Sintesi di particelle d'oro rivestite di polimeri 10-nm funzionalizzate per il Targeting di endotelio e Drug Delivery

Riepilogo

Descriviamo un metodo di sintesi biocompatibile nanoparticelle d'oro di 10 nm, funzionalizzate di glicole di polietilene rivestimento sulla superficie. Queste particelle possono essere usate in vitro e in vivo per la consegna di terapeutica a scala nanometrica cellulare ed extracellulare spazi che sono difficilmente accessibili con dimensioni delle nanoparticelle convenzionali.

Abstract

Nanoparticelle d'oro (AuNPs) sono stati ampiamente utilizzate nella ricerca medica a causa della loro dimensione, della biocompatibilità e superficie modificabile. Consegna di targeting e droga specifica sono alcune delle applicazioni di questi AuNPs, ma l'assorbimento delle particelle di endoteliale extracellulare proprietà difensive ceste. Per risolvere questo problema, descriviamo un metodo di sintesi per ultrasmall nanoparticelle d'oro migliorare la consegna vascolare, con gruppi funzionali personalizzabili e lunghezze di polimero per ulteriori regolazioni. Il protocollo rendimenti 2.5 nm AuNPs che sono ricoperti con cloruro di tetrachis (idrossimetil) fosfonio (THPC). La sostituzione di THPC con etero-funzionali polietilenglicole (PEG) sulla superficie della AuNP aumenta il raggio idrodinamico a 10.5 nm, fornendo vari gruppi funzionali sulla superficie. L'ultima parte del protocollo include un'aggiunta facoltativa di un fluoroforo per consentire il AuNPs possano essere visualizzati sotto fluorescenza per monitorare l'assorbimento delle nanoparticelle. Dialisi e liofilizzazione sono stati utilizzati per purificare e isolare il AuNPs. Queste nanoparticelle fluorescenti possono essere visualizzate in esperimenti sia in vitro che in vivo a causa della biocompatibile sonde PEG fluorescente e verniciatura. Inoltre, la gamma di queste nanoparticelle dimensioni li rendono un candidato ideale per sondare il glicocalice senza interrompere la funzione di normale vascolarizzazione, che può portare a una migliore consegna e terapeutica.

Introduzione

Le nanoparticelle sono state applicate per la somministrazione di farmaci e di imaging per la sua capacità di passare attraverso il corpo per raggiungere le zone di destinazione di interesse^1,2. Le particelle possono accumularsi all'interno dei tumori attraverso il sistema vascolare che perde o localizzare dove un ligando bersaglio è overexpressed ed esposti. Oro, in particolare, è diventato un materiale comunemente usato nanoparticelle grazie alle sue proprietà chimiche e fisiche uniche che influiscono sul trasporto e rilascio di terapeutica³. Oro è un materiale di nanoparticella efficace perché la sua superficie può essere modificata per associare ai tioli e ha elevata biocompatibilità a causa della sua bassa tossicità⁴. AuNPs sono in grado di essere portatori di farmaci biomolecolari grandi e hanno avuto successo nella realizzazione di peptidi, acidi nucleici e proteine, consentendo AuNPs essere favorevole per il targeting^2,4.

Purtroppo, l'efficacia di consegna di droga delle nanoparticelle è stata ostacolata dal glicocalice carica negativa, che è il cappotto extracellulare sulla membrana di cellule di mammifero più e ha dimensioni dei pori di fino a 7 nm^5,6. Questo formato del poro è minore della maggior parte dei vettori di droga di nanoparticelle, che hanno diametri tipici che vanno da 50-200 nm. In condizioni di malattia, questi pori glicocalice diventano più grandi a causa della degradazione, aumentando la permeabilità attraverso alle cellule endoteliali. Tuttavia, la maggior parte delle nanoparticelle sono ancora troppo grandi per sfruttare questo cambiamento strutturale nel glicocalice. Una implicazione di questa mancata corrispondenza dimensione è che particelle di dimensioni convenzionalmente non interagiscono favorevolmente con le cellule endoteliali che allineano i vasi sanguigni. Questo incide sul rilascio di particelle per via endovenosa amministrate nell'endotelio e può anche essere detto del trasporto di particelle attraverso il sangue del cervello barriera^7,8,9,10.

Un approccio per combattere questo problema è di utilizzare le più piccole particelle di passare attraverso i piccoli pori nel glicocalice. Qui, sintetizziamo un 10,5 nm ultrasmall oro di nanoparticelle, che normalmente dovrebbero essere scoraggiato da glicocalice intatto, sano. Una volta che il glicocalice comincia a essere compromessa, nanoparticella dovrebbe facilmente penetrare le cellule attraverso la crescente dimensione dei pori. Il protocollo in questa carta i dettagli di una sintesi di ultrasmall anima oro rivestito con PEG, che aumenta la biocompatibilità e riduce la clearance sistemica⁴. La PEG può contenere anche diversi tipi di gruppi funzionali, aprendo nuove strade per coniugazione di targeting ligandi, fluorofori e terapeutica. Precedentemente i risultati pubblicati indicano che queste nanoparticelle ultrasmall tendono ad essere preso più favorevole nelle regioni del glicocalice endoteliale perturbato funzione anche senza qualsiasi attivo targeting^4,11. Questo indica la fattibilità e l'importanza di utilizzare particelle di dimensione corretta per applicazioni di consegna. Il seguente protocollo presenta la sintesi, purificazione e caratterizzazione del AuNPs rivestite con PEG (PEG-AuNP), con la discussione per la sartoria i gruppi funzionali e coniugazioni per altre applicazioni.

Protocollo

1. preparazione o approvvigionamento di soluzioni Stock (che va conservato a temperatura ambiente o congelate fino all'utilizzo)

1. Preparare una soluzione stock di 1 M di idrossido di sodio (NaOH) sciogliendo 400 mg NaOH in 10 mL di acqua distillata a temperatura ambiente, e mescolando bene i materiali.
   Nota: Acqua ultrapura è definita come acqua senza impurità quali polveri, batteri, nucleasi, ioni o tracce di sostanze organiche. Un sistema di depurazione viene utilizzato per ottenere l'acqua ultrapura, con conseguente sua resistività di mΩ·cm fino a 18,2, che indica una bassa contaminazione anionica. Non è raccomandato l'uso di acqua ultrapura in bottiglia disponibile in commercio. D'ora in poi, questa acqua ultrapura si riferisce come acqua, se non diversamente specificato.
2. Preparare una soluzione stock di 6M NaOH sciogliendo 2,4 g di NaOH in 10 mL di acqua e conservare la soluzione a temperatura ambiente.
3. Preparare una soluzione stock di 250 mM di acido cloroaurico (HAuCl₄) sciogliendo 1 g di secchi HAuCl₄ a 10,16 mL di acqua. Diluire 1 mL di 250 mM HAuCl₄ con 9 mL di acqua per ottenere la concentrazione di lavoro di 25 mM HAuCl₄. Conservare la soluzione di₄ HAuCl a temperatura ambiente.
4. Preparare un tampone di carbonato di 0.1 M a pH 8.8, bicarbonato di sodio 84 mg in 10 mL di acqua di dissoluzione e regolando il pH a 8,8 aggiungendo 6 M NaOH dal punto 1.2. Conservare il tampone di carbonato a temperatura ambiente.
5. Mescolare 20 mL di tetrazolium compound, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium sale (MTS), con un agente di stabilizzazione, fenazina ethosulfate (PES) (Vedi Tabella materiali). Conservare la miscela MTS/PES nelle aliquote (per un massimo di 10 cicli di gelo-disgelo) a-20 ° C nel buio.

2. sintesi dei nuclei di nanoparticelle d'oro

1. Preparare una soluzione diluita di THPC aggiungendo 12 µ l 80% THPC in acqua per 1 mL di acqua in un tubo del microcentrifuge a temperatura ambiente.
2. Fissare un pallone a fondo rotondo da 100 mL sopra il centro di una piastra magnetica. Versare 45 mL di acqua nel pallone e mescolare l'acqua a 300 giri/min utilizzando un piccolo uovo-a forma di ancoretta magnetica. Aggiungere 0,5 mL di NaOH M 1 e 1 mL di soluzione diluita di THPC. Continuare a mescolare la miscela di reazione vigorosamente per 5 min.
3. Continuare a mescolare il composto e aggiungere 2 mL di 25 mM HAuCl₄ soluzione. Il colore della miscela cambierà da giallo a marrone scuro in pochi secondi, che indica che la formazione di THPC capped AuNPs con una carica negativa. Mescolare il composto per altri 15 minuti consentire la formazione completa dei nuclei d'oro.

3. aggiunta del polimero Corona intorno le nanoparticelle d'oro

1. Durante il periodo di 15 min descritto al punto 2.3, preparate il PEG soluzioni sciogliendo ciascuno dei seguenti in 1 mL di acqua in flaconcini di vetro da 4 mL: 30 mg NH₂-PEG-SH; 7,5 mg m-PEG-SH; 7,5 mg COOH-PEG-SH.
   Nota: Le concentrazioni risultante dovrebbero essere 8,8 M NH₂-PEG-SH, 3,75 M m-PEG-SH e 3,75 M COOH-PEG-SH.
2. Dopo la riduzione della velocità dell'agitatore della soluzione nella beuta di fondo tondo a 100 giri/minuto, aggiungere che le soluzioni di PEG per la soluzione di THPC capped AuNPs goccia a goccia. Continuare a mescolare il composto delicatamente durante la notte, a temperatura ambiente, per garantire un'efficiente rimozione di THPC e la sostituzione di PEG.
3. Per il prossimo 72 h, è necessario utilizzare una membrana di cellulosa taglio peso molecolare di 12-14 kDa per Dializzare la miscela agitata contro un secchio di 4 L d'acqua agitata a 60 giri/min. Legare le estremità delle membrane da clips di dialisi e trasferire la soluzione tramite pipetta.
   Nota: Questo processo di dialisi con la membrana cut-off di 12-14 kDa rimuove solo PEG non reagita, THPC e altri reagenti chimici, di diffusione lungo un gradiente di concentrazione.
4. Per mantenere alto gradiente di concentrazione e promuovere la diffusione di continuo, è necessario cambiare l'acqua ogni 2 h per le prime 6 ore e ogni 6-12 h per le rimanenti 66 h.
   Nota: Lo scopo di questa acqua cambia pianificazione è quello di ospitare la rapida diffusione che si verifica all'inizio a causa della concentrazione inizialmente elevata all'interno del campione. Il processo di dialisi descritto sopra foglie, la soluzione di nanoparticelle semipurificata, perché le nanoparticelle, precipitati, aggregazioni e altre impurità di grandi dimensioni non può passare attraverso i pori della membrana di cut-off di 12-14 kDa.
5. Filtrare la soluzione semipurificata nanoparticella in una provetta conica da 50mL utilizzando un filtro da 0,2 µm siringa per rimuovere i rimanenti precipitati, aggregazioni e altre impurità di grandi dimensioni.
6. Collocare la provetta conica in un congelatore a-80 ° C e lasciare agire la soluzione purificata PEGylated AuNP (PEG-AuNP) di congelare per circa 5 ore.
7. Utilizzare un congelamento essiccatore per lyophilize il PEG-AuNP purificata.
8. Memorizzare il secco, purificata PEG-AuNP a 4 ° C fino all'utilizzo.

4. coniugando fluorofori usando l'estere N-Idrossisuccinimide (NHS) sul NH₂ gruppi su PEG-AuNP

1. Fissare un pallone a fondo rotondo da 50 mL sopra il centro di una piastra magnetica. Riempire il pallone con 18 mL di acqua e mescolare l'acqua a 100 rpm usando un'ancoretta magnetica a forma di uovo.
2. Pesare 2 mg del liofilizzato PEG-AuNP in una provetta conica da 4 mL, utilizzando una scala di benchtop di alta precisione. Utilizzare una pistola antistatica per eliminare le cariche elettrostatiche e l'attaccamento della polvere PEG-AuNP alla superficie del tubo. Aggiungere 2 mL di acqua nella provetta. Versare i 2 mL di soluzione di PEG-AuNP nel pallone fondo tondo per ulteriore ricostituzione in un totale di 20 mL di acqua. Continuare a mescolare il composto a 100 rpm usando un'ancoretta magnetica a forma di uovo.
3. Aggiungere 1 mL di 0,1 M, pH 8.8 carbonato buffer per i 20 mL del ricostituito AuNP contenuta in un matraccio a fondo arrotondato. Continuare a mescolare.
4. Aggiungere 5 µ l di estere NHS fluorescente di 10 mg/mL in solfossido dimetilico.
   Nota: Qualsiasi colorante fluorescente può essere utilizzato in questo processo. Mescolare il PEG fluorescente durante la notte. Tenerlo a temperatura ambiente e coperto di stagnola.
5. Per il prossimo 72 h, rimuovere fluorofori in eccesso utilizzando il protocollo descritto al punto 3.3. Brevemente, Dializzare la miscela agitata con un secchio di 4 L di acqua e una membrana di cellulosa taglio peso molecolare di 12-14 kDa. Cambiare l'acqua ogni 2 h per le prime 6 h e ogni 6-12 h per le rimanenti 66 h.
6. Prelevare 1 mL della soluzione PEG-AuNP fluorescente purificata, da utilizzarsi per caratterizzazione descritto nella sezione 5. Congelare e lyophilize la soluzione rimanente per ottenere nanoparticelle fluorescenti nella forma in polvere per conservazione a 4 ° C, come descritto nei passaggi 3.5-3.7.
7. Utilizzare un filtro per siringa 0,2 µm per sterilizzare e rimuovere qualsiasi potenziale precipitati una volta ricostituiti per applicazioni della coltura delle cellule.

5. caratterizzazione di nanoparticelle fluorescenti PEGylated oro

1. Utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per visualizzare il nucleo delle nanoparticelle di oro e quantificare le dimensioni
   1. Goccia 10 µ l della soluzione PEG-AuNP fluorescente purificata su una griglia di carbonio rivestito maglia TEM.
   2. Dopo 5 min, è possibile utilizzare un pezzo di carta da filtro per stoppino accuratamente il liquido in eccesso lontano dal bordo della griglia TEM fino un film contenente il fluorescente che PEG-AuNPs è lasciato alle spalle.
   3. Mostra il PEG-AuNPs fluorescente a 80 kV e un ingrandimento di 50.000-150, 000. Scatta foto digitali.
      Nota: Solo il nucleo dell'oro sarà visibile perché la PEG non è elettrone denso il TEM.
   4. Utilizzando un software di misurazione, impostare la scala di misurazione in correlazione con la barra della scala. Calcolare il diametro di circa 20 Core d'oro e quindi determinare il diametro del nucleo oro medio.
      Nota: Il sistema di imaging TEM inserisce automaticamente una barra di scala sulle immagini digitali.
2. Misurazione delle dimensioni delle nanoparticelle idrodinamico utilizzando diffusione dinamica della luce (DLS)
   1. Trasferire 1 mg di liofilizzato AuNPs rivestite con THPC in una microcentrifuga utilizzando l'approccio descritto al punto 4.2. Trasferire 1 mg di liofilizzato PEG-AuNP in un tubo separato. Aggiungere 1 mL di acqua a ciascuna provetta e trasferire ogni soluzione AuNP a un 1 mL in plastica trasparente.
   2. Disponga una provetta in un strumento DLS e misurare i diametri idrodinamici sferici utilizzando il software di analizzatore di particelle che è incorporato nel sistema liste di distribuzione.
   3. Tracciare i diametri idrodinamici misurati utilizzando un formato di istogramma.
      Nota: L'istogramma raggrupperà le nanoparticelle di dimensione. Il più grande gruppo delle nanoparticelle chiarirà il diametro che meglio descrive le dimensioni del AuNPs sintetizzato in questo protocollo.
3. Conferma di fluorescenza fluorometrica
   Nota: Il campione stesso e la cuvetta dal punto 5.2 può essere utilizzati per misurare il segnale fluorescente.
   1. Rimuovere la provetta da liste di distribuzione e inserire una spettrofluorimetro. Insieme della lunghezza d'onda di eccitazione a 633 nm e leggi la fluorescenza emessa segnali lungo un intervallo di lunghezza d'onda di 650-800 nm.
   2. Confermare che il picco è di circa 665 nm, che correla al picco di emissione per NHS.
      Nota: Regolare le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione secondo il fluoroforo utilizzato nel processo.
4. ¹¹ per valutare la biocompatibilità di analisi MTS
   1. In un fondo chiaro 96 pozzetti sterili per coltura trattato piastra, pipettare 100 µ l di terreno dell'Aquila per volta di Dulbecco (DMEM; completati con 10% fetale bovino del siero e l'1% penicillina/streptomicina) e 3.2 x 10³ celle in ogni pozzetto.
      Nota: In questo studio, le cellule endoteliali del rilievo grasso di ratto sono utilizzate. Un totale di 21 pozzi vengono utilizzati per consentire per 3 repliche per ciascuna delle 7 concentrazioni differenti di nanoparticelle (Vedi punto 5.4.3 per concentrazioni specifiche di interesse).
   2. Permettono alle cellule di crescere alla confluenza in umidità e 5% CO₂ controllata incubatrici a 37 ° C¹¹.
   3. Preparare microcentrifuga individuali, ciascuna contenente 300 µ l di DMEM con nanoparticelle di varie concentrazioni. Questo studio richiede 7 diversi tubi di DMEM con le seguenti concentrazioni di PEG-AuNP: 0 µ g/mL, 10 µ g/mL, 50 µ g/mL, 100 µ g/mL, 250 µ g/mL, 500 µ g/mL e 1.000 µ g/mL.
   4. Aspirare il DMEM dal tubo. Riempire i pozzetti in triplice copia con 100 µ l di supporto DMEM contenente 0, 10, 50, 100, 250, 500 o 1.000 µ g/mL di AuNP.
   5. Consentire le cellule e le nanoparticelle co-Incubare per un periodo predeterminato di tempo, qui per 16 h.
   6. Verso la fine del periodo d'incubazione, scongelare la miscela di MTS/PES da passo 1,5.
   7. Dopo l'incubazione, aspirare il DMEM e le nanoparticelle sospese, vagamente collegate dai pozzi. Aggiungere 100 µ l di DMEM fresco insieme a 20 µ l di soluzione MTS/PES per ottenere 1:5 MTS/PES al rapporto di DMEM secondo il protocollo del produttore. Incubare le cellule con MTS/PES a 37 ° C per 2 h.
      Nota: Questo tempo di incubazione di 2 h è determinato dall'attività metabolica delle cellule endoteliali e può essere aumentato fino a 4 h per altri tipi di cellule. Entro il periodo di 2 h, la MTS è metabolizzato dalle cellule endoteliali in formazano colorata che si mescola con il DMEM. Biocompatibilità di PEG-AuNP e la probabilità di attuabilità delle cellule sarà dimostrati con formazan più colorata. Tossicità di PEG-AuNP e la possibilità che le cellule stanno morendo verrà mostrato con colore meno intenso.
   8. Eseguire analisi colorimetrica dei pozzetti leggendo l'assorbanza a 492 nm con un lettore di piastra compatibile.
   9. Per ogni concentrazione di nanoparticelle, calcolare l'assorbanza media da valori di assorbenza in triplice copia. Dividere l'assorbanza media per il valore ottenuto da una media di assorbanza in pozzetti contenenti nanoparticelle di 0 µ g/mL.
      Nota: Questi pozzi che non contengono nessun AuNPs fungono da controlli per il calcolo percentuale la vitalità cellulare in risposta al trattamento di nanoparticella amministrato in altri pozzi.
5. Valutazione di microscopia confocal di fluorescenza dell'assorbimento delle nanoparticelle in cellule endoteliali aderente con intatto o disfunzionale glicocalice¹¹
   1. Seme 1.0 x 10⁴ cellule/cm² ratto grasso pad cellule endoteliali su lamelle di vetro sterile 12 mm e nutrire le cellule con DMEM completati con 10% fetale bovino del siero e l'1% penicillina/streptomicina. Permettono alle cellule di crescere a pieno confluency di umidità e CO₂ controllata incubatori a 37 ° C, per circa 3 giorni.
   2. Aggiungere trattamenti per modificare il glicocalice, se applicabile. Ad esempio, 2 trattamenti di h delle cellule endoteliali coltivate con 2,5 x 10^-6 IU eparinasi enzima degrada il glicocalice fendendo specificamente relativo componente del solfato di heparan.
      Nota: Glicocalice sano possa essere modellati coltivando le cellule endoteliali, come descritto al punto 5.5.1 senza l'aggiunta di enzimi di degradazione.
   3. Con il glicocalice endoteliale lasciato intatto o reso disfunzionale, incubare le cellule endoteliali con AuNPs fluorescente a 550 µ g/mL per 16 h o altro tempo desiderato.
   4. Lavare delicatamente le cellule con 2 mL di albumina di siero bovino di 37 ° C 1% in tampone fosfato salino (PBS; contenente 100 mg/L calcio e magnesio 100 mg/L). Immergere le cellule in 2 mL di 2% paraformaldeide e 0,1% glutaraldeide in PBS e permettono alle cellule di difficoltà per 30 min a temperatura ambiente.
   5. Rimuovere la soluzione di fissaggio aldeide e lavare le cellule con temperatura ambiente PBS per tre cicli di 5 min.
   6. Prima dell'applicazione di anticorpo primario, esporre le cellule endoteliali al siero di capra 2% in PBS per 30 min a temperatura ambiente per bloccare i siti di legame non specifico. Le cellule devono essere completamente coperti dalla soluzione bloccante.
   7. Incubare le cellule endoteliali durante la notte con l'anticorpo primario di 1% anti-eparan solfato in siero di capra 2% in PBS a 4 ° C per etichettare il componente di solfato di eparan del glicocalice. Assicurarsi che le celle fisse siano completamente a contatto con la soluzione di anticorpo.
   8. Il giorno dopo, lavare l'anticorpo con temperatura ambiente PBS per tre cicli di 10 min.
   9. Incubare le cellule endoteliali con 1:1,000 diluizione dell'anticorpo secondario fluorescente appropriato per 30 min a temperatura ambiente, in scuro o coperto con carta stagnola.
   10. Lavare l'anticorpo secondario con temperatura ambiente PBS per tre cicli di 10 min.
   11. Montare il vetrino coprioggetto su vetrini da microscopio utilizzando un mezzo di montaggio anti-dissolvenza contenente 4', 6-diamidino-2-phenylindole, dicloridrato (DAPI) per nuclei di colorazione. Sigillare i bordi del coprivetrino con smalto.
   12. Immagine la cellula endoteliale fluorescente immunostained campioni con microscopia confocale, utilizzando canali lontano rossi, verde e blu per visualizzare i nuclei, eparan solfato glicocalice e le nanoparticelle, rispettivamente.

Risultati

Il AuNPs sintetizzato, rivestito con THPC o PEG (Figura 1A e Figura 1B, rispettivamente), sono imaged con TEM e le particelle di dimensioni sono misurate utilizzando il TEM e liste di distribuzione per garantire la distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle corretta. La figura 2 Mostra l'immagine TEM di un campione di THPC-AuNP a 80 kV e 150.000 x ingrandimento. I diametri della gamma THPC-AuNP particelle da 2-3 nm, basato sulla barra di calibrazione in immagini TEM. Questa dimensione THPC-AuNP è evidente anche l'istogramma di misurazione della dimensione DLS illustrato nella Figura 2, in cui ha ricoperto il THPC AuNP è indicato per avere un picco a 2,5 nm. PEGilazione non è visibile sotto TEM come i polimeri non sono densi dell'elettrone. Formazione immagine TEM di PEG-AuNP campioni semplicemente conferma la presenza di singole particelle disperse, che è previsto perché la corona di polimeri di PEG intorno le nanoparticelle aiutare nella prevenzione di aggregazione. Per questi esempi di PEG-AuNP, l'istogramma di misurazione dimensione DLS Mostra un cambiamento nel picco, a circa 10.5 nm su liste di distribuzione. Allegati di altri ligandi o farmaci su gruppi funzionali urterà la dimensione della nanoparticella pure e dovrebbero essere presi in considerazione quando si misura il diametro.

L'aggiunta del fluoroforo (Figura 1) è confermato usando un fluorometro misurare il segnale di fluorescenza da un campione di nanoparticelle, come mostrato nella Figura 3. Quando eccitato con una lunghezza d'onda di 633 nm, l'emissione è misurata per avere un massimo tra 672 e 660 nm, che corrisponde a informazioni di prodotto del produttore di massima emissione a 665 nm. Collegamento delle altre sonde fluorescenti di deve essere controllato in modo simile per garantire la risposta fluorescente.

La biocompatibilità delle particelle e attuabilità delle cellule correlate sono valutati usando l'analisi MTS per controllare il metabolismo cellulare relativa di MTS dopo 16 h di incubazione con varie concentrazioni di nanoparticelle. Il fluoroforo coniugati PEGylated AuNPs non dimostra nessuna tossicità significativa, come indicato dai livelli simili di attuabilità delle cellule a tutte le concentrazioni fino a 1 mg/mL (Figura 4A). La biocompatibilità possono cambiare a seconda della terapeutica o il ligando attaccato ai rimanenti gruppi funzionali per personalizzare ulteriormente le particelle. Allegati di droga tendono ad aumentare la tossicità, ma secondo le concentrazioni di lavoro, non può interessare la redditività in modo significativo.

L'assorbimento di PEGylated AuNPs (Figura 1) di cellule aderenti, fluorescente viene valutata utilizzando cellule endoteliali coltivate del ratto cuscinetto adiposo con glicocalice intatto o disfunzionale (Figura 4B). Le condizioni di glicocalice disfunzionale si ottengono aggiungendo dell'enzima eparinasi III alla cultura, conseguente a una degradazione del componente glicocalice eparan solfato e compromettere la matrice¹². Figura 4B Mostra i diversi livelli di assorbimento di PEG-AuNPs, come puntini rossi sulla vista della sezione trasversale delle cellule endoteliali rappresentative. Un sano glicocalice scoraggia l'assorbimento di queste nanoparticelle di oro, ma si osserva un aumento sostanza quando l'enzima è autonomo¹¹. Questo risultato evidenzia il potenziale di queste nanoparticelle ultrasmall per consegnare terapeutica alle cellule endoteliali in maniera controllata dalle interazioni distinti che si basano sulla salute di glicocalice.

Figura 1: schemi di nanoparticelle di oro. (A) THPC rivestito AuNP nanosphere prima sostituzione PEG. (B) PEGylated AuNP con 3 tipi di terminazioni di PEG, inclusi COOH, NH₂e CH₃. Onde blu rappresentano il polimero. (C) coniugato nanoparticelle per l'imaging di fluorescenza. Stelle rosse mostrano i fluorophores coniugato a NH₂ gruppi funzionali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: dimensioni misure di nanoparticelle di oro. A sinistra: TEM di nanoparticelle d'oro prima dell'aggiunta di PEG a 80 kV e 150.000 ingrandimenti, con barra di scala mostrata. A destra: Istogramma delle dimensioni delle nanoparticelle misurata da DLS prima (AuNP) e dopo il rimontaggio (PEG-AuNP) il THPC con PEG. I risultati DLS per rivestite con THPC AuNP quantificano ciò che è visualizzato da TEM. I risultati di DLS PEG-rivestito AuNP vincere la sfida dell'incapacità di visualizzare PEG di TEM a causa i polimeri non essendo elettrone denso. Un TEM di PEG-AuNP mostrerà solo le nanoparticelle core oro e avranno lo stesso aspetto come un AuNP THPC-ricoperto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: dati di fluorescenza del fluorescente PEG-AuNP. Il picco di fluorescenza a 667 nm partite, l'emissione del fluoroforo coniugato al PEG-AuNP. A.U.: unità arbitrarie.

Figura 4: Cell interazioni con il fluorescente PEG-AuNP. (A) trama di redditività (metabolismo MTS) cella per grasso ratto pad cellule endoteliali dopo 16 h di co-incubazione con fluorescente PEG-AuNP. (B) di immagini a sezione trasversale di Confocal di grasso ratto fisso pad di cellule endoteliali macchiate con DAPI per i nuclei (blu) e l'anticorpo contro l'eparan solfato, un componente di glicocalice (verde). Immagine in alto è un glicocalice sano e fondo è uno strato di glicocalice degradate; C'è significativamente più fluorescenza rossa da nanoparticelle nel campione con glicocalice degradati. Barra della scala è 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questa tecnica è un metodo efficace per la sintetizzazione personalizzabile, che PEG ultrasmall rivestito AuNPs. Una parte importante di questa procedura è che la formazione iniziale di THPC capped oro nanoparticelle, che possono essere confermate con il cambiamento di colore dal giallo al marrone che si verificherà dopo HAuCl4 è stato aggiunto al contenuto nel pallone fondo tondo (punto 2.3 del protocollo). Nessun cambiamento di colore indica che non vi siano nessun nanoparticelle formate e che i passi iniziali devono essere verificati e ripetuti prima di procedere. Nel caso in cui che il colore cambia in qualcosa di diverso da marrone come il vino rosso o grigio, le particelle risultanti non sarà probabilmente intorno la destinazione 2.5 nm e un nuovo lotto dovrebbe essere fatta pure.

Dopo la formazione del nucleo d'oro, lo scambio di THPC per PEG e le procedure di purificazione contengono diversi passaggi chiave per completamento del protocollo. Una notte di miscelazione permette per la reazione di sostituzione andare fino al completamento. Purificazione non riuscita potrebbe verificarsi se l'acqua di dialisi non è cambiata con la frequenza prescritta. L'aggregazione e la precipitazione delle particelle può verificarsi anche se le particelle sono lasciate in dialisi per più di 72 ore. Altri potenziali problemi potrebbero essere osservati durante la liofilizzazione. Se il PEG ultrasmall rivestito AuNP soluzione non era completamente ghiacciato o se i liofilizzatori non è stato impostato correttamente, i campioni possono essere persi. Consultare il manuale di liofilizzatori, come alcune attrezzature possono richiedere la preparazione del campione diverso.

La facilità di sintesi e la biocompatibilità delle particelle risultanti rappresentano vantaggi per l'utilizzo di questi PEG-AuNPs. Inoltre, queste nanoparticelle hanno il vantaggio di essere in grado di interagire con strutture cellulari su scala nanometrica, come dimostra la capacità di identificare il glicocalice degradate dall'assorbimento di queste nanoparticelle. Questo vantaggio può essere sfruttato per lo sviluppo di nuove terapie di aterosclerosi e misure preventive. Di là di quello che vi presentiamo qui, un altro vantaggio di questo protocollo è che esso consente una vasta personalizzazione delle particelle come pure ha aumentato la stabilità e capacità di archiviazione collegando tiolo contenenti PEG su nanoparticelle d'oro⁴. L'altra estremità della catena PEG può contenere qualsiasi gruppo funzionale, e una miriade di molecole possa essere coniugata a tali gruppi. In questo protocollo, sono collegati tutti e tre i comuni gruppi funzionali (metil, carbossilico e aminoacidi). Il rapporto del PEG è scelto per definire la priorità prima rilevazione fluorescente, quindi la capacità di incorporare una frazione di targeting secondario utilizzando il gruppo dell'acido carbossilico. I rapporti di questi gruppi possono essere ottimizzati sulla base dell'applicazione, e le lunghezze e le forme dei polimeri possono essere registrati anche.

Per misurare l'assorbimento delle particelle, abbiamo coniugato una sonda fluorescente a uno dei gruppi funzionali. Si noti che qualsiasi coniugazione di là di quello che abbiamo descritto si tradurrà in un cambiamento di proprietà di superficie della nanoparticella. Ogni iterazione delle nanoparticelle nei confronti di componenti aggiuntivi e le reazioni di coniugazione deve essere testati per le proprietà desiderate.

Questo metodo produce ultrasmall nanoparticelle d'oro destinate a superare le proprietà difensive del glicocalice endoteliale extracellulare, che ostacola l'assorbimento delle nanoparticelle convenzionalmente dimensioni. Tuttavia, le piccole dimensioni si presta a difficoltà nella formazione immagine e droga caricamento aspetto. Queste particelle sono notevolmente inferiori rispetto all'intervallo di dimensione tipica delle nanoparticelle, e di conseguenza la superficie disponibile per gli allegati di terapeutica e targeting moiety è notevolmente diminuita. Questo può portare a difficoltà raccogliendo singoli segnali in imaging Application, anche se i cluster di particelle ancora possono essere facilmente identificati, come mostrato nelle immagini confocale. La ridotta superficie per gli allegati di targeting ligandi e terapeutica può richiedere più particelle da somministrare per raggiungere i requisiti di dosaggio di destinazione. Tuttavia, le particelle più piccole sarà più efficiente nella consegna quando prendendo il glicocalice in considerazione.

Queste particelle ultrasmall romanzo sono in grado di consegna nella difficile raggiungere su scala nanometrica aree all'interno del corpo con il minimo disturbo del microambiente. L'aggiunta del PEG permette maggiore biocompatibilità e offre gruppi funzionali per la pesante personalizzazione delle particelle per diverse applicazioni. Le dimensioni più piccole rispetto alle tipiche nanoparticelle viene fornito con alcune lacune, ma se sviluppato in modo strategico, la particella ultrasmall è un promettente approccio per alloggio dei difficili da penetrare, intricate e fragile glicocalice in vascolare consegna di targeting e di droga.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	795429
Gold (III) Chloride trihydrate (HAuCl4.3H2O)	Sigma Aldrich	520918
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Tetrakis (hydroxymethyl) phosphnium chloride	Sigma Aldrich	404861
Mono-functional mPEG-thiol	Layson Bio Inc.	MPEG-SH-2000-1g	Mw: 2,000 Da
hetero bi-functional anime-PEG-thiol	Layson Bio Inc.	NH2-PEG-SH-3400-1g	Mw: 3,400 Da
Carboxymethyl-PEG-thiol	Layson Bio Inc.	CM-PEG-SH-2000-1g	Mw: 2,000 Da
Cellulose dialysis membrane (12-14 kDa)	Sigma Aldrich	D9777
Zerostat anti-static instrument	Sigma Aldrich	Z108812
Alexa Fluor 647 (AF647) carboxylic acid succinimidyl ester	Fisher	A20006	Fluorophore
Fisherbrand Qualitative Grade Plain Filter Paper Circles - P5 grade	Thermo Fisher Scientific	09-801-B
Transmission electron microscopy	JEOL USA	JEOL JEM-1000	TEM
Dynamic Light Scattering	Brookhaven Instruments Corporation	Brookhaven 90 Plus Particle Size Analyzer	DLS
Fluorometer	Horiba Scientific	Jobin Yvon Fluromax 4	Fluorometer
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G3582	MTS
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax M4	Plate reader
10E4 epitope HS mouse monoclonal IgM antibody (primary antibody)	Amsbio	370255	Primary antibody
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (secondary antibody)	Thermo Fisher Scientific	R37120	Secondary antibody
VECTASHIELD mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1000	With DAPI
Confocal Microscope	Carl Zeiss Meditex AG	Zeiss LSM 700	Confocol microscopy