Синтез функционализированных 10-Нм полимерным покрытием частиц золота для ориентации эндотелия и доставки лекарств

Резюме

Мы описываем метод синтеза биологически наночастиц золота 10 Нм, функционализированных покрытие поли-этиленгликоля на поверхность. Эти частицы могут быть использоваться в пробирке и в естественных условиях для оказания терапии наноразмерных клеточной и внеклеточной пространств, трудно доступ с размерами обычных наночастиц.

Аннотация

В медицинских исследованиях из-за их размера, биосовместимость и изменяемые поверхности широко использовались наночастиц золота (AuNPs). Ориентации и наркотиков доставки являются некоторые из применений этих AuNPs, но эндотелиальной внеклеточной матрицы оборонительных свойства препятствуют частиц поглощения. Для решения этой проблемы, мы описываем метод синтеза для сверхмалых наночастиц золота для повышения сосудистого доставки, с настраиваемыми функциональными группами и полимерные длины для дальнейшей корректировки. Протокол урожайность 2,5 Нм AuNPs, покрытые тетракис (гидроксиметил) фосфониевых хлорид (THPC). Замена THPC с гетеро функциональные полиэтиленгликоля (PEG) на поверхности AuNP увеличивает гидродинамические радиус до 10,5 Нм при оказании различных функциональных групп на поверхности. Последняя часть протокола включает в себя факультативное добавление Флюорофор разрешить AuNPs быть визуализированы под флуоресценции для отслеживания наночастиц поглощения. Диализ и лиофилизации были использованы для очистки и изоляции AuNPs. Эти люминесцентные наночастицы могут быть визуализированы в экспериментах в пробирке и в естественных условиях благодаря биосовместимых PEG покрытия и флуоресцентных зондов. Кроме того диапазон размеров эти наночастицы делают их идеальным кандидатом для зондирования Гликокаликс без нарушения нормальной сосудистую функцию, которая может привести к улучшению доставки и терапии.

Введение

Наночастицы были применены для доставки лекарств и изображений для его способность перемещаться через тело, чтобы достичь целевых областей интерес^1,2. Частицы могут накапливаться внутри опухоли через сосудистую Дырявый или локализовать где целевой лигандом оверэкспрессировали и воздействию. Золото, в частности, стал часто используемые наночастиц материал из-за его уникальной химические и физические свойства, которые влияют на транспорт и выпуск терапии³. Золото является эффективным наночастиц материалом, потому что его поверхность может быть изменен для привязки к тиолами и обладает высокой биосовместимостью, из-за его низкой токсичности⁴. AuNPs могут быть перевозчиков наркотиков больших биомолекулярных и добились успеха в предоставлении пептиды, нуклеиновых кислот и белков, позволяя AuNPs быть благоприятной для ориентации^2,4.

К сожалению эффективность доставки наркотиков наночастиц сдерживается отрицательно заряженных Гликокаликс, который является внеклеточным пальто на мембраны для большинства клеток млекопитающих и имеет размеры поры до 7 Нм^5,6. Этот размер поры меньше, чем большинство перевозчиков наркотиков наночастиц, которые имеют типичный диапазон диаметров 50-200 Нм. В условиях болезнь эти поры Гликокаликс становится больше из-за деградации, увеличение проницаемости через эндотелиальных клеток. Однако большинство наночастиц все еще слишком велик, чтобы воспользоваться этой структурных изменений в Гликокаликс. Одним из следствий этой рассогласование размера является, что условно размера частиц не выгодно взаимодействовать с эндотелиальных клеток, которые выстилают кровеносных сосудов. Это влияет на поставки внутривенно управляемых частиц в эндотелия и можно сказать частиц транспорта через крови мозга барьер^7,8,9,10.

Один из подходов к борьбе с этой проблемы — использовать мелкие частицы проходят через мелкие поры в Гликокаликс. Здесь мы синтезировать 10,5 Нм сверхмалых золотых наночастиц, который обычно должен сдерживаться нетронутыми, здоровые Гликокаликс. Как только Гликокаликс начинает ставиться, наночастиц должны легко проникают в клетки путем увеличения размера пор. Протокол в этом документе подробно синтез сверхмалых золото ядра, покрытые PEG, который увеличивает биосовместимость и уменьшает системный клиренс⁴. ПРИВЯЗКИ также может содержать несколько типов функциональных групп, открывая возможности для сопряжения таргетинга лигандов, флуорофоров и терапии. Ранее опубликованные результаты показывают, что эти сверхмалых наночастиц, как правило, быть рассмотрен более благоприятно в регионах нарушается Гликокаликс эндотелиальной функции даже без каких-либо активной ориентации^4,11. Это указывает на целесообразность и важность использования частицы правильного размера для доставки приложений. Следующий протокол представляет синтеза, очистки и характеристика PEG-покрытием AuNPs (PEG-AuNP), с обсуждения для пошива функциональных групп и спряжения для других приложений.

протокол

1. подготовка или закупки запасов решений (храниться при комнатной температуре или заморожены до использования)

1. Подготовьте Стоковый раствор гидроксида натрия (NaOH) 1 М, растворяя 400 мг NaOH в 10 мл ультрачистая вода при комнатной температуре и смешивания материалов хорошо.
   Примечание: Ультрачистая вода определяется как вода без примесей, таких как частиц, бактерий, nucleases, ионы или следы органических веществ. Система очистки используется для получения сверхчистого воду, что приводит к его сопротивление до 18,2 mΩ·cm, указывающее низкий анионные загрязнения. Не рекомендуется использовать коммерчески доступных ультрачистая вода в бутылках. Отныне это ультрачистая вода будет именоваться воды, если не указано иное.
2. Подготовка 6M раствор NaOH, растворяя 2,4 г NaOH в 10 мл воды и хранить решение при комнатной температуре.
3. Подготовьте раствор 250 мм Тетрахлороауратовая кислоты (₄HAuCl), растворяя 1 g Сушеные HAuCl₄ в 10.16 мл воды. Разбавьте 1 мл 250 мм HAuCl₄ с 9 мл воды для получения рабочей концентрации 25 мм HAuCl₄. Хранят раствор₄ HAuCl при комнатной температуре.
4. Подготовьте 0,1 М карбонат буфера при pH 8.8, путем растворения бикарбоната натрия 84 мг в 10 мл воды и корректировка pH 8.8, добавив 6 M NaOH с шагом 1,2. Храните в карбонат буфер при комнатной температуре.
5. Смешать 20 мл tetrazolium смесь, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium соли (МТС), с стабилизирующий агент, мембранотропного ethosulfate (ГП) (см. Таблицу материалы). Храните смесь МТС/PES в аликвоты (для максимум 10 циклов замораживания оттаивания) при-20 ° C в темноте.

2. синтез ядер золотых наночастиц

1. Подготовить разбавленный раствор THPC путем добавления 12 мкл 80% THPC в воде до 1 мл воды в трубке microcentrifuge при комнатной температуре.
2. Закрепите флакон 100 мл круглым дном над центром Плиты магнитные перемешать. Налейте в флакон 45 мл воды и перемешайте воду на 300 об/мин, с использованием бар небольшой яйцевидной формы магнитной перемешать. Добавьте 0,5 мл 1 M NaOH и 1 мл разбавленного раствора THPC. Продолжать движение реакционную смесь энергично за 5 мин.
3. Продолжить перемешивая смесь и добавить 2 мл 25 мм HAuCl₄ решения. Цвет смеси будет меняться от желтого до темно-коричневого в течение нескольких секунд, о том, что формирование THPC ограничен AuNPs с отрицательным зарядом. Перемешайте смесь для дополнительных 15 минут для завершения формирования золотого ядер.

3. Добавление полимера Корона вокруг наночастиц золота

1. В течение периода 15 мин, описанные в шаге 2.3, подготовить КОЛЫШЕК решения путем растворения каждого из следующих в 1 мл воды в 4 мл стеклянных флаконов: 30 мг NH₂-PEG-SH; 7.5 мг m-PEG-SH; 7.5 мг СООН-PEG-SH.
   Примечание: Результирующая концентрация должна быть 8.8 M NH₂-PEG-SH, 3.75 M m-PEG-SH и 3,75 М СООН-PEG-ш.
2. После уменьшения перемешивания скорость решения в раунд нижней колбе до 100 об/мин, добавить привязки решения к решению THPC сборную AuNPs каплям. Продолжать движение смеси осторожно на ночь, при комнатной температуре, для обеспечения эффективного удаления THPC и замена ПЭГ.
3. Для следующего 72 h используйте 12-14 кДа молекулярный вес отсечки целлюлозы мембраны для dialyze перемешивают смесь против 4 L ведро воды, размешать в 60 об/мин. Связать концы мембраны диализа клипы и передача решение через пипетку.
   Примечание: Этот процесс диализа с 12-14 кДа отсечные мембранные удаляет только непрореагировавшего PEG, THPC и другие химические реактивы, путем диффузии по градиенту концентрации.
4. Для поддержания высокого градиента концентрации и поощрять непрерывный диффузии, измените воды каждые 2 ч для первой 6 h и каждые 6-12 ч для оставшихся 66 h.
   Примечание: Цель этой воды изменить расписание является для размещения быстрое распространение, которое происходит на ранней стадии, из-за первоначально высокой концентрации в образце. Процесс диализа описанные выше листья наночастиц решение частично очищенная, потому, что наночастицы, преципитаты, агрегатов и других примесей большого размера не могут пройти через поры мембраны отсечки кДа 12-14.
5. Фильтр решение частично очищенный наночастиц в 50-мл Конические трубки с помощью фильтра 0,2 мкм шприц для удаления оставшихся преципитаты, агрегатов и других примесей большого размера.
6. Место конические пробки в морозильной камере-80 ° C и позволяют очищенный Пегилированный AuNP (PEG-AuNP) решение заморозить около 5 ч.
7. Используйте Замораживание сушки для lyophilize очищенный PEG-AuNP.
8. Храните сухой, очищенный PEG-AuNP на 4 ° C до использования.

4. спряжение флуорофоров, используя N-оксисукцинимидного (NHS) Эстер на NH₂ группы на PEG-AuNP

1. Закрепите флакон 50 мл круглым дном над центром Плиты магнитные перемешать. Заполните колбу с 18 мл воды и перемешайте воду при 100 об/мин, с использованием бар-яйцевидной формы магнитной перемешать.
2. Весят 2 мг лиофилизированных PEG-AuNP в 4 мл Конические трубки, используя шкалу benchtop высокой точности. Используйте пистолет антистатические для устранения статический заряд и цепляясь PEG-AuNP порошка на поверхность трубки. Добавьте 2 мл воды в трубе. Залейте 2 мл раствора ПЭГ-AuNP в колбу круглым дном для дальнейшего приготовления в общей сложности 20 мл воды. Продолжать движение смеси при 100 об/мин, с использованием бар-яйцевидной формы магнитной перемешать.
3. Добавить 1 мл 0,1 м, рН 8,8 карбонат буфера до 20 мл восстановленный AuNP, содержащихся в колбу круглым дном. Продолжить помешивая.
4. 5 мкл 10 мг/мл Флуоресцентный Эстер NHS, в диметилсульфоксида.
   Примечание: Любые флуоресцентного красителя может использоваться в этом процессе. Перемешайте флуоресцентные КОЛЫШЕК на ночь. Держите его при комнатной температуре и покрыта фольгой.
5. Для следующего 72 h удалите излишки флуорофоров, используя протокол, описанные в шаге 3.3. Кратко dialyze перемешивают смесь, с использованием 4 L ведро воды и мембраной отсечки целлюлозы молекулярный вес 12-14 кДа. Меняйте воду каждые 2 ч для первой 6 часов и каждые 6-12 ч для оставшихся 66 h.
6. Получите 1 мл очищенной флуоресцентные PEG-AuNP решения, которые будут использоваться для определения характеристик, описанных ниже в разделе 5. Замораживание и lyophilize оставшийся раствор для получения флуоресцентных наночастиц в виде порошка для хранения при температуре 4 ° C, как описано в шагах 3,5-3,7.
7. Используйте фильтр 0.2 мкм шприц для стерилизации и удалить любые потенциальные преципитаты раз преобразован для приложений культуры клеток.

5. характеристика наночастиц флуоресцентные Пегилированный золото

1. С помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) для визуализации основных золотых наночастиц и количественного определения размеров
   1. Падение 10 мкл очищенный флуоресцентные PEG-AuNP раствор на углерода покрытием сетки ТЕА.
   2. После 5 минут используйте кусок фильтровальной бумаги чтобы тщательно фитиль от избыток жидкости от края сетки ТЕА до фильма, содержащий флуоресцентные, ПЭГ-AuNPs оставил позади.
   3. Просмотр флуоресцентные PEG-AuNPs на 80 кв и в масштабе 50 000-150 000. Сделайте цифровые фотографии.
      Примечание: Только золото ядро будет видна, потому что привязка не электронно плотной на ТЕА.
   4. С помощью измерительного программного обеспечения, установите шкалу измерений в корреляции с линейки шкалы. Рассчитать диаметр приблизительно 20 золото ядер, а затем определить среднее золото Диаметр.
      Примечание: Система электронного фотографирования ТЕА автоматически помещает линейки шкалы на цифровой фотографии.
2. Измерение размера гидродинамических наночастиц с помощью динамического рассеяния света (DLS)
   1. Перевод 1 мг лиофилизированных THPC покрытием AuNPs на пробки microcentrifuge, используя подход, описанный в шаге 4.2. Передача 1 мг лиофилизированные PEG-AuNP в отдельном трубку. Добавьте 1 mL воды к каждой пробке и передачи каждого решения AuNP 1 мл прозрачной пластиковой.
   2. Поместите кювету в DLS инструмент и измерения сферических гидродинамических диаметров с использованием программного обеспечения анализатор частиц, которая встроена в систему DLS.
   3. Участке измеренной гидродинамических диаметров, с использованием формата гистограммы.
      Примечание: Гистограмма будет группа наночастиц по размеру. Самая большая группа наночастиц будет уточнить диаметром, который лучше всего описывает размер AuNPs, синтезированных в настоящем Протоколе.
3. Флуориметрический флуоресценции подтверждение
   Примечание: Тот же образец и кювета из шага 5.2 может использоваться для измерения флуоресцентного сигнала.
   1. Удаление кювета из DLS и вставьте в spectrofluorometer. Набор сигналов возбуждения волны 633 нм и чтения испускаемого флуоресценции вдоль диапазон длин волн 650-800 Нм.
   2. Убедитесь, что пик около 665 нм, который коррелирует с пик выбросов для ГСЗ.
      Примечание: Отрегулируйте волны возбуждения и выбросов согласно Флюорофор, используемые в процессе.
4. МТС пробирного¹¹ оценить биосовместимость
   1. В 96-луночных ясно нижней стерильные культуры ткани лечение пластины, Пипетка 100 мкл Дульбекко изменение орла среды (DMEM; дополнен с 10% плода bovine сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина) и 3.2 x 10³ клеток в каждой скважине.
      Примечание: В этом исследовании, используются эндотелиальные клетки жировой ткани крыс. В общей сложности 21 скважин используются для проведения 3 репликация для каждого из 7 различных наночастиц концентрации (см. шаг 5.4.3 для конкретных концентраций интерес).
   2. Позволяют клеткам расти confluency в влажности и 5% CO₂ управляемые инкубаторы при 37 ° C¹¹.
   3. Подготовка отдельных microcentrifuge труб, каждая из которых содержит 300 мкл DMEM с наночастицами различных концентраций. Это исследование требует 7 различных труб DMEM с следующим PEG-AuNP концентрации: 0 мкг/мл, 10 мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/мл, 250 мкг/мл, 500 мкг/мл и 1000 мкг/мл.
   4. Аспирационная DMEM из трубки. Заполните скважин в трех экземплярах с 100 мкл DMEM СМИ, содержащий 0, 10, 50, 100, 250, 500 или 1000 мкг/мл AuNP.
   5. Разрешить клетки и наночастиц для совместного инкубации определённое количество времени, здесь для 16 h.
   6. В конце инкубационного периода оттепель МТС/PES смесь на шаге 1.5.
   7. После инкубации аспирационная DMEM и приостановлено, слабо прилагаемый наночастиц из скважин. 100 мкл свежие DMEM наряду с 20 мкл раствора МТС/PES для получения 1:5 МТС/PES DMEM соотношение согласно протоколу производителя. Инкубируйте клетки с МТС/PES при 37 ° C на 2 ч.
      Примечание: Время инкубации этот 2 h определяется метаболической активности эндотелиальных клеток и может быть увеличена до до 4 ч. для других типов клеток. В течение 2 ч метаболизируется МТС эндотелиальных клеток в цветной Формазаны, который смешивается с DMEM. Биосовместимость PEG-AuNP и вероятности жизнеспособности клеток будет продемонстрирована с более цветных Формазаны. Токсичность PEG-AuNP и вероятность того, что клетки умирают будет показан с менее интенсивным цветом.
   8. Колориметрические анализ каждой скважины, читая поглощения в 492 Нм с читателем совместимый пластины.
   9. Для каждого концентрацию наночастиц Вычислите среднее поглощение из трех экземплярах поглощения значений. Разделите среднее поглощение значение, полученное от усреднения поглощения в скважинах, содержащих наночастицы 0 мкг/мл.
      Примечание: Эти скважины, которые содержат не AuNPs служат элементы управления для расчета процент жизнеспособность клеток в ответ на наночастиц лечения в других скважин.
5. Оценки confocal микроскопии флуоресцирования наночастиц поглощения в адэрентных эндотелиальных клеток с нетронутыми или неблагополучных Гликокаликс¹¹
   1. Семя 1.0 x 10⁴ клетки/см² крыса жира площадку эндотелиальных клеток на стерильную 12 мм стекла coverslips и кормить клетки с DMEM дополнена 10% плода bovine сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина. Позволяют клеткам расти до полного confluency влажности и CO₂ управляемые инкубаторы при 37 ° C, для около 3 дней.
   2. Добавьте процедуры для изменения Гликокаликс, если применимо. Например 2 h лечения культивировали эндотелиальных клеток с 2.5 x 10^-6 ме heparinase III фермента снижается Гликокаликс раскалыванием конкретно ее компонент сульфат heparan.
      Примечание: Здоровый Гликокаликс могут быть смоделированы путем выращивания эндотелиальных клеток, как описано в шаге 5.5.1 без добавления ферментов деградации.
   3. С эндотелиальной Гликокаликс оставили неповрежденными или оказанные неблагополучных Инкубируйте эндотелиальных клеток с флуоресцентной AuNPs на 550 мкг/мл для 16 h или других желаемое время.
   4. Осторожно промойте клетки с 2 мл 37 ° C 1% бычьего сывороточного альбумина в фосфатный буфер (PBS, содержащий 100 мг/Л кальция и магния 100 мг/Л). Погружаться клетки в 2 мл 2% параформальдегида и глутаровый 0.1% в PBS и позволяют клеткам исправить за 30 мин при комнатной температуре.
   5. Удалите крепежные решения альдегид и вымыть клетки с комнатной температуре PBS для трех циклов 5-мин.
   6. Перед нанесением основное антитело разоблачить эндотелиальных клеток до 2% козьего сыворотки в PBS на 30 минут при комнатной температуре для блокирования сайтов связывания неспецифические. Клетки должны быть полностью покрыты блокирования решения.
   7. Инкубируйте эндотелиальных клеток на ночь с 1% анти heparan сульфат основное антитело в 2% козьего сыворотки в PBS в 4 ° C для обозначения heparan сульфат компонент Гликокаликс. Убедитесь, что фиксированные клетки находятся полностью в контакте с раствор антител.
   8. Следующий день, промывают антитела с комнатной температуре PBS для трех циклов 10 мин.
   9. Инкубируйте эндотелиальных клеток с 1:1,000 разрежения соответствующие флуоресцентные вторичные антитела для 30 мин при комнатной температуре, в темной или покрыта алюминиевой фольгой.
   10. Промойте вторичные антитела с комнатной температуре PBS для трех циклов 10 мин.
   11. Установите coverslip на скольжениях микроскопа с помощью анти затухания монтажа носитель, содержащий 4', 6-diamidino-2-phenylindole, дигидрохлорид (DAPI) для окрашивания ядер. Печать по краям coverslip, используя лак.
   12. Изображения флуоресцентных immunostained эндотелиальных клеток образцов с конфокальная микроскопия, используя синий, зеленый и далеко красный каналы для визуализации ядер, heparan сульфат Гликокаликс и наночастиц, соответственно.

Результаты

Синтезированные AuNPs, с THPC или PEG покрытием (рис. 1A и Рисунок 1B, соответственно), отражаются с ТЕА и размеры измеряются с помощью ТЕА и DLS для обеспечения надлежащего наночастиц распределения размеров частиц. Рисунок 2 показывает ТЕА изображение образца THPC-AuNP на 80 кв и 150000 крат. Диаметр в диапазоне THPC-AuNP частиц от 2-3 Нм, основанный на панели калибровки изображений ТЕА. Этот THPC-AuNP размер проявляется также в DLS размер измерения гистограммы показан на рисунке 2, в котором THPC покрытием AuNP это показано, что пик на 2,5 Нм. ПЭГилирование не видна под ТЕА как Полимеры являются не электронно плотной. ТЕА изображений образцов PEG-AuNP просто подтверждает наличие отдельных разрозненных частиц, который ожидается, потому что PEG полимер Корона вокруг наночастиц помощи в предотвращении агрегации. Для этих образцов PEG-AuNP, DLS размер измерения Гистограмма показывает сдвиг в пик, чтобы примерно 10,5 Нм на DLS. Вложения дальнейшего лигандами или наркотиков на функциональные группы повлияет на размер наночастиц, а также и должны быть приняты во внимание при измерении диаметра.

Появление Флюорофор (рис. 1 c) подтверждается с помощью флуориметр для измерения флуоресценции сигнал от образца наночастиц, как показано на рисунке 3. При возбуждении с длиной волны 633 нм, излучение измеряется иметь максимум от 660 до 672 Нм, который соответствует информации производителя продукта максимального излучения 665 нм. Аналогичным образом для обеспечения флуоресцентные реагирования должны быть проверены вложения других флуоресцентных зондов.

Биосовместимость частиц и жизнеспособности соответствующих клеток оцениваются с помощью МТС пробирного проверить относительную клеточный метаболизм МТС после 16 ч инкубации с различных концентраций наночастиц. Флюорофор конъюгированных Пегилированный AuNPs показывает без существенных токсичности, как указано на аналогичный уровень жизнеспособности клеток на всех концентрациях до 1 мг/мл (Рисунок 4A). Этот биосовместимость может меняться в зависимости от терапевтического или лиганд, придает остальных функциональных групп для дальнейшей настройки частицы. Наркотиков вложения имеют тенденцию к увеличению токсичности, но в зависимости от концентрации рабочей, он не может повлиять на жизнеспособность в значительной степени.

Поглощение люминесцентные, AuNPs (рис. 1 c) Пегилированный адэрентных клеток оценивается с помощью искусственного крыса эндотелиальные клетки жировой ткани с нетронутыми или неблагополучных Гликокаликс (рис. 4В). Дисфункциональные Гликокаликс условия достигаются путем добавления фермента heparinase III к культуре, что приводит к деградации компонент Гликокаликс сульфат heparan и ущерба матрица¹². Рисунок 4B показывает различные уровни поглощения PEG-AuNPs, как красные точки на вид поперечного сечения представитель эндотелиальных клеток. Здоровые Гликокаликс отпугивает поглощения этих золотых наночастиц, но значительное увеличение наблюдается при занятых¹¹фермента. Этот результат подчеркивает потенциал этих сверхмалых наночастиц доставить эндотелиальных клеток образом контролируется различных взаимодействий, которые основаны на здоровье Гликокаликс терапии.

Рисунок 1: схема наночастиц золота. (A) THPC покрытием AuNP наносферы перед заменой КОЛЫШЕК. (B) Пегилированный AuNP с 3 типами PEG окончаний, включая COOH, NH₂, CH₃. Голубые волны представляют собой полимер. (C) конъюгированных наночастицы для флуоресценции изображений. Красные звезды шоу флуорофоров, конъюгированных NH₂ функциональных групп. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: размер измерения наночастиц золота. Слева: ТЕА наночастиц золота до того КОЛЫШЕК на 80 кв и 150000 крат, с линейки шкалы показано. Справа: Гистограмма наночастиц размер измеряется DLS до (AuNP) и после замены (PEG-AuNP) THPC с ПЭГ. DLS результаты для THPC-покрытием AuNP количественно, что визуализируется на ТЕА. DLS PEG-покрытием AuNP результаты преодолеть проблему неспособности визуализировать ПЭГ по ТЕА благодаря полимеров, не будучи электронно плотной. ТЕА PEG-AuNP будет показывать только ядро золотых наночастиц и будет выглядеть так же как AuNP, THPC-ограничен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: флуоресценции данных флуоресцентные PEG-AuNP. Пика флуоресценции в 667 Нм матчи выбросов Флюорофор конъюгированных PEG-AuNP. А.е.: условные единицы.

Рисунок 4: сотовый взаимодействия с флуоресцентные PEG-AuNP. (A) клеток жизнеспособности (МТС метаболизм) участок для крыса жира площадку эндотелиальных клеток после совместного 16 ч инкубации с флуоресцентные PEG-AuNP. (B) конфокальный поперечные изображения фиксированной крыса жира площадку эндотелиальные клетки окрашивали DAPI для ядра (синий) и антитела против heparan сульфат, компонент Гликокаликс (зеленый). Верхнее изображение здорового Гликокаликс и нижней деградированных Гликокаликс слой; Существует значительно больше красной флуоресценцией из наночастиц в образце с деградированных Гликокаликс. Шкалы бар-10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Этот метод является эффективным методом для синтеза настраиваемый, сверхмалых КОЛЫШЕК с покрытием AuNPs. Важной частью этой процедуры является первоначальный формирования THPC максимум золота, наночастицы, который может быть подтвержден изменение цвета от желтого до коричневого, что будет происходить после того, как HAuCl4 был добавлен к содержимому в колбу круглым дном (шаг 2.3 протокол). Без изменения цвета показывает, что существует не наночастиц сформирован и что первоначальные шаги следует проверить и повторил прежде. В случае, если цвет изменится на нечто иное, чем коричневый Винно-красный или серый результате частицы, вероятно, не будет вокруг целевой 2,5 Нм и новой партии следует также.

После формирования ядро золото обмен THPC КОЛЫШЕК и очистительные процедуры содержат несколько ключевых шагов для успешного завершения протокола. Смешивание на ночь позволяет для замены реакции идти до конца. Неудачных очистки может произойти, если вода диализа не изменяется с установленной частотой. Агрегации и осаждение частиц также может возникать, если частицы остаются в диализа для более чем 72 ч. Другие потенциальные проблемы могут наблюдаться во время замораживания сушки. Если сверхмалых КОЛЫШЕК с покрытием AuNP решение не было полностью заморожено или лиофилизатор не был установлен корректно, образцы могут быть потеряны. Обратитесь к руководству лиофилизатор, некоторые виды оборудования могут потребоваться различные образцы препаратов.

Простота синтеза и биосовместимость результате частиц представляют преимущества использования этих PEG-AuNPs. Кроме того эти наночастицы имеют преимущество в состоянии взаимодействовать с наноразмерных клеточных структур, что подтверждается возможность выявления деградированных Гликокаликс путем поглощения этих наночастиц. Это преимущество может быть использованы для разработки новых методов лечения атеросклероза и превентивных мер. Помимо того, что мы представляем здесь, еще одно преимущество этого протокола, что она позволяет обширные настройки частиц, а также увеличение стабильности и возможностей хранения путем присоединения тиоловых, содержащие ПЭГ на наночастиц золота⁴. Другой конец цепи PEG может содержать любую функциональную группу, и множество молекул может быть конъюгированных для этих групп. В этом протоколе, прилагаются все три общих функциональных групп (метил, карбоксильные и аминокислот). Отношение КОЛЫШЕК, решили сначала приоритеты флуоресцентного обнаружения, то возможность включения вторичных таргетинга общие, с помощью группы карбоновые кислоты. Соотношения этих групп может быть tweaked на основании приложения, и также может быть скорректирована длины и формы полимеров.

Для измерения поглощения частиц, мы конъюгированных флуоресцентного зонда к одной из функциональных групп. Следует отметить, что любой спряжение за то, что мы описали приведет к изменению свойств поверхности наночастиц. Каждой итерации наночастиц в отношении дополнительных компонентов и спряжение реакции должны быть проверены на желаемые свойства.

Этот метод производит сверхмалых наночастиц золота, предназначенных для преодоления оборонительных свойства эндотелия внеклеточного Гликокаликс, что затрудняет усвоение условно размеров наночастиц. Однако малый размер одалживает к сложности в визуализации и наркотиков, Загрузка аспект. Эти частицы значительно меньше, чем типичный наночастиц размер диапазона, и в результате значительно уменьшается площадь поверхности для вложений терапии и ориентации постановление. Это может привести к сложности, собирание индивидуальных сигналов в визуализации приложений, хотя по-прежнему кластеры частиц могут быть легко определены, как показано в конфокальных изображения. Сокращение поверхности для вложений таргетинга лигандов и терапии может потребовать больше частиц под управлением для достижения цели дозировка требований. Однако мелкие частицы будет более эффективным в доставке, когда учетом Гликокаликс.

Эти Роман сверхмалых частиц способны доставки в трудно достичь наноразмерных областей внутри тела с минимальным ущербом микроокружения. Добавление привязки позволяет для увеличения биосовместимость и предлагает функциональные группы для настройки тяжелых частиц для различных приложений. Меньшего размера по сравнению с типичными наночастиц поставляется с некоторые недостатки, но если разработаны стратегически, сверхмалых частиц является перспективным подходом к размещение трудно проникнуть, сложных и хрупких Гликокаликс в сосудистой Доставка ориентации и наркотиков.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	795429
Gold (III) Chloride trihydrate (HAuCl4.3H2O)	Sigma Aldrich	520918
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Tetrakis (hydroxymethyl) phosphnium chloride	Sigma Aldrich	404861
Mono-functional mPEG-thiol	Layson Bio Inc.	MPEG-SH-2000-1g	Mw: 2,000 Da
hetero bi-functional anime-PEG-thiol	Layson Bio Inc.	NH2-PEG-SH-3400-1g	Mw: 3,400 Da
Carboxymethyl-PEG-thiol	Layson Bio Inc.	CM-PEG-SH-2000-1g	Mw: 2,000 Da
Cellulose dialysis membrane (12-14 kDa)	Sigma Aldrich	D9777
Zerostat anti-static instrument	Sigma Aldrich	Z108812
Alexa Fluor 647 (AF647) carboxylic acid succinimidyl ester	Fisher	A20006	Fluorophore
Fisherbrand Qualitative Grade Plain Filter Paper Circles - P5 grade	Thermo Fisher Scientific	09-801-B
Transmission electron microscopy	JEOL USA	JEOL JEM-1000	TEM
Dynamic Light Scattering	Brookhaven Instruments Corporation	Brookhaven 90 Plus Particle Size Analyzer	DLS
Fluorometer	Horiba Scientific	Jobin Yvon Fluromax 4	Fluorometer
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G3582	MTS
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax M4	Plate reader
10E4 epitope HS mouse monoclonal IgM antibody (primary antibody)	Amsbio	370255	Primary antibody
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (secondary antibody)	Thermo Fisher Scientific	R37120	Secondary antibody
VECTASHIELD mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1000	With DAPI
Confocal Microscope	Carl Zeiss Meditex AG	Zeiss LSM 700	Confocol microscopy