.
   8. وفي اليوم التالي تغسل الجسم مع درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني لثلاث دورات 10 دقيقة.
   9. احتضان خلايا بطانية مع تخفيف 1:1,000 من جسم الثانوي الفلورسنت مناسب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، في الظلام أو مغطاة برقائق الألومنيوم.
   10. تغسل جسم الثانوي مع درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني لثلاث دورات 10 دقيقة.
   11. جبل ساترة على شرائح المجهر استخدام وسيلة تصاعد تتلاشى المضادة التي تحتوي على 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي، هيدروكلوريد (DAPI) لنواة تلطيخ. ختم حواف ساترة استخدام طلاء الأظافر.
   12. صورة الخلية البطانية إيمونوستينيد نيون عينات مع [كنفوكل] مجهرية، باستخدام قنوات الأزرق والأخضر والأحمر الآن تصور الأنوية، heparan كبريتات جليكوكاليكس وجسيمات نانوية، على التوالي.

النتائج

أونبس المركبة، مغطاة بطبقة تهبك أو شماعة (الشكل 1A و الشكل 1B، على التوالي)، يتم تصويرها مع تيم والجسيمات يتم قياس الأحجام باستخدام تيم ودائرة الأراضي والمساحة لضمان توزيع حجم نانوحبيبات السليم. ويبين الشكل 2 صورة تيم عينة تهبك-أونب في 80 كيلو فولت و 150,000 x التكبير. أقطار مجموعة الجسيمات تهبك-أونب من 2-3 نانومتر، استناداً إلى شريط المعايرة في الصور ال. هذا الحجم أونب تهبك واضح أيضا في DLS حجم قياس الرسم البياني هو مبين في الشكل 2، الذي يرد في الذي المغلفة تهبك أونب إلى ذروتها في 2.5 نانومتر. بيجيليشن غير مرئية تحت تيم البوليمرات ليست إلكترون كثيفة. تصوير تيم لعينات شماعة-أونب ببساطة يؤكد وجود الجسيمات المشتتة الفردية، التي من المتوقع أن كورونا البوليمر شماعة حول جسيمات نانوية المساعدة في منع التراكم. لهذه العينات شماعة-أونب، يظهر الرسم البياني قياس حجم DLS تحولاً في الذروة، إلى حوالي 10.5 شمال البحر الأبيض المتوسط على دائرة الأراضي والمساحة. المرفقات لمزيد من يغاندس أو المخدرات على المجموعات الوظيفية سوف تؤثر على حجم نانوحبيبات كذلك، وينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند قياس القطر.

إضافة فلوروفوري (الشكل 1) يتأكد من استخدام فلوروميتير لقياس الإشارات الأسفار من عينة من جسيمات نانوية، كما هو مبين في الشكل 3. عندما متحمس مع طول موجه 633 نانومتر، الانبعاث تقاس إلى الحد الأقصى بين 660 و 672 شمال البحر الأبيض المتوسط، الذي يطابق معلومات المنتج الخاص بالشركة المصنعة للحد الأقصى من الانبعاثات في 665 شمال البحر الأبيض المتوسط. يجب التحقق من مرفقات المسابر الفلورية الأخرى بطريقة مماثلة لضمان استجابة الفلورسنت.

يتم تقييم توافق مع الحياة من الجسيمات وبقاء الخلية ذات الصلة باستخدام مقايسة MTS للتحقق من استقلاب الخلية النسبي للنظام التجاري المتعدد الأطراف بعد 16 ح الحاضنات بتركيزات مختلفة من جسيمات نانوية. Fluorophore مترافق سي أونبس يظهر لا سمية كبيرة، كما هو مبين بمستويات مماثلة لبقاء الخلية على جميع تركيزات تصل إلى 1 مغ/مل (الشكل 4 أ). قد يتغير هذا توافق مع الحياة اعتماداً العلاج أو يجند يعلق على المجموعات الوظيفية المتبقية لمزيد من تخصيص الجسيمات. المرفقات المخدرات تميل إلى زيادة سمية، ولكن تبعاً لتركيزات العامل، فإنه قد لا يؤثر على استمرارية على نحو كبير.

هو تقييم الإقبال على فلوري، سي أونبس (الشكل 1) من الخلايا ملتصقة باستخدام لوحة الدهون الفئران مثقف خلايا بطانية مع جليكوكاليكس سليمة أو اختلال (الشكل 4 باء). وتتحقق الشروط جليكوكاليكس مختلة بإضافة إنزيم هيباريناسي الثالث للثقافة، وأسفر عن تدهور عنصر جليكوكاليكس كبريتات heparan والمساس بمصفوفة¹². ويبين الشكل 4B مستويات مختلفة من الإقبال على شماعة-أونبس، كنقاط حمراء على رأي مستعرضة من خلايا بطانية الممثل. جليكوكاليكس صحي يحول دون الإقبال على هذه الجسيمات النانوية الذهبية، ولكن لوحظ زيادة كبيرة عندما يكون الإنزيم العاملين¹¹. وتبرز هذه النتيجة إمكانات هذه الجسيمات النانوية أولتراسمال لتقديم العلاجات للخلايا البطانية بطريقة يسيطر عليها التفاعلات المميزة التي تستند إلى الصحة جليكوكاليكس.

رقم 1: الخطط نانوحبيبات الذهب- تهبك (A) المغلفة نانوسفيري أونب قبل استبدال الوتد. (ب) سي أونب مع 3 أنواع من الانهاءات الوتد، بما في ذلك COOH، NH₂والفصل₃. وتمثل الأمواج الزرقاء البوليمر. (ج) مترافق جسيمات نانوية للتصوير بالأسفار. وتظهر النجوم الحمراء fluorophores مترافق ل NH₂ المجموعات الوظيفية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: حجم قياسات للجسيمات النانوية الذهبية- اليسار: تيم من جسيمات نانوية الذهب قبل إضافة الوتد في 80 كيلو فولت و 150,000 X التكبير، مع شريط مقياس سيظهر. حق: الرسم البياني لحجم نانوحبيبات تقاس DLS قبل (أونب) وبعد استبدال (شماعة-أونب) تهبك مع الوتد. قياس نتائج DLS المغلفة تهبك أونب ما هو متصور من تيم. نتائج أونب المغلفة بشماعة DLS التغلب على التحدي المتمثل في عدم القدرة على تصور شماعة من تيم سبب البوليمرات لا يجري إلكترون كثيفة. تيم شماعة-أونب سوف تظهر جسيمات نانوية الأساسية الذهب فقط، وسوف تبدو نفس أونب توج تهبك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: بيانات Fluorescence من الفلورسنت شماعة-أونب- ذروة fluorescence في مباريات نانومتر 667 مترافق انبعاث فلوروفوري على شماعة-أونب. A.U.: وحدات التعسفي.

الشكل 4: خلية التفاعلات مع نيون شماعة-أونب- (أ) الأرض البقاء (MTS الأيض) خلية للدهون في الفئران لوح خلايا بطانية بعد حضانة ح 16 مشارك مع أونب شماعة الفلورسنت. (ب) [كنفوكل] صور مقطعية للدهون في الفئران الثابتة لوحة خلايا بطانية ملطخة DAPI نوى (الأزرق) والأجسام المضادة ضد كبريتات heparan، مكون جليكوكاليكس (أخضر). الصورة العلوية جليكوكاليكس صحية وأسفل طبقة جليكوكاليكس متدهورة؛ وهناك fluorescence أحمر أكثر بكثير من جسيمات نانوية في العينة مع جليكوكاليكس المتدهورة. شريط مقياس هو 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

هذا الأسلوب طريقة فعالة لتوليف لتخصيص، المغلفة شماعة أولتراسمال أونبس. جزء هام من هذا الإجراء هو تشكيل الأولية تهبك توج الذهب الجسيمات النانوية، التي يمكن تأكيدها بتغيير اللون من اللون الأصفر البنى التي سوف تحدث بعد تم إضافة HAuCl4 إلى المحتويات في قارورة قاع الجولة (الخطوة 2، 3 من البروتوكول). لا تغير لون يشير إلى أن هناك جسيمات نانوية لا شكل وأن يكون التحقق من الخطوات الأولية والمتكررة قبل المتابعة. في حالة تغيير اللون إلى شيء آخر غير براون مثل النبيذ الأحمر أو الرمادي، الجسيمات الناتجة لن يرجح أن يكون حول نانومتر المستهدف 2.5 وينبغي دفعة جديدة، وكذلك.

بعد تشكيل نواة الذهب، تتضمن تبادل تهبك الوتد وإجراءات تنقية عدة خطوات رئيسية للنجاح في إنجاز البروتوكول. خلط بين عشية وضحاها يسمح لرد فعل بديل للذهاب إلى الإنجاز. يمكن أن يحدث تنقية فشل إذا لم يتم تغيير مياه الغسيل الكلوي مع تواتر المنصوص عليها. تجميع وترسيب الجزيئات يمكن أن يحدث أيضا إذا تركت الجسيمات في الغسيل الكلوي لأكثر من 72 ح. ويمكن ملاحظة القضايا المحتملة الأخرى أثناء تجميد التجفيف. إذا شماعة أولتراسمال المغلفة أونب الحل لم تجمد تماما أو ليوفيليزير كان إعداد لا بشكل صحيح، قد تكون العينات المفقودة. أرجع إلى دليل ليوفيليزير، كما قد تتطلب بعض المعدات الاستعدادات عينة مختلفة.

سهولة التوليف وتوافق مع الحياة للجسيمات الناتجة تمثل مزايا بالنسبة لاستخدام هذه شماعة-أونبس. وبالإضافة إلى ذلك، هذه الجسيمات النانوية لها ميزة كونها قادرة على التفاعل مع هياكل النانو الخلوية كما يتجلى في القدرة على تحديد جليكوكاليكس المتدهورة بالاقبال على هذه الجسيمات النانوية. هذه الميزة يمكن أن تكون الاستدانة لتطوير علاجات جديدة من تصلب الشرايين والتدابير الوقائية. وراء ما نحن الحاضرين هنا، وهناك ميزة أخرى لهذا البروتوكول هو أن ذلك يسمح للتخصيص واسعة النطاق للجسيمات، فضلا عن زيادة قدرات التخزين والاستقرار عن طريق إرفاق ثيول المحتوية على شماعة على جسيمات نانوية الذهب⁴. نهاية سلسلة شماعة أخرى يمكن أن تحتوي على أي مجموعة وظيفية، ويمكن مترافق عددا كبيرا من الجزيئات لتلك المجموعات. في هذا البروتوكول، ويتم إرفاق جميع المجموعات الوظيفية الشائعة الثلاثة (الميثيل، الكربوكسيل، والأمينية). هو نسبة شماعة المختار إلى إعطاء الأولوية لكشف فلوري أولاً، ثم القدرة على دمج moiety استهداف ثانوي استخدام مجموعة حمض الكربوكسيلية. يمكن أنب نسب هذه الجماعات على أساس التطبيق، ويمكن تعديلها الأطوال والأشكال للبوليمرات كذلك.

لقياس امتصاص الجسيمات، نحن مترافق تحقيق فلورية إلى واحدة من المجموعات الوظيفية. تجدر الإشارة إلى أن أي تصريف تتجاوز ما وصفناها سيؤدي إلى تغيير الخصائص السطحية نانوحبيبات. وينبغي اختبار كل تكرار لجسيمات نانوية فيما يتعلق بمكونات إضافية وردود فعل تصريف للخصائص المطلوبة.

هذه الطريقة تنتج جسيمات نانوية الذهب أولتراسمال تهدف إلى التغلب على خصائص دفاعية جليكوكاليكس خارج الخلية البطانية، مما يعيق امتصاص جسيمات نانوية الحجم تقليديا. ومع ذلك، يضفي على صغر حجم صعوبة في التصوير والمخدرات تحميل الجانب. هذه الجسيمات أصغر بكثير من نطاق حجم نانوحبيبات نموذجية، ونتيجة للمساحة المتاحة للمرفقات للمداواة واستهداف مويتيس يتناقص إلى حد كبير. وهذا قد يؤدي إلى صعوبة التقاط الإشارات الفردية في التصوير التطبيقات، على الرغم من أن لا يزال يمكن سهولة تحديد مجموعات من الجزيئات، كما هو مبين في الصور [كنفوكل]. قد تتطلب السطح مخفضة للمرفقات لاستهداف يغاندس والمداواة جسيمات أكثر تدار لتحقيق متطلبات الجرعة المستهدفة. ومع ذلك، جسيمات أصغر ستكون أكثر كفاءة في تقديم عندما أخذ جليكوكاليكس عين الاعتبار.

هذه الجسيمات أولتراسمال الرواية القادرة على إيصالها إلى صعوبة التوصل إلى مجالات النانو داخل الجسم مع أقل قدر من الاضطراب المكروية. إضافة شماعة يسمح لزيادة توافق مع الحياة ويوفر المجموعات الوظيفية للتخصيص الثقيلة من الجسيمات لتطبيقات متنوعة. حجم أصغر بالمقارنة مع جسيمات نانوية نموذجي يأتي مع بعض أوجه القصور، ولكن إذا وضعت استراتيجيا، الجسيمات أولتراسمال نهجاً واعداً للسكن من الصعب اختراق، جليكوكاليكس المعقدة والهشة في الأوعية الدموية تسليم الاستهداف والمخدرات.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	795429
Gold (III) Chloride trihydrate (HAuCl4.3H2O)	Sigma Aldrich	520918
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Tetrakis (hydroxymethyl) phosphnium chloride	Sigma Aldrich	404861
Mono-functional mPEG-thiol	Layson Bio Inc.	MPEG-SH-2000-1g	Mw: 2,000 Da
hetero bi-functional anime-PEG-thiol	Layson Bio Inc.	NH2-PEG-SH-3400-1g	Mw: 3,400 Da
Carboxymethyl-PEG-thiol	Layson Bio Inc.	CM-PEG-SH-2000-1g	Mw: 2,000 Da
Cellulose dialysis membrane (12-14 kDa)	Sigma Aldrich	D9777
Zerostat anti-static instrument	Sigma Aldrich	Z108812
Alexa Fluor 647 (AF647) carboxylic acid succinimidyl ester	Fisher	A20006	Fluorophore
Fisherbrand Qualitative Grade Plain Filter Paper Circles - P5 grade	Thermo Fisher Scientific	09-801-B
Transmission electron microscopy	JEOL USA	JEOL JEM-1000	TEM
Dynamic Light Scattering	Brookhaven Instruments Corporation	Brookhaven 90 Plus Particle Size Analyzer	DLS
Fluorometer	Horiba Scientific	Jobin Yvon Fluromax 4	Fluorometer
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G3582	MTS
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax M4	Plate reader
10E4 epitope HS mouse monoclonal IgM antibody (primary antibody)	Amsbio	370255	Primary antibody
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (secondary antibody)	Thermo Fisher Scientific	R37120	Secondary antibody
VECTASHIELD mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1000	With DAPI
Confocal Microscope	Carl Zeiss Meditex AG	Zeiss LSM 700	Confocol microscopy