تصوير الكالسيوم اثنين-فوتون في Dendrites العصبية في الدماغ شرائح

Summary

نحن نقدم طريقة الجمع بين تسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية واثنين-فوتون التصوير لتسجيل Ca^{2 +} العابرين في dendrites العصبية في الدماغ الحادة شرائح.

Abstract

تصوير الكالسيوم (Ca^{2 +}) أداة قوية للتحقيق في ديناميات الزمانية المكانية Ca^{2 +} الإشارات داخل الخلايا في الخلايا العصبية dendrites. يمكن أن يحدث من خلال مجموعة متنوعة من آليات داخل الخلية والغشاء Ca^{2 +} تقلبات وتلعب دوراً حاسما في تحريض اللدونة متشابك والتنظيم لاستثارة الجذعية. ومن ثم فالقدرة على تسجيل أنواع مختلفة من Ca^{2 +} إشارات في فروع الجذعية قيماً لمجموعات دراسة كيفية دمج dendrites المعلومات. ظهور مجهرية اثنين-فوتون جعلت هذه الدراسات أسهل بكثير عن طريق حل المشاكل الملازمة للتصوير في الأنسجة الحية، مثل نثر الخفيفة ود. وعلاوة على ذلك، من خلال مجموعة من التقنيات الكهربية التقليدية مع اثنين-فوتون Ca^{2 +} التصوير، فمن الممكن للتحقيق المحلي Ca^{2 +} التقلبات في الخلايا العصبية dendrites جنبا إلى جنب مع تسجيلات النشاط متشابك في سوما. هنا، نحن تصف كيفية استخدام هذا الأسلوب لدراسة ديناميات محلية Ca^{2 +} العابرين (القطط) في dendrites جابايرجيك إينتيرنيورونس المثبطة. الأسلوب يمكن تطبيقها أيضا على دراسة الجذعية Ca^{2 +} إشارات في مختلف أنواع الخلايا العصبية في الدماغ الحادة شرائح.

Introduction

المساهمة من خلية إلى نشاط الشبكة يتحدد إلى حد كبير بالطابع الدينامي للمدخلات متشابك التي يتلقاها. تقليديا، يعتمد الأسلوب السائد لوصف النشاط متشابك في الخلايا العصبية على تسجيلات المشبك التصحيح كل خلية جسدية من تيارات بوستسينابتيك أثارت قبل التحفيز الكهربائي لمحاور عصبية مرور. ومع ذلك، يقال صدق النشاط الوحيد لنهايات بروكسيمالي يقع في هذه الحالة¹. وبالإضافة إلى ذلك، قد استخدمت لتقييم الآليات الخاصة بالمشبك، تسجيلات من أزواج من الخلايا العصبية ومن dendrites في موقع معين لاستهداف نقاط الاشتباك العصبي للفائدة وآليات التكامل الجذعية، على التوالي. وقد تحقق إنجازا كبيرا في مجال الفسيولوجيا متشابك عن طريق أج تقنيات الضوئية والكهربية. اثنين-فوتون الإثارة الليزر الفحص المجهري (2PLSM) في تركيبة مع Ca^{2 +} تصوير وأدوات أوبتوجينيتيك يمكن أن تكشف عن تفاصيل هائلة لمنظمة دينامية النشاط متشابك في الاتصالات العصبية محددة في الدماغ شرائح في المختبر و في فيفو.

العديد من المزايا الرئيسية التي 2PLSM تبرز من الفحص المجهري الإثارة التقليدية، واحد-فوتون²: (1) نظراً لطابع غير خطية للإثارة اثنين-فوتون، يتم إنشاؤها الأسفار فقط في حجم الاتصال، وتمثل جميع الفوتونات المنبعثة إشارات مفيدة (لا حاجة للثقب)؛ (2) أطول الأطوال الموجية، المستخدمة في 2PLSM، اختراق الأنسجة ونثر أكثر كفاءة؛ وبالإضافة إلى ذلك، الفوتونات متناثرة مخفف جداً لإنتاج اثنين-فوتون الإثارة والأسفار الخلفية؛ (3) د ولالضيائيه محدودة أيضا إلى المستوى البؤري. ولذلك، يظل 2PLSM على الرغم من ارتفاع تكاليف نظم 2-فوتون بالمقارنة مع التقليدية [كنفوكل] المجاهر، أسلوب الاختيار للتحقيق ذات الدقة العالية لهيكل الخلايا العصبية ووظيفتها في الأنسجة الحية سميكة.

وكان أول تطبيق ل 2PLSM في الأنسجة ونثر صورة هيكل ووظيفة العمود الفقري الجذعية³. وكشفت 2PLSM في تركيبة مع Ca^{2 +} تصوير تلك الوظيفة الأشواك كالمقصورات البيوكيميائية معزولة. إذ يوجد في العديد من أنواع الخلايا العصبية وجود تناظر رأس برأس بين العمود الفقري ونهايات فردية⁴، اثنين-فوتون Ca^{2 +} التصوير قريبا أصبح أداة مفيدة الإبلاغ عن نشاط نهايات الفردية في أنسجة سليمة^{5، 6،،}من⁷⁸. وعلاوة على ذلك، على أساس 2PLSM Ca^{2 +} التصوير استخدمت بنجاح لرصد نشاط قنوات الكالسيوم واحد والتفاعلات غير الخطية بين كوندوكتانسيس الذاتية ومتشابك، فضلا عن تقييم الدولة والنشاط-تعتمد على تنظيم Ca^{2 +} إشارات في dendrites العصبية^5،،من^67،،من^89،10،11.

الكالسيوم رسول ثانية داخل الخلايا في كل مكان، وفي تنظيم الزمانية المكانية سوبسيلولار يحدد اتجاه ردود الفعل الفسيولوجية، من التغيرات في قوام متشابك لتنظيم أيون القنوات، النمو تغصن والعمود الفقري، كما كذلك موت الخلية والبقاء على قيد الحياة. Ca^{2 +} المرتفعات الجذعية تحدث عن طريق تفعيل مسارات متعددة. فتح قنوات الكالسيوم الجهد عن طريق بوابة¹² إمكانات العمل (الجزائرية)، باكبروباجاتينج إلى dendrites، وإنتاج العالمية نسبيا Ca^{2 +} العابرين (القطط) في dendrites والاشواك¹³. ويرتبط انتقال متشابك مع التنشيط من كاليفورنيا بوستسينابتيك^{2 +}-مستقبلات نفاذية (نمدا، Ca^{2 +}-نفاذية امبا وكينيت)، أحداث متشابك القطط^6،،من¹⁴¹⁵. وأخيراً، يمكن أن تتولد سوبرالينير Ca^{2 +} الأحداث في dendrites تحت بعض الظروف^11،12،،من¹³¹⁶.

اثنين-فوتون Ca^{2 +} تصوير في تركيبة مع التصحيح-المشبك التسجيلات الكهربية توظف Ca الاصطناعية^{2 +}-مؤشرات الفلورسنت الحساسة، التي تقدم عادة من خلال مسرى التصحيح أثناء تسجيلات كامل الخلية . ويستند أسلوب قياسي للتحديد الكمي لديناميات Ca^{2 + 17،}الأسلوب المزدوج المؤشر¹⁸. يستخدم fluorophores اثنين مع المنفصلين عن ذويهم أيضا انبعاثات الأطياف (مثلاً، وهو مزيج من كاليفورنيا الأحمر^{2 +}-صبغة غير حساسة مع الأخضر Ca^{2 +} المؤشرات، مثل ولاية أوريغون الأخضر باتا-1 أو 4 قطع) ومزايا عديدة مقارنة الأسلوب مؤشر واحد. أولاً، Ca^{2 +}-يستخدم صبغة غير حساسة لتحديد هياكل صغيرة للفائدة (فروع الجذعية والاشواك) حيث سيتم تنفيذ Ca^{2 +} تصوير. ثانيا، يتم حساب النسبة بين التغير في الأسفار الأخضر والأحمر (ΔG/R) كتدبير من [Ca^{2 +}]، التي إلى حد كبير حساس للتغيرات في الأسفار الأساس نتيجة لتقلبات في [Ca^{2 +}[₀^{17 , 18}-وعلاوة على ذلك، يمكن معايرة fluorescence التغييرات من حيث المطلق Ca^{2 +} تركيزات¹⁹.

قلق عام عند تشغيل اثنين-فوتون Ca^{2 +} تصوير التجارب في شرائح الحاد هو صحة الخلية والاستقرار لاقتناء الصورة بسبب الليزر عالية الطاقة المستخدمة عادة. بالإضافة إلى ذلك، في Ca^{2 +} تجارب التصوير، هناك قلق حول اضطراب والمبالغة في تقدير كبير من Ca^{2 +} ديناميات سوبسيلولار يرجع ذلك إلى حقيقة أن Ca^{2 +} المؤشرات بمثابة الكثيري خارجية Ca^{2 +} المخازن المؤقتة. وبالتالي، يعتمد اختيار Ca^{2 +} المؤشر وتركيزه على نوع الخلايا العصبية، السعة المتوقعة للقطط، وفيما يتعلق بمسألة تجريبية.

علينا تكييف طريقة اثنين-فوتون Ca^{2 +} تصوير للتحقيق من Ca^{2 +} التقلبات في dendrites جابايرجيك إينتيرنيورونس^9،،من^1011،،من^{2021 , 22}-في حين أن الجزء الأكبر من أوائل Ca^{2 +} التصوير دراسات أجريت في الخلايا العصبية الرئيسية، إينتيرنيورونس المثبطة عرض مجموعة كبيرة ومتنوعة من Ca^{2 +} الآليات الوظيفية التي تختلف عن تلك الموجودة في الخلايا الهرمية^{20 , 23 , 24}-هذه الآليات إينتيرنيورون على حدة (مثلاً، Ca^{2 +} نفاذية امبا مستقبلات) قد تؤدي أدواراً محددة في تنظيم نشاط الخلية. بينما الجذعية Ca^{2 +} إشارات في إينتيرنيورونس هدفا مغريا لإجراء مزيد من التحقيقات، اثنين-فوتون Ca^{2 +} التصوير في dendrites من هذه الخلايا يطرح تحديات إضافية، من أرق قطره dendrites وعدم وجود الأشواك إلى مرتفعة بوجه خاص Ca^{2 +} ربط قدرات ذاتية. كمصالح لدينا أبحاث تركز على دراسة إينتيرنيورونس هيبوكامبال، البروتوكول التالية، في حين تنطبق على مختلف قطاعات السكان العصبية، تم تكييفها للتعامل مع تلك التحديات.

تم تنفيذ هذا البروتوكول مع مجهر اثنين-فوتون [كنفوكل] تجارية، مزودة بكاشفات الخارجية، غير ديسكانيد اثنين (المواظبة) والكهربائية-البصرية المغير (الانتخابات)، ودوت المسح تباين التدرج (SGC)، ومثبتة على طاولة بصرية. المجهر اقترن بليزر مولتيفوتون Ti:Sapphire وضع تأمين 800 نانومتر (> 3 ث، خ نبضات 140، معدل الرسوب 80 هرتز). تم تجهيز نظام التصوير مع تلاعب الكهربية قياسية، بما في ذلك دائرة التروية مع التحكم في درجة الحرارة، منصة ترجمة مع ميكرومانيبولاتورس اثنين، مكبر للصوت ميكروليكترودي الكمبيوتر التي تسيطر عليها، وجهاز الالتقاط رقمي، وحفز وحدة، واقتناء البيانات والبرمجيات.

Protocol

جميع التجارب التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة حماية الحيوان من جامعة لافال، والمجلس الكندي للعناية بالحيوان الرفق بالحيوان.

1-أولى إعداد (اختياري: إعداد يوم 1 مقدما)

1. إعداد ثلاثة أنواع من السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام) الحل (كل من عادي، السكروز وحلول الاسترداد، 1 L؛ انظر الجدول 1). ضبط أوسمولاليتي الحلول ل موسم ± 10 300²⁵ وبارد قام-السكروز وصولاً إلى نقطة بالقرب من تجميد (0-4 درجة مئوية).
   ملاحظة: استخدام حل قطع منخفضة الصوديوم (قام-السكروز) يساعد في الحفاظ على بقاء الخلايا العصبية في الطبقات السطحية لشرائح الحادة²⁶.
2. إعداد 0.75 مل من التصحيح-الحل الذي يحتوي على فلوروفوري أحمر (مثلأليكسا-594) ومؤشر أخضر كالسيوم اصطناعية (مثلاً، ولاية أوريغون الأخضر باتا-1؛ انظر الجدول 1). وتشمل بيوسيتين (انظر الجدول 1) في التصحيح-الحل إذا كان مطلوب وظيفة المخصصة تحديد الخلايا مسجل المورفولوجية.
3. ضبط osmolality الحل إلى 280 ± 5 موسم ودرجة الحموضة إلى 7.35 ± 0.5. يبقى الحل في الثلاجة أو على الجليد في جميع الأوقات.
   ملاحظة: اختيار مؤشر الكالسيوم ينبغي أن تستند إلى نطاق ديناميكي وطبيعة التحقيق Ca^{2 +} الأحداث.
4. باستخدام ساحبة ميكروبيبيتي، إعداد الماصات التصحيح من زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية (انظر الجدول للمواد) مع تلميح 2 ميكرومتر ≈ (مقاومة ماصة MΩ 3-5) والتحفيز الماصات من البورسليكات الزجاج ثيتا الشعيرات الدموية (انظر الجدول من المواد) مع تلميح 2-5 ميكرومتر.
   ملاحظة: سيتم تحديد إعدادات ساحبة جعل الممصات قطر معين والشكل حسب نوع خيوط ساحبة ونتائج اختبار الانحدار لنوع معين من الزجاج.

2. إعداد الشريحة هيبوكامبال

1. تخدير الماوس (P13-20؛ والسلالة والجنس من الماوس تتحدد بمسألة تجريبية تعالج) مع 1 مل إيسوفلوراني توضع على منشفة ورقية داخل دائرة الخدر لاستنشاق. عند عمق تخديره الحيوان، كما يدل على ذلك انعدام الحركة والتنفس البطيء، إزالته من غرفة التخدير وقطع رأس باستخدام مقصلة.
2. كشف الجمجمة بقطع الجلد مع زوج صغيرة من مقص من الجزء الخلفي الجمجمة إلى الآنف. استخدام زوج صغيرة من العظم ميني رونجيورس جعل ثقب على مستوى بريجما. ثم استخدام المقص لجعل قطع والذيلية إلى روسترال على طول خياطة السهمي. مع رونجيورس فهم الجزء الخلفي من كل رفرف الجمجمة ورفع إلى أعلى وإلى الخارج لإزالة الجمجمة تغطي كل نصف الكرة الأرضية.
3. بعد تماما يتعرض الدماغ، تتقلص الأعصاب البصرية مع ملعقة صغيرة. إزالة الدماغ من الجمجمة، ووضعه في طبق بتري تحتوي على استمرار السكروز قام اﻷوكسيجين، الباردة (انظر الجدول 1 لتركيز السكروز).
   1. إذا كان مطلوباً الأنسجة من الفئران الأكبر سنا، أداء نضح إينتراكاردياك استخدام المحاقن (25 غ) مليئة 20 مل سكروز قام المثلج قبل استخراج الدماغ للحصول على شرائح ذات نوعية جيدة.
4. إعداد شرائح هيبوكامبال من الدماغ الحيواني المستخرج.
   1. واسمحوا البرد الدماغ لحوالي 2 دقيقة ضع قطعة من ورق الترشيح على طبق بيتري "معبأة الجليد"، نقل المخ على الورق عامل التصفية. تشريح نصفي.
   2. الصق في نصفي الكرة الأرضية تشريح (الاتجاه يحدده الهدف التجريبية للحصول على شرائح مستعرضة، أو الأفقي coronal،) على جدول فيبرتوم وتزج أنه في علبة فيبرتوم مليئة قام اﻷوكسيجين المثلج-السكروز. جعل 300 ميكرون الشرائح سميكة عند درجة حرارة حوالي 1 درجة مئوية باستخدام فيبرتوم برودة أو بوضع الثلج حول علبة فيبرتوم.
   3. باستخدام فرشاة طلاء مسطحة، تتراكم الشرائح المحتوية على الحصين (تصل إلى 6 شرائح كل نصف الكرة الأرضية) في حمام يحتوي على استرداد قام اﻷوكسيجين تسخينها إلى 37 درجة مئوية.
   4. تترك الشرائح في الحمام قام-الإنعاش لمدة 45 دقيقة على الأقل.

3. تسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية

1. تعيين شريحة هيبوكامبال في مكان في حمام المتمركزة في إطار الهدف (التكبير: 40 ×، الفتحة العددية: 0.8) مجهر مسح ليزر اثنين-فوتون. نتخلل الحمام باستمرار مع اﻷوكسيجين العادي قام ساخنة في 30-32 درجة مئوية بمعدل 2.5-3 مل/دقيقة.
2. استخدم التباين التدخل التفاضلية الأشعة تحت الحمراء (IR-DIC) أو مجهرية SGC دودت إلى موقع خلية للاهتمام باستخدام حجم، وشكله، وموقف.
   ملاحظة: اعتماداً على السكان المستهدفين العصبية، ويمكن استخدام نموذج الفأر وراثيا بسهولة تحديد موقع الخلايا التي تهم. وفي هذه الحالة، يمكن أن يكون محل هذه الخطوة باستخدام مصدر ضوء الفلورسنت.
3. ملء ماصة تحفيز مع حلاً قام عادي الذي يحتوي على فلوروفوري أحمر (مثلأليكسا-594).
4. تعيين ماصة التحفيز (متصلة بوحدة تحفيز كهربائي) على رأس الشريحة حيث يكون الطرف في المنطقة ذاتها كالخلية للفائدة.
5. بعد ملء الماصة التصحيح مع تصحيح الحل وإرفاقها إلى مرحلة رأس، وضعه على الشريحة حيث يكون طرفها مباشرة فوق الخلية للفائدة.
6. تناسب حقنه محبس الحنفية الثلاثية وتوصيله إلى التصحيح-الماصة من خلال أنبوب بلاستيكي. الضغط الإيجابي المستمر بحقن ماصة التصحيح (≈ مل 0.1) استخدام المحاقن. الاحتفاظ محبس الحنفية في موقف "إغلاق".
7. تنشيط وحدة برمجيات التحكم مكبر للصوت، وقم بالتبديل إلى وضع المشبك الجهد عن طريق النقر فوق الزر "الرأسمالي". فتح برنامج اقتناء البيانات الكهربية (مثلاً، كلامبيكس) للحصول على الإشارات الكهربية وانقر على أيقونة "اختبار الغشاء" لأنها باستمرار إرسال نبضة جهد مربعة (5 mV، 10 مللي ثانية)، التي ضرورية لمراقبة التغيرات في المقاومة ماصة.
8. أقل ماصة التصحيح حتى والحق في أعلى الخلية المستهدفة. عند إجراء الاتصال مع غشاء الخلية، إزالة الضغط عن طريق تحويل في محبس الحنفية إلى موقف "فتح".
   ملاحظة: الاتصال مع غشاء الخلية يتم الكشف عن عند زيادة صغيرة في المقاومة ماصة (≈ 0.2 MΩ) وينظر ويسببه الضغط الإيجابي المسافة بادئة صغيرة في الخلية.
9. تطبيق ضغط سلبي طفيف على ماصة التصحيح باستخدام حقنه فارغة تركيبها في محبس الحنفية حتى تصل مقاومة ماصة المقدمة من البرنامج إلى 1 GΩ. في إطار '"اختبار الغشاء"' برنامج اقتناء البيانات، المشبك الخلية عند-60 أم.
10. مواصلة تطبيق الضغط السلبي حتى يتم فتح الخلية ويتحقق تكوين كامل الخلية. الكشف عن هذه الخلية الدولة يستند إلى التغير المفاجئ في المقاومة ماصة (من 1 GΩ إلى MΩ 70-500 تبعاً لنوع إينتيرنيورون) وظهور العابرين بالسعة الكبيرة في نافذة '"اختبار الغشاء"'.

4-اثنين-فوتون Ca^{2 +} تصوير

1. إذا كانت مهتمة في الردود بوستسينابتيك ضادات، إضافة جابازيني مانع مستقبلات GABA_A (10 ميكرون) ومانع مستقبلات GABA_ب CGP55845 (2 ميكرومتر) في الحمام قام.
2. في مكبر للصوت برامج وحدة التحكم، تعيين تكوين التصحيح الحالية-المشبك بالنقر فوق الزر "نسخة" وتسجيل نمط الخلية إطلاق النار ردا على حقن جسدية من ديبولاريزينج الحالي (0.8-1.0 غ، 1 s). انتظر 30 دقيقة على الأقل للخلية تكون مليئة بالمؤشرات الحالية في حل التصحيح.
   ملاحظة: الخلية نمط إطلاق النار وخصائص نشطة يمكن استخدامها لتحديد النوع الفرعي للخلية؛ مثلخلايا النتوءات سريعة. من المهم تركيز المؤشر لتحقيق الاستقرار من خلال نشر قبل البدء في تسجيل القطط (انظر الجدول 2 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها).
3. أ فب-أثارت القطط
   1. ابدأ باستخدام صورة اقتناء برامج الحصول على الصور. قم بتحديد موقع تغصن الاهتمام باستخدام إشارة حمراء الأسفار. لضمان استجابة مرئية، اختر أولاً، تغصن الدانية (≤ 50 ميكرومتر) كفاءة AP backpropagation قد تراجع إلى حد كبير مع المسافة في جابايرجيك إينتيرنيورونس²².
   2. باستخدام 'أداة مستطيلة' في صورة اقتناء البرمجيات، التكبير والتصغير في المنطقة المستهدفة، وقم بالتبديل إلى "xt" وضع (linescan). وضع المسح الضوئي عبر فرع الجذعية للفائدة. مع وحدة تحكم كثافة الليزر في اقتناء البرمجيات، تعيين الليزر اثنين-فوتون على مستوى الحد أدنى من سلطة حيث fluorescence الأساس الأخضر مرئياً قليلاً فقط، لتجنب الضيائية.
   3. في برنامج اقتناء الكهربية البيانات 'بروتوكول' الإطار والصورة اقتناء البرمجيات، إنشاء محاكمة تسجيل المدة المطلوبة تتضمن حقنه الحالية جسدية من السعة المطلوبة.
      1. استخدام برنامج اقتناء الصور، انقر فوق الزر "بدء تشغيل السجل" والحصول على الأسفار بشكل مستمر لتكرار س. 1-2 الحصول على الصورة 3-10 مرات. الانتظار على الأقل 30 ثانية بين مسح واحد لتجنب د. إذا كان الحصول على لينيسكانس في نقاط متعددة على طول تغصن، أخذها في ترتيب عشوائي لتجنب آثار النظام.
4. أثارت سينابتيكالي القطط
   1. قم بتحديد موقع تغصن الاهتمام باستخدام إشارة حمراء الأسفار.
   2. تعيين ماصة التحفيز على سطح الشريحة أعلاه تغصن من الفائدة. انخفاض ببطء ماصة التحفيز في مكانها، التقليل من الحركة لتجنب الإخلال بتكوين كامل الخلية. موقف الماصة في 10-15 ميكرون من تغصن.
   3. تصور موقع ميكرودومينس متشابك في أسبيني dendrites، في صورة اقتناء برامج التحول إلى 'xt' وضع (linescan) وضع خط طول الفرع الجذعية للفائدة.
   4. في نافذة 'بروتوكول' (من برنامج اقتناء البيانات الكهربية) وبرنامج اقتناء الصور، قم بإنشاء محاكمة تسجيل الذي يقوم بتشغيل وحدة التحفيز بعد بدء المحاكمة.
   5. باستخدام البرمجيات، واقتناء انقر فوق الزر "بدء تشغيل السجل" للمسح الضوئي على طول تغصن باستمرار لاكتساب تكرار س. 1-2 3-5 مرات، الانتظار 30 ثانية بين مسح لمنع د.
      ملاحظة: يمكن تعديلها تبعاً لحركية الحدث مقولة طول المسح الضوئي، ولكن ينبغي التقليل من منع د (انظر الجدول 2 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها).
   6. كرر الخطوة 4.5.5 في ظروف مختلفة (مثلاً، كثافة/طول مختلفة من التحفيز، وإدخال مانع الدوائية، و ما إلى ذلك) اعتماداً على مسألة محددة يجري تناولها.
   7. التوقف عن شراء عند الخلية يظهر علامات على تدهور الصحة: depolarization أدناه-45 mV، الزيادة في الأساس Ca^{2 +} مستوى، تدهور المورفولوجية dendrites (مثلاً، بلبينغ، تجزئة؛ انظر الجدول 2 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها).
   8. للحصول على معلومات أولية عن مورفولوجيا للخلية والاحتفاظ بسجل لموقع ماصة التحفيز واكتساب Z-كومة من الخلية في القناة الحمراء. استخدام برنامج اقتناء في 'xyz' الوضع، تعيين حدود المكدس العلوية والسفلية الصورة الخلية بأكملها مع كافة العمليات المدرجة. تعيين 'حجم الخطوة' في 1 ميكرومتر، والشروع في اقتناء المكدس باستخدام الزر "بدء تشغيل السجل".
   9. عندما Z-اقتناء مكدس كامل، استخدم الخيار "الإسقاط كحد أقصى" في البرنامج إلى ركب جميع خطط التنسيق من المكدس والتحقق من نوعية حيازة. ثم تتراجع ببطء ماصة التصحيح خارج الشريحة.
   10. لإصلاح الشريحة لتحديد الخصائص المورفولوجية وظيفة المخصص ، بسرعة إزالة الشريحة من حمام استخدام فرشاة طلاء مسطحة، ووضعه بين ورقتي التصفية، في طبق بتري مملوءة قام. استبدال قام بحل بارافورمالدهيد (PFA) 4% وترك الطبق في غرفة 4 درجات مئوية أو الثلاجة بين عشية وضحاها.

5-إيمونوهيستوتشيميستري لتحديد الخلايا مسجل المورفولوجية الوظيفة المخصصة

ملاحظة: بعد ليلة 1 للتثبيت في منهاج عمل بيجين، الشريحة يمكن تخزينها في المخزن المؤقت للفوسفات (PB) مع أزيد الصوديوم (0.5%) لمدة تصل إلى شهر واحد.

1. وضع الشريحة في تريس مخزنة المحلول الملحي (تبس) مع Triton X-100 (0.3 في المائة)، وأداء يغسل 4 (5-10 دقيقة كل).
2. وضع الشريحة في تبس-تريتون 0.3% مع 10% مصل الماعز العادي (خ ع) ح 1.
3. وضع الشريحة في تبس-تريتون 0.3% مع 1% خ ع و fluorophore Streptavidin مترافق (مثلاً، Streptavidin مترافق أليكسا فلور 546، 1: 200) لليلة وضحاها الحضانة.
4. أغسل 4 مرات (5-10 دقيقة) في tbs.
5. تحميل الشرائح على شرائح المجهر والصورة باستخدام مجهر [كنفوكل]. لإعادة إنشاء خلية كاملة، اكتساب Z-المكدس (الخطوة الحجم: 1 ميكرومتر) استخدام هدفا 20 x. بالنسبة للتصوير على تسمية أليكسا-546-مترافق، تعيين استخدام ليزر نانومتر 543 والكشف عن 515-560 نانومتر تصفية.

6-تحليل القطط

1. استخراج القيم الأسفار من مناطق الاهتمام (رويس) في الصور linescan من قنوات الأحمر والأخضر ومتوسط قيم يكرر متعددة لكل شرط للحد من الضوضاء.
   ملاحظة: عند اقتناء linescan على طول تغصن, من الممكن استخراج بيانات من رويس المتعددة، التي قد تتوافق مع ميكرودومينس الجذعية (2-5 ميكرومتر)، ومما يسمح دراسة لتجزئة Ca^{2 +} إشارة.
2. لكل عائد الاستثمار، التعبير عن التغيرات التي حدثت في Ca^{2 +} السعة ك:
   
   ملاحظة: هنا ز قيمة الأسفار من قناة الأخضر؛ ز₀ هو قيمة الأسفار الأساس من قناة الأخضر خلال فترة ما قبل التحفيز؛ R هي قيمة الأسفار من القناة الحمراء¹⁸. اثنين-فوتون الإثارة العالية مترجمة ولا يؤدي إلى إنشاء خلفية كبيرة، طرح الأسفار الخلفية غير مطلوب.

النتائج

باستخدام بروتوكول المعروضة هنا، حصلنا على القطط أثارت طريق الحقن الحالية جسدية والتحفيز الكهربائي في dendrites oriens/ألفيس إينتيرنيورونس في منطقة CA1 الحصين. بعد الترقيع خلية، حدد استناداً إلى الشكل والموقف، اكتسبنا لينيسكانس عبر تغصن الدانية في نقاط متعددة في ضوء المسافات من...

Discussion

الأسلوب هو موضح أدناه يوضح كيف يمكن استخدام المزيج من اثنين-فوتون Ca^{2 +} تصوير والتصحيح-المشبك الكهربية لدراسة الجذعية Ca^{2 +} إشارات في dendrites العصبية في الدماغ الحادة شرائح. يسمح هذا الأسلوب للرصد لكلا المحلية Ca^{2 +} المرتفعات أثارت قبل AP التحفيز أو باكبروباجاتينج الكهربائية في ق...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal Strain: Mouse CD1	Charles River	022
Isoflurane	AbbVie Corporation	0B506-099
CGP 55845 hydrochloride	Abcam	ab120337
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C4901
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Paraformaldehyde powder, 95%	Sigma-Aldrich	158127
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Potassium gluconate	Sigma-Aldrich	P1847
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich	T3253
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma-Aldrich	71643
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261
Alexa Fluor 594 Hydrazide	ThermoFisher Scientific	A10438
SR95531 (Gabazine)	Abcam	ab120042
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris	Sigma-Aldrich	A9062
Guanosine (GTP)-Na+	Sigma-Aldrich	G8877
Oregon Green BAPTA-1	ThermoFisher Scientific	O6812
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma-Aldrich	P1937
Streptavidin-conjugated Alexa-546	ThermoFisher Scientific	S11225
Patch Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Theta Borosilicate Glass Capillaries	Sutter Instrument	BT-150-10
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instrument
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope	Leica Microsystems
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser	Coherent
LAS AF Imaging Acquisition Software	Leica Microsystems
Temperature Controller TC-324B	Warner Instruments
MultiClamp 700B Amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A Digitizer	Molecular Devices
Confocal Translator	Siskiyou
Micromanipulator	Siskiyou
pClamp Data Acquisition Software	Molecular Devices
A365 Constant Current Stimulus Isolator	World Precision Instruments
Vibraplane Optical Table	Kinetic Systems