Двух Фотон кальция изображений в нейрональных дендритов в срезах головного мозга

Резюме

Мы представляем метод, объединяющий поклеточного фиксации записи и два Фотон изображений для записи Ca^{2 +} переходные процессы в нейрональных дендритов в острой мозга ломтиками.

Аннотация

Кальций (Ca^{2 +}) изображений является мощным инструментом для изучения пространственно-временных динамика внутриклеточных Ca^{2 +} сигналов в нейрональных дендритов. CA^{2 +} колебания могут возникать через различные мембраны и внутриклеточных механизмов и играть решающую роль в индукции синаптической пластичности и регулирование дендритных возбудимости. Следовательно возможность записи различных типов Ca^{2 +} сигналов в дендритных филиалов является ценным для групп, изучая, как дендриты интегрировать информацию. Появление двух Фотон микроскопии сделал такие исследования значительно проще, решая проблемы, присущие изображений в живой ткани, такие как рассеяние света и фотоповреждения. Кроме того через сочетание обычных электрофизиологических методов с двух Фотон Ca^{2 +} изображений, можно исследовать местные Ca^{2 +} колебания в нейрональных дендритов параллельно с записями синаптической активности в Сома. Здесь мы опишем, как использовать этот метод для изучения динамики местных Ca^{2 +} транзиентов (кошки) в дендриты ингибирующее интернейронов ГАМК. Этот метод может применяться также к изучению дендритных Ca^{2 +} сигнализации в различных типов нейронов в острой мозга ломтиками.

Введение

Вклад нейрона для сетевой активности во многом определяется динамичный характер синаптических входов, которые он получает. Традиционно преобладает метод характеризации синаптической активности нейронов полагались на записи соматических поклеточного патч зажим постсинаптических токов, вызываемые электрической стимуляции аксонов прохода. Однако только активность проксимально расположен синапсы правдиво сообщили в этом случае¹. Кроме того для оценки СИНАПС конкретные механизмы, записи из пар нейронов и дендритов в определенном месте использовались для целевой синапсы интерес и механизмы дендритных интеграции, соответственно. Крупным прорывом в области физиологии синаптических была достигнута через брак оптических и электрофизиологических методов. Двух Фотон возбуждения лазерной сканирующей микроскопии (2PLSM) в сочетании с Ca^{2 +} изображений и optogenetic инструменты можно выявить огромный детали динамической организации синаптической активности на конкретных нейрональных связей в ломтики мозга в in vitro и в естественных условиях.

Несколько ключевых преимуществ сделал 2PLSM выделяется из обычных, один фотон возбуждения микроскопии²: (1) вследствие нелинейного характера возбуждения двух фотонов, флюоресценция генерируется только в том фокуса, а представляют всех излучаемых фотонов полезных сигналов (нет необходимости для обскуры); (2) больше волн, используемых в 2PLSM, проникать в ткани рассеяния более эффективно; Кроме того рассеянных фотонов слишком разреженных производить два Фотон возбуждения и фон флуоресценции; (3) фотоповреждения и Фототоксичность также ограничены в фокальной плоскости. Таким образом несмотря на высокую стоимость 2-фотонных систем по сравнению с обычными конфокальные микроскопы, 2PLSM по-прежнему является методом выбора для высокого разрешения исследования нейронов структуры и функции в густой живой ткани.

Первое применение 2PLSM в тканях рассеяния было изображение структуры и функции дендритных шипиков³. 2PLSM в сочетании с Ca^{2 +} изображений показал что колючки функции как биохимические изолированных отсеков. Поскольку во многих типов нейронов существует однозначное соответствие между шипами и отдельных синапсы⁴, два Фотон Ca^{2 +} изображений вскоре стал полезным инструментом отчетности деятельности отдельных синапсов в неповрежденной ткани^{5, 6,,78}. Кроме того на основе 2PLSM Ca^{2 +} изображений был успешно используется для мониторинга активности одного кальциевых каналов и нелинейных взаимодействий между внутренней и синаптическую проводимости, а также для оценки состояния и активности зависит от регулирование Ca^{2 +} сигнализации в нейрональных дендритов^{5,6,,78,9,10,11}.

Кальций является вездесущий внутриклеточных второй messenger, и его субцеллюлярные пространственно-временных организация определяет направление физиологических реакций, от изменений в синаптической силы к регулированию Ион каналы, роста дендритов и позвоночника, как а также гибель клеток и выживания. Дендритных Ca^{2 +} фасады происходят через активацию нескольких путей. Потенциалы действия (APs), backpropagating к дендритов, открыть напряжения закрытый кальций каналы¹² и производят относительно глобальной Ca^{2 +} транзиентов (кошки) в дендритов и колючки¹³. Синаптической передачи связан с активацией постсинаптических Ca^{2 +}-проницаемой рецепторов (NMDA, Ca^{2 +}-проницаемой АМПА и kainate), вызывает синаптических кошки^6,14,15. Наконец supralinear Ca^{2 +} события могут быть созданы в дендриты при определенных условиях^11,12,13,16.

Двух Фотон Ca^{2 +} изображений в сочетании с патч зажим электрофизиологических записей использует синтетический Ca^{2 +}-чувствительных люминесцентные Индикаторы, которые доставляются через электрод патч во время записи поклеточного . Стандартный метод для количественной оценки Ca^{2 +} динамики на основе двойной индикатор метод^17,18. Он использует два флуорофоров с хорошо разделенных спектры выбросов (например, сочетание красного Ca^{2 +}-нечувствительным краска с зеленым Ca^{2 +} индикаторы, такие как Орегон Грин BAPTA-1 или Fluo-4) и имеет ряд преимуществ по сравнению с единый индикатор метод. Во-первых, Ca^{2 +}-нечувствительным краска используется для обнаружения небольших структур интерес (дендритных филиалов и колючки) где будет выполняться Ca^{2 +} изображений. Во-вторых отношение между изменением в зеленой и красной флуоресценцией (ΔG/R) вычисляется как мера [Ca^{2 +}], который является в значительной степени нечувствительны к изменения в базовых флуоресценции колебаниями в [Ca^{2 +}]₀^{17 , 18}. Кроме того, изменения флюоресценции может быть откалиброван с точки зрения абсолютной Ca^{2 +} концентрации¹⁹.

Общая озабоченность при выполнении двух Фотон Ca^{2 +} изображений эксперименты в острых фрагментов является здоровье клеток и стабильность захвата изображений из-за высокой лазерной энергии обычно используется. Кроме того в Ca^{2 +} изображений экспериментов, существует озабоченность по поводу возмущений и существенной переоценки субцеллюлярные Ca^{2 +} динамики, с тем, что Ca^{2 +} индикаторы действовать как Высокомобильные внешних Ca^{2 +} буферы. Таким образом выбор Ca^{2 +} индикатор и его концентрация зависит от нейронов типа, ожидаемого амплитуда кошек и экспериментальной вопрос.

Мы адаптировали метод двух Фотон Ca^{2 +} изображений для расследования Ca^{2 +} колебаний в дендриты ГАМК интернейронов^{9,10,11,20,21 , 22}. в то время как основная часть ранних Ca^{2 +} тепловизионные исследования были сделаны в главных нейронов, тормозящий интернейронов продемонстрировать большое разнообразие функциональных Ca^{2 +} механизмов, которые отличаются от тех, кто в пирамидальных клеток^{20 , 23 , 24}. Эти межнейронного конкретные механизмы (например, Ca^{2 +} проницаемых АМПА рецепторов) могут играть конкретную роль в регулировании клеточной активности. Хотя дендритных Ca^{2 +} сигнализации в интернейронов заманчиво мишенью для дальнейшего расследования, два Фотон Ca^{2 +} изображений в дендриты этих клеток представляет дополнительные проблемы, от тонкого диаметра дендритов и отсутствием шипов для особенно высокой эндогенного Ca^{2 +} связывающая способность. Как наши исследовательские интересы сосредоточиться на изучении гиппокампа интернейронов, следующий протокол, в то время, как это применимо к различных нейрональных популяций, была адаптирована для решения этих проблем.

Этот протокол был казнен с коммерческой Конфокальный микроскоп двух фотонов, который был оборудован двумя внешними, не descanned детекторы (NDDs), электро оптический модулятор (МНВ) и Dodt, сканирование градиент контрастности (SGC) и установлен на таблицы оптики. Микроскоп был увязан с титан-сапфировый лазер multiphoton locked режиме на 800 Нм (> 3 Вт, 140 fs импульсов, частота следования импульсов 80 Гц). Система электронного фотографирования была оснащена стандартным электрофизиологии Рог, включая камеру перфузии с контроля температуры, перевод платформы с двумя микроманипуляторы, управляемая компьютером микроэлектродные усилитель, дигитайзера, стимуляции подразделение и программное обеспечение для сбора данных.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими животных животных защиты Комитет Университет Лаваля и Канадского совета по лечению животных.

1. Предварительная подготовка (необязательно: заранее подготовить 1 день)

1. Подготовка трех видов искусственных спинномозговой жидкости (ФАГО) решения (нормальный, сахароза и восстановления решения, 1 Л; см. таблицу 1). Отрегулируйте осмотического давления решения до 300 мОсм ± 10²⁵ и прохладный фаго-сахароза до точки вблизи замерзания (0-4 ° C).
   Примечание: Использование низким содержанием натрия режущего раствора (фаго-сахароза) помогает сохранить жизнеспособность нейронов в поверхностных слоях острых фрагментов²⁶.
2. Подготовить 0,75 мл раствора патч, содержащий красный Флюорофор (например, Alexa-594) и индикатор зеленый синтетический кальция (например, Орегон Грин BAPTA-1; см. таблицу 1). Включить biocytin (см. таблицу 1) в патч решение, если требуется должность Специального морфологической идентификации зарегистрированных клеток.
3. Отрегулируйте осмотического давления решение 280 ± 5 мОсм и pH до 7.35 ± 0,5. Держите раствор в холодильнике или на льду во все времена.
   Примечание: Выбор индикатора кальция должен основываться на динамический диапазон и о природе исследуемого Ca^{2 +} событий.
4. С помощью съемника микропипеткой, подготовьте патч пипетки из боросиликатного стекла капилляров (см. Таблицу материалы) с наконечником 2 мкм ≈ (Пипетка сопротивление MΩ 3-5) и стимуляции пипетки из капилляров тета Стекло боросиликатное (см. таблицы Материалы) с наконечником 2-5 мкм.
   Примечание: Съемник параметров, чтобы сделать пипетки данного диаметра и формы будут определяться съемник накаливания типа и рамп результаты теста для данного типа стекла.

2. гиппокампа ломтик подготовка

1. Анестезировать мыши (P13-20; напряжение и секс мыши определяется экспериментально вопрос) с 1 мл раствора изофлюрановая помещен на бумажное полотенце в камеру ингаляционного наркоза. Когда животное глубоко под наркозом, что подтверждается отсутствием движения и медленное дыхание, удалите его из камеры для наркоза и обезглавить с помощью гильотины.
2. Разоблачить черепа путем разрезания кожи с парой небольших ножницы от задней части черепа на нос. Используйте пару небольших мини-кости rongeurs сделать отверстие на уровне bregma. Затем используйте ножницы сделать хвостового в ростральной разрез вдоль Сагиттальный шов. С rongeurs понять задней части каждого черепа лоскут и Лифт вверх и наружу удалить черепа, охватывающих каждое полушарие.
3. После того, как мозг полностью разоблачил, подрезать зрительных нервов с небольшой лопаткой. Удаление мозга от черепа и положить его в чашку Петри, содержащие непрерывно кислородом, холодная фаго-сахароза (см. таблицу 1 для концентрации сахарозы).
   1. Если требуется ткани от старых мышей, выполняют внутрисердечной перфузии, с помощью шприца (25 Г) заполнены с 20 мл ледяной фаго-сахароза до мозга извлечения для получения хорошего качества ломтиками.
4. Подготовьте гиппокампа фрагменты из извлеченного животных мозга.
   1. Пусть мозга холод для около 2 мин место кусок фильтровальной бумаги на льду Упакованные Петри блюдо, передачи мозг на фильтровальную бумагу. Проанализируем две полусферы.
   2. Клей расчлененных полушарий (ориентация определяется экспериментальная цель получения корональный, поперечные, или Горизонтальные срезы) на vibratome таблицу и погрузите его в лоток vibratome, наполненный ледяной кислородом фаго-сахароза. Сделайте толстыми ломтиками около 1 ° c при температуре 300 мкм с помощью vibratome кулер или размещения льда вокруг vibratome лоток.
   3. С помощью плоской кистью, накапливаются фрагменты, содержащие гиппокампа (до 6 ломтиков в полушарии) в ванну, содержащий кислородом фаго-восстановление подогретой до 37 ° C.
   4. Оставьте ломтики в ванне фаго-восстановления по крайней мере 45 мин.

3. поклеточного фиксации записи

1. Установите ломтиком гиппокампа в место в ванне под цели (увеличение: 40 x, числовая апертура: 0,8) микроскопа два фотона лазерного сканирования. Постоянно perfuse ванны с кислородом фаго-нормальный нагревают на 30-32 ° C со скоростью 2,5-3 мл/мин.
2. Использование инфракрасной дифференциальной помехи контраст (IR-DIC) или Dodt-SGC микроскопии найти ячейку интерес, используя его размер, форму и положение.
   Примечание: В зависимости от населения целевых нейрон, трансгенные мыши модель может использоваться легко найти клетки интереса. В этом случае этот шаг может быть заменен с использованием флуоресцентных источника света.
3. Заполните стимуляции пипетки с фаго-нормальный раствор, содержащий красный Флюорофор (например, Alexa-594).
4. Установите стимуляции пипеткой (подключенных к единице электрической стимуляции) поверх фрагмента так, что кончик пера находится в том же регионе как клетки интереса.
5. После заполнения пипеткой патч патч раствором и присоединения его к главный этап, установите его на срез таким образом, чтобы его кончик непосредственно над ячейкой интерес.
6. Вписывается кран трехходовой шприц и подключить его к патч пипеткой через пластиковую трубку. Привнести постоянным положительным давлением в пипетку патч (≈ 0,1 мл) с помощью шприца. Держите кран в положение «закрыть».
7. Активируйте модуль программного обеспечения управления усилителя и переключитесь в режим напряжения фиксатор, нажав на кнопку «ВК». Откройте электрофизиологии сбора данных (например, clampex) для приобретения электрофизиологических сигналов и нажмите на значок «Мембраны тест» чтобы он постоянно отправлять квадратных напряжение импульса (5 МВ, 10 мс), которая необходима для мониторинга изменения в пипетку сопротивления.
8. Понизить патч пипетку до тех пор, пока это прямо на вершине целевой ячейки. После изготовления свяжитесь с клеточной мембраны, удалить давления, повернув кран в положение «открыто».
   Примечание: Контакт с клеточной мембраны обнаружен, когда небольшое увеличение сопротивления пипетки (≈ 0,2 MΩ) рассматривается и небольшой отступ на cell вызвано положительным давлением.
9. Приложите небольшое отрицательное давление в пипетку патч, используя пустой шприц, вписывается кран до тех пор, пока сопротивление пипетки, предоставляемые программного обеспечения достигнет 1 GΩ. В окне «Мембраны Test» программного обеспечения сбора данных, зажим ячейки на -60 МВ.
10. Продолжать применять отрицательное давление до тех пор, пока ячейка будет открыт и достигается поклеточного конфигурации. Обнаружение этой ячейке государства основана на внезапные изменения в пипетку сопротивления (от 1 GΩ в MΩ 70-500 в зависимости от типа межнейронного) и появление большой емкостный переходные процессы в окне «Мембраны Test».

4. два Фотон Ca^{2 +} изображений

1. Если вы заинтересованы в возбуждающих постсинаптических ответы, добавьте ГАМК-_А рецепторов блокатор gabazine (10 мкм) и блокатора рецепторов ГАМК_B CGP55845 (2 мкм) в бане фаго.
2. В усилитель модуль управления программного обеспечения, настройки патч для тока зажим, нажав на кнопку «CC» и запишите шаблон ячейки стрельбы в ответ на соматические инъекции расшатывания ток (0,8-1,0 nA, 1 s). Подождите, по крайней мере 30 минут для ячейки, чтобы быть заполнены с показателями в патч решения.
   Примечание: Клетки стрельбы шаблон и активные свойства может использоваться для идентификации ячейки подтип; например, быстро пики клетки. Это важно для показателя концентрации стабилизировать посредством диффузии перед началом записи кошек (см. таблицу 2 для устранения неполадок).
3. AP-вызвала кошки
   1. С помощью программного обеспечения получения изображений, начало получения изображений. Найдите дендритов интерес с помощью красной флуоресценцией сигнала. Для обеспечения видимой реакции, во-первых, выберите проксимальной дендритов (≤ 50 мкм) как эффективность АП метод обратного распространения ошибки может значительно снижаться с расстоянием в ГАМК интернейронов²².
   2. Использование «прямоугольного инструмента в приобретение изображений программное обеспечение, масштаб целевого региона и перейти к «xt» (linescan) режим. Позиция сканирования через дендритных филиал интерес. С контроллерами интенсивности лазера в приобретении программного обеспечения установите два фотона лазерного уровня минимальной мощности, где базовые зеленой флуоресценцией чуть видно, чтобы избежать Фототоксичность.
   3. Электрофизиологии данных приобретение программного обеспечения «Протокол» окна и изображения приобретения программного обеспечения создайте пробную запись требуемой продолжительности, содержащий соматических текущего инъекции требуемой амплитуды.
      1. С помощью программного обеспечения получения изображений, нажмите кнопку «Начать запись» и приобрести флуоресценции непрерывно в течение 1-2 s. повторить изображение приобретение 3 - 10 раз. Подождите по крайней мере 30 s между одно сканирование чтобы избежать повреждений. Если приобретения linescans в нескольких точках вдоль дендритов, принимайте их в случайном порядке, чтобы избежать эффектов порядка.
4. Синаптически вызвала кошки
   1. Найдите дендритов интерес с помощью красной флуоресценцией сигнала.
   2. Установите стимуляции пипетки на поверхности среза выше дендритов интерес. Медленно опустите стимуляции дозатор на место, минимизации движение, чтобы не мешать поклеточного конфигурации. Позиция пипетки на 10-15 мкм от дендритов.
   3. Чтобы визуализировать расположение синаптической microdomains в aspiny дендритов, в программное обеспечение приобретения изображений переключитесь в 'xt' (linescan) режим и положение линии вдоль дендритных филиал интерес.
   4. В окне «Протокол» (по электрофизиологии сбора данных) и изображения приобретения программного обеспечения создайте пробную запись, вызывающее блок стимуляции после начала судебного разбирательства.
   5. С помощью приобретения программного обеспечения, нажмите кнопку «Начать запись» для сканирования вдоль дендритов непрерывно в течение 1-2, s. повторить приобретение 3 - 5 раз, ожидания 30 s между сканированием для предотвращения повреждений.
      Примечание: Длина сканирования может быть скорректирована в зависимости от кинетики вызвала событие, но должны быть сведены к минимуму для предотвращения повреждений (см. таблицу 2 для устранения неполадок).
   6. Повторите шаг 4.5.5 в разных условиях (например, различные интенсивности/длина стимуляции, введение фармакологических всплывающих окон и т.д.) в зависимости от конкретных вопрос.
   7. Остановить приобретение, когда ячейка показывает признаки ухудшения здоровья: деполяризации ниже -45 МВ, увеличение базовой Ca^{2 +} уровень, морфологические ухудшение дендритов (например, блеббинг, фрагментация; см. таблицу 2 для устранения неполадок).
   8. Чтобы получить предварительную информацию о морфологии клеток и сохранить запись расположения стимуляции пипетки, приобрести Z -стек ячейки в красный канал. С помощью приобретения программного обеспечения 'xyz' режим, установите пределы верхнего и нижнего стека изображений всю ячейку со всеми процессами, которые включены. «Размер шага» на 1 мкм и начать приобретение стека, используя кнопку «Начать запись».
   9. При Z-приобретение стека является полным, используйте параметр «Максимум проекции» в программном обеспечении для наложения всех координационных планов стека и проверка качества приобретения. Затем медленно убрать патч пипетку из фрагмента.
   10. Чтобы исправить фрагмент для пост Специального морфологической идентификации, быстро удалить фрагмент из ванны с использованием плоской кистью и поместить его между двух документов фильтра, в Петри фаго заполнены. Замените ФАГО 4% раствор параформальдегида (PFA) и оставьте блюдо в комнате 4 ° C или в холодильник на ночь.

5. иммуногистохимия для Post Hoc морфологической идентификации зарегистрированных клеток

Примечание: После 1 ночь фиксации в PFA, срез может храниться в буфере (PB) фосфат с азидом натрия (0,5%) сроком до 1 месяца.

1. Положите ломтик в трис буфер солевой раствор (TBS) с X-100 Тритон (0,3%) и выполнять 4 смывки (5-10 мин).
2. Положите ломтик в TBS-Тритон 0,3% с 10% нормальной козьего сыворотки (НГС) за 1 ч.
3. Положите ломтик в TBS-Тритон 0,3% с 1% NGS и стрептавидина конъюгированных Флюорофор (например, конъюгированных Alexa Fluor 546 стрептавидина, 1: 200) для инкубации в одночасье.
4. Вымойте 4 раза (5-10 мин) в TBS.
5. Смонтируйте ломтики на Микроскоп слайды и изображения с помощью конфокального микроскопа. Иметь полный ячейки реконструкция, приобретение Z-стека (шаг размер: 1 мкм) с помощью 20 x цель. Для визуализации Alexa-546-конъюгированных метки, используйте 543 Нм лазер и 515-560 Нм при обнаружении фильтра установлен.

6. анализ кошек

1. Извлечь значения флуоресценции из регионов интерес (ROI) в linescan изображения из красного и зеленого каналов и средние значения нескольких повторяется для каждого условия для снижения уровня шума.
   Примечание: Когда linescan приобретение осуществляется вдоль дендритов, это возможность извлекать данные из нескольких трансформирования, которые могут соответствовать дендритных microdomains (2-5 мкм), и тем самым позволяя исследование Ca^{2 +} сигнал разобщенности.
2. Для каждого ROI Экспресс изменения в Ca^{2 +} амплитуды как:
   
   Примечание: Здесь G значение флуоресценции из зеленого канала; G₀ значение базовых флуоресценции из зеленого канала в течение периода до стимуляции; Флуоресценции R значение красного канала¹⁸. Как два фотона возбуждения является в высшей степени локализованы и не создают значительных фон, вычитание фона флуоресценции не требуется.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

С использованием протокола, представленные здесь, мы получили кошки, вызывали соматических текущего инъекции и электростимуляции в дендриты oriens/alveus интернейронов в области СА1 гиппокампа. После исправления нейрона, определены на основе его форму и положение, мы приоб...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Метод, показанный здесь показано, как сочетание двух Фотон Ca^{2 +} изображений и патч зажим электрофизиологии может использоваться для изучения дендритных Ca^{2 +} сигнализации в нейрональных дендритов в острой мозга ломтиками. Этот метод позволяет для контроля как местные Ca^{2 +}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal Strain: Mouse CD1	Charles River	022
Isoflurane	AbbVie Corporation	0B506-099
CGP 55845 hydrochloride	Abcam	ab120337
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C4901
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Paraformaldehyde powder, 95%	Sigma-Aldrich	158127
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Potassium gluconate	Sigma-Aldrich	P1847
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich	T3253
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma-Aldrich	71643
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261
Alexa Fluor 594 Hydrazide	ThermoFisher Scientific	A10438
SR95531 (Gabazine)	Abcam	ab120042
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris	Sigma-Aldrich	A9062
Guanosine (GTP)-Na+	Sigma-Aldrich	G8877
Oregon Green BAPTA-1	ThermoFisher Scientific	O6812
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma-Aldrich	P1937
Streptavidin-conjugated Alexa-546	ThermoFisher Scientific	S11225
Patch Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Theta Borosilicate Glass Capillaries	Sutter Instrument	BT-150-10
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instrument
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope	Leica Microsystems
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser	Coherent
LAS AF Imaging Acquisition Software	Leica Microsystems
Temperature Controller TC-324B	Warner Instruments
MultiClamp 700B Amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A Digitizer	Molecular Devices
Confocal Translator	Siskiyou
Micromanipulator	Siskiyou
pClamp Data Acquisition Software	Molecular Devices
A365 Constant Current Stimulus Isolator	World Precision Instruments
Vibraplane Optical Table	Kinetic Systems