Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Zusammenfassung

Wir präsentieren Ihnen eine Methode, die Kombination von ganzen Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen und zwei-Photon imaging um Ca^{2 +} Transienten im neuronalen Dendriten in akuten Hirnschnitten zu erfassen.

Zusammenfassung

Kalzium (Ca^{2 +}) Bildgebung ist ein mächtiges Werkzeug um die räumlich-zeitliche Dynamik der intrazellulären Ca^{2 +} Signale in neuronalen Dendriten zu untersuchen. Ca^{2 +} Schwankungen können durch eine Vielzahl von Membran und intrazellulären Mechanismen auftreten und spielen eine entscheidende Rolle bei der Induktion der synaptischen Plastizität und Regulierung von dendritischen Erregbarkeit. Daher ist die Möglichkeit, verschiedene Arten von Ca^{2 +} Signale in dendritischen Filialen aufnehmen wertvoll für Gruppen studieren wie Dendriten Informationen zu integrieren. Das Aufkommen der zwei-Photonen-Mikroskopie hat solche Studien erheblich erleichtert durch die Bildgebung in lebender Gewebe, wie Lichtstreuung und lichtbedingten inhärenten Probleme zu lösen. Darüber hinaus durch Kombination von konventionellen elektrophysiologische Techniken mit zwei-Photon Ca^{2 +} imaging, ist es möglich zu untersuchen, lokale Ca^{2 +} Schwankungen in neuronalen Dendriten parallel mit Aufnahmen der synaptischen Aktivität in Soma. Hier beschreiben wir wie Sie diese Methode verwenden, um die Dynamik der lokalen Ca^{2 +} Transienten (Katzen) studieren in Dendriten der GABAergen inhibitorischen Interneuronen. Die Methode kann auch angewendet werden, zum Studium dendritischen Ca^{2 +} -Signalisierung in verschiedenen neuronalen in akuten Hirnschnitten.

Einleitung

Der Beitrag eines Neurons, Netzwerk-Aktivität richtet sich weitgehend nach der dynamischen Natur der synaptischen Eingänge, die er empfängt. Traditionell, stützte sich die vorherrschende Methode der Charakterisierung synaptische Aktivität in Nervenzellen auf somatische ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen von postsynaptischen Ströme, hervorgerufen durch elektrische Stimulation von Axonen der Passage. Einzige Aktivität der proximal befindet sich Synapsen wird jedoch in diesem Fall¹wahrheitsgemäß gemeldet. Darüber hinaus wurden um die Synapse-spezifische Mechanismen zu beurteilen, Aufnahmen von Paaren von Neuronen und von Dendriten an einem bestimmten Ort zur Synapsen von Interesse und die Mechanismen der dendritischen Integration bzw. Ziel. Ein wichtiger Durchbruch auf dem Gebiet der synaptischen Physiologie wurde durch eine Heirat von optischen und elektrophysiologische Techniken erreicht. Zwei-Photon Erregung Laser-scanning-Mikroskopie (2PLSM) in Kombination mit Ca^{2 +} Bildgebung und optogenetische Tools kann enorme Details der dynamischen Organisation der synaptischen Aktivität an bestimmten neuronalen Verbindungen im Gehirnscheiben in offenbaren. Vitro und in Vivo.

Einige wesentliche Vorteile hat 2PLSM von den herkömmlichen, ein Photon Erregung Mikroskopie²abheben: (1) aufgrund einer nichtlinearen Natur der zwei-Photonen-Anregung die Fluoreszenz nur im fokalen Volumen erzeugt, und vertreten alle emittierte Photonen nützliche Signale (keine Notwendigkeit für Lochkamera); (2) längere Wellenlängen, in 2PLSM, durchdringen das Gewebe Streuung effizienter; Darüber hinaus sind die gestreute Photonen zu verdünnen, Hintergrundfluoreszenz und zwei-Photon Erregung zu produzieren; (3) lichtbedingten und Phototoxizität sind auch auf der Brennebene beschränkt. Die 2PLSM bleibt daher trotz der hohen Kosten der 2-Photonen-Systeme im Vergleich zu herkömmlichen konfokale Mikroskope, eine Methode der Wahl für hochauflösende Untersuchung der neuronalen Struktur und Funktion in dicken lebendes Gewebe.

Die erste Anwendung des 2PLSM im Streuung Gewebe war es, die Struktur und Funktion der dendritischen Dornen³Bild. 2PLSM in Kombination mit Ca^{2 +} Bildgebung ergab, dass Wirbelsäulen-Funktion als isolierten biochemischen Fächer. Da in vielen neuronalen Arten gibt es eine 1: 1-Entsprechung zwischen Dornen und einzelne Synapsen⁴, wurde zwei-Photon Ca^{2 +} imaging bald ein nützliches Werkzeug, das die Aktivität der einzelnen Synapsen bei intaktem Gewebe^{5Berichterstattung, 6,7,8}. Darüber hinaus wurde 2PLSM-basierte Ca^{2 +} Bildgebung erfolgreich um die Aktivität der einzelnen Calciumkanäle und die nichtlinearen Wechselwirkungen zwischen der inneren und synaptischen maßgearbeitet überwachen sowie Zustand und aktivitätsabhängige bewerten eingesetzt Regulierung von Ca^{2 +} Signalisierung in neuronalen Dendriten^{5,6,7,8,9,10,11}.

Calcium ist ein allgegenwärtiges intrazellulären zweite Bote, und seine subzelluläre räumlich-zeitliche Organisation bestimmt die Richtung des physiologischen Reaktionen von Änderungen in der synaptischen Stärke bei der Regulierung von Ionen-Kanäle, Dendriten und Wirbelsäule Wachstum als Zelle Tod und überleben. Dendritische Ca^{2 +} Erhebungen erfolgen über Aktivierung des mehrere Wege. Aktionspotentiale (APs), Backpropagating, die Dendriten öffnen Voltage-gated Kalzium-Kanäle¹² und produzieren relativ globale Ca^{2 +} Transienten (Katzen) in Dendriten und Stacheln¹³. Synaptische Übertragung ist verbunden mit der Aktivierung der postsynaptischen Ca^{2 +}-durchlässigen Rezeptoren (NMDA, Ca^{2 +}-durchlässigen AMPA und Kainate),^6,14,15Katzen auslösen synaptische. Schließlich werden in Dendriten unter bestimmten Bedingungen^11,12,13,16Supralinear Ca^{2 +} Ereignisse generiert.

Zwei-Photonen-Ca^{2 +} Bildgebung in Kombination mit Patch-Clamp elektrophysiologische Aufnahmen beschäftigt synthetische Ca^{2 +}-empfindliche fluoreszierenden Indikatoren, die in der Regel durch die Patch-Elektrode während der gesamten Zelle Aufnahmen geliefert werden . Eine Standardmethode zur Quantifizierung von Ca^{2 +} Dynamik basiert auf der dual-Anzeige Methode^17,18. Er verwendet zwei Fluorophore mit gut getrennten Emissionsspektren (z.B., eine Kombination aus einem roten Ca^{2 +}-unempfindliche Farbe mit grünen Ca^{2 +} Indikatoren, wie Oregon Green BAPTA-1 oder Fluo-4) und hat mehrere Vorteile gegenüber der einzigen Indikator Methode. Erstens, eine Ca^{2 +}-unempfindlich Farbstoff wird verwendet, um suchen kleine Strukturen von Interesse (dendritische Verzweigungen und Stacheln) wo Ca^{2 +} Bildgebung erfolgen. Zweitens wird das Verhältnis zwischen den grünen und roten Fluoreszenz (ΔG/R) als Maß für die [Ca^{2 +}], berechnet, ist weitgehend unempfindlich gegen Veränderungen der Grundlinie Fluoreszenz aufgrund der schwankenden [Ca^{2 +}]₀^{17 , 18}. Darüber hinaus können Fluoreszenz Änderungen in Bezug auf absolute Ca^{2 +} -Konzentrationen¹⁹kalibriert werden.

Eine allgemeine Beschwerde beim laufen zwei-Photon Ca^{2 +} bildgebender Experimenten in akuten Scheiben ist Zelle Gesundheit und Stabilität der Bildaufnahme durch die hohe Laserleistung, die in der Regel verwendet. Zusätzlich in Ca^{2 +} bildgebenden Experimenten gibt es Besorgnis über die Störung und erheblichen Überschätzung der subzellulären Ca^{2 +} Dynamik da Ca^{2 +} Indikatoren als hochmobile exogene Ca^{2 +} handeln Puffer. Somit hängt die Wahl der Ca^{2 +} Kennzeichen und seine Konzentration auf die neuronalen Art, die erwartete Amplitude der Katzen und der experimentellen Frage.

Wir die Methode der zwei-Photonen-Ca^{2 +} Bildgebung für die Untersuchung von Ca^{2 +} Schwankungen in Dendriten der GABAergen Interneuronen^{9,10,11,20,21} angepasst ^{, 22}. während der Großteil der frühen Ca^{2 +} bildgebenden Studien erfolgten in den wichtigsten Neuronen, hemmende Interneurone präsentieren eine Vielzahl von funktionalen Ca^{2 +} Mechanismen unterscheiden sich von denen in Pyramidenzellen^{20 , 23 , 24}. diese Interneuron-spezifische Mechanismen (z.B. Ca^{2 +} durchlässig AMPA-Rezeptoren) können bestimmte Rollen bei der Regulierung der Aktivität der Zellen spielen. Während dendritischen Ca^{2 +} signalisieren in den Interneuronen ein verlockendes Ziel für weitere Untersuchungen ist, präsentiert zwei-Photon Ca^{2 +} Bildgebung in Dendriten dieser Zellen zusätzliche Herausforderungen, aus einem dünneren Durchmesser von Dendriten und Mangel an Stacheln eine besonders hohe endogene Ca^{2 +} -Bindungskapazität. Wie unsere Fokus auf die Untersuchung der hippocampalen Interneuronen Forschungsinteressen, wurde das folgende Protokoll, während auf verschiedenen neuronalen Populationen anwendbar zur Bewältigung dieser Herausforderungen angepasst.

Dieses Protokoll wurde mit einem kommerziellen konfokale zwei-Photonen-Mikroskop ausgeführt mit zwei externen, nicht descanned Detektoren (NDDs), Elektro-optischer Modulator (EOM) und ein Dodt Scannen gradient Kontrast (SGC) ausgestattet, und auf einer optischen Tisch installiert. Das Mikroskop wurde gepaart mit einem Exklusivrepräsentation multiphoton Laser modengekoppelten bei 800 nm (> 3 W, 140 fs Impulsen, 80 Hz Wiederholrate). Die imaging-System wurde mit einem standard Elektrophysiologie-Rig, einschließlich einer Perfusion Kammer mit einer Übersetzung Plattform mit zwei Mikromanipulatoren, eine computergesteuerte Mikroelektrode Verstärker, ein Digitizer, Temperaturregelung, eine Stimulation ausgestattet. Einheit und Datenerfassungs-Software.

Protokoll

Alle Versuche wurden gemäß den Richtlinien des Tierschutzes Tier-Schutz-Ausschuss des Université Laval und des Canadian Council on Animal Care durchgeführt.

1. Vorbereitung (Optional: bereiten Sie 1 Tag im Voraus)

1. Bereiten Sie drei Arten von künstlichen Liquor cerebrospinalis (ACFS) Lösung (Normal, Saccharose und Recovery-Lösungen, 1 L; siehe Tabelle 1). Anpassen die Osmolalität der Lösungen für 300 ± 10 mOsm²⁵ und kühlen der ACFS Saccharose bis zu einem in der Nähe des Gefrierpunktes (0-4 ° C).
   Hinweis: Die Verwendung von eine natriumarme Schneidelösung (ACFS-Saccharose) hilft die Lebensfähigkeit der Neuronen in den oberflächlichen Schichten des akuten Scheiben²⁶zu bewahren.
2. Bereiten Sie 0,75 mL Patch-Lösung, die eine rote Fluorophor (z.B.Alexa-594) enthält und eine grüne synthetische Kalzium-Indikator (z.B.Oregon Green BAPTA-1; siehe Tabelle 1). Biocytin enthalten (siehe Tabelle 1) in die Patch-Lösung, wenn post Hoc morphologische Identifikation der aufgezeichneten Zellen erforderlich ist.
3. Anpassen der Osmolalität die Lösung für 280 ± 5 mOsm und pH 7,35 ± 0,5. Halten Sie die Lösung im Kühlschrank oder auf Eis zu allen Zeiten.
   Hinweis: Wahl des Indikators Kalzium sollte auf die dynamische Bandbreite und die Art der untersuchten Ca^{2 +} Ereignisse ausgesagt werden.
4. Mit einer Mikropipette Puller, bereiten Sie Patch Pipetten aus Borosilikatglas Kapillaren (siehe Tabelle der Materialien) mit ≈ 2 µm Tipp (Pipette Widerstand von 3-5 MΩ) und Stimulation Pipetten aus Borosilikat Theta-Glaskapillaren (siehe Tabelle des Materialien) mit 2 bis 5 µm Spitze.
   Hinweis: Die Puller-Einstellungen, um Pipetten von gleichem Durchmesser und Form werden der Abzieher-Filament-Typ und die Rampe Testergebnisse für eine bestimmte Art von Glas bestimmt.

(2) hippocampal Slice-Vorbereitung

1. Die Maus zu betäuben (P13-20; vom Stamm und Geschlecht der Maus wird bestimmt durch die experimentelle Frage) mit 1 mL Isofluran auf ein Papiertuch innerhalb einer Inhalation Narkose Kammer platziert. Wenn das Tier tief betäubt ist, wie ein Mangel an Bewegung und langsame Atmung belegt, entfernen Sie sie aus der Narkose Kammer und enthaupten mit einer Guillotine.
2. Setzen Sie den Schädel durch Schneiden Sie die Haut mit einer kleinen Schere von der Rückseite des Schädels an der Nase. Verwenden Sie ein paar kleine Mini-Knochen-Rongeurs, um ein Loch auf der Bregma Ebene zu machen. Dann verwenden Sie die Schere kaudalen, rostral Schnitt entlang der sagittale Naht zu machen. Greifen Sie mit der Rongeurs der Rückseite der einzelnen Schädel Klappe und Aufzug nach oben und nach außen, um den Schädel für jede Hemisphäre zu entfernen.
3. Nachdem das Gehirn voll ausgesetzt ist, unterbieten Sie die Sehnerven mit einem kleinen Spatel. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel und steckte es in eine Petrischale mit ständig sauerstoffreiches, kalten ACFS Saccharose (siehe Tabelle 1 für Saccharose-Konzentration).
   1. Wenn Gewebe aus älteren Mäusen erforderlich ist, führen Sie eine intrakardiale Perfusion mit einer Spritze (25G) gefüllt mit 20 mL eiskaltes ACFS Saccharose vor der Gehirn-Extraktion, um gute Qualität-Scheiben zu erhalten.
4. Hippocampale Scheiben aus dem extrahierten tierischen Gehirn vorzubereiten.
   1. Lassen Sie die Gehirn Chill für ca. 2 min. Legen Sie ein Stück Filterpapier auf eine Petrischale mit Eis verpackt, das Gehirn auf dem Filterpapier zu übertragen. Die beiden Hemisphären zu sezieren.
   2. Kleben Sie die sezierten Hemisphären (die Ausrichtung richtet sich nach der experimentellen Ziel koronalen, transversale oder horizontale Scheiben zu erhalten) auf einen Vibratome Tisch und Tauchen Sie ihn in das Vibratome Fach gefüllt mit eiskalten sauerstoffreiches ACFS-Saccharose. Machen Sie 300 µm dicke Scheiben bei einer Temperatur von etwa 1 ° C durch die Verwendung einer Vibratome Kühler oder platzieren das Eis rund um das Vibratome Fach.
   3. Mit einem flachen Pinsel, reichern sich die Scheiben mit dem Hippocampus (bis zu 6 Scheiben pro Hemisphäre) in ein Bad mit Sauerstoff angereichertes ACFS-Recovery auf 37 ° c erhitzt
   4. Lassen Sie die Scheiben in der ACFS Recovery-Bad für mindestens 45 Minuten.

(3) Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahmen

1. Platz in einer Badewanne positioniert im Rahmen des Ziels eine hippocampale Scheibe inmitten (Vergrößerung: 40 x, numerische Apertur: 0,8) von einem Laserscanning-zwei-Photonen-Mikroskop. Ständig Durchspülen des Bades mit sauerstoffreichem ACFS-Normal mit einer Rate von 2,5-3 mL/min bei 30-32 ° C erhitzt.
2. Verwenden Sie Infrarot-differential Interferenz-Kontrast (IR-DIC) oder Mikroskopie Dodt-SGC, um eine Zelle mit seiner Größe, Form und Position zu finden.
   Hinweis: Abhängig von der gezielten Neuron Bevölkerung einem transgenen Mausmodell lässt sich leicht Zellen von Interesse finden. In diesem Fall kann dieser Schritt mit einer fluoreszierenden Lichtquelle ersetzt werden.
3. Füllen einer Stimulation-Pipette mit einer ACFS-Normal-Lösung enthält die rote Fluorophor (z.B.Alexa-594).
4. Stellen Sie die Stimulation-Pipette (angeschlossen an eine elektrische Stimulation-Einheit) auf der Oberseite der Scheibe so ein, dass die Spitze in der gleichen Region wie die Zelle von Interesse ist.
5. Setzen Sie nach der Patch-Pipette mit Patch Lösung füllen und Anhängen an eine Leiter Bühne ihn über das Stück, dass seine Spitze direkt oberhalb der Zelle von Interesse ist.
6. Passen Sie eine Spritze in eine drei-Wege-Hahn und verbinden Sie es mit der Patch-Pipette durch das Kunststoffrohr. Injizieren Sie konstante Überdruck in der Patch-Pipette (≈ 0,1 mL) mit der Spritze. Halten Sie der Absperrhahn in "schließen" Stellung.
7. Das Steuermodul Software Verstärker aktivieren und durch Anklicken des Buttons "VC" Voltage-Clamp-Modus wechseln. Öffnen Sie die Elektrophysiologie Datenerfassungs-Software (z.B., Clampex) für den Erwerb von elektrophysiologischen Signalen zu und klicken Sie auf das Symbol "Membran-Test" haben es ständig aussenden einer quadratischen Spannungsimpuls (5 mV, 10 ms), die notwendig ist, zu überwachen Widerstandsänderungen Pipette.
8. Senken Sie die Patch-Pipette, bis es rechts oben auf die gezielte Zelle ist. Bei der Herstellung Kontakt mit der Zellmembran, den Druck durch Drehen der Absperrhahn in der "offenen" Position entfernen.
   Hinweis: Kontakt mit der Zellmembran wird erkannt, wenn eine geringe Erhöhung der Pipette Widerstand (≈ 0,2 MΩ) sieht man eine kleine Einbuchtung auf der Zelle entsteht durch Überdruck.
9. Die Patch-Pipette mit einer leeren Spritze in den Absperrhahn eingebaut, bis die Pipette Widerstand der Software 1 GΩ erreicht zuweisen Sie einen leichten Unterdruck. Im Fenster "Membran-Test" der Datenerfassungs-Software, Klemmen Sie die Zelle bei-60 mV.
10. Weiterhin negativen Druck, bis die Zelle geöffnet wird und die gesamte Zelle Konfiguration erreicht. Erkennung von diesem Zellstatus basiert auf die plötzliche Veränderung in der Pipette Widerstand (1 GΩ, 70-500 MΩ je nach Interneuron) und das Aussehen der großen kapazitiven Transienten im Fenster "Membran-Test".

4. zwei-Photon Ca^{2 +} Imaging

1. Bei Interesse an der exzitatorischen postsynaptischen Antworten hinzufügen, die GABA-_A Rezeptor Blocker Gabazine (10 µM) und der GABA-_B -Rezeptor-Blocker CGP55845 (2 µM) in der Badewanne ACFS.
2. Im Kontrollmodul Software Verstärker setzen die Patch-Konfiguration an Strom-Klammer durch Klicken auf die Schaltfläche "CC" und Aufzeichnen der Zelle feuern Muster als Reaktion auf somatische Injektionen von depolarisierende Strom (0,8-1,0 nA, 1 s). Warten Sie mindestens 30 min für die Zelle mit den Indikatoren im Patch-Lösung gefüllt werden.
   Hinweis: Die Zelle feuern Muster und aktiven Eigenschaften lässt sich die Zelle Untertyp zu identifizieren; z. B.schnelle Spick Zellen. Es ist wichtig für die Konzentration der Indikator zur Stabilisierung durch Diffusion vor Beginn der Aufzeichnung Katzen (siehe Tabelle 2 für die Fehlersuche).
3. AP-evozierten Katzen
   1. Starten Sie mithilfe des Bild-Datenerfassungs-Software Importieren von Bildern. Suchen Sie nach einem Dendriten des Interesses über das rote Fluoreszenz-Signal. Um eine sichtbare Antwort zu gewährleisten, wählen Sie zuerst eine proximale Dendrit (≤ 50 µm), wie die Effizienz der AP Backpropagation mit Abstand in GABAergen Interneuronen²²deutlich zurückgehen kann.
   2. Vergrößern Sie die gezielte Region und wechseln Sie zum Werkzeug "rechteckige" in der Bild-Datenerfassungs-Software, die "Xt" (womit) Modus. Positionieren Sie den Scan über die dendritische Verzweigung von Interesse. Mit dem Laser Intensität Controllern in der Software zur Datenerfassung festgesetzt des zwei-Photonen-Lasers minimal Leistung wo Grundlinie grüne Fluoreszenz nur leicht sichtbar ist, Phototoxizität zu vermeiden.
   3. Erstellen Sie in der Elektrophysiologie Datenerfassungs-Software 'Protokoll'-Fenster und Bild-Datenerfassungs-Software eine Aufnahme-Testversion der gewünschten Dauer mit einer somatischen Stromeinspeisung der gewünschte Amplitude.
      1. Mit der Bild-Datenerfassungs-Software, klicken Sie auf "Aufnehmen" und erwerben Sie der Fluoreszenz kontinuierlich für 1-2 S. wiederholen die Bildaufnahme 3-10 Mal. Warten Sie mindestens 30 s zwischen Einzelscans lichtbedingten zu vermeiden. Wenn Linescans an mehreren Punkten entlang einem Dendriten zu erwerben, nehmen sie in zufälliger Reihenfolge-Effekte zu vermeiden.
4. Synaptisch-evozierten Katzen
   1. Suchen Sie nach einem Dendriten des Interesses über das rote Fluoreszenz-Signal.
   2. Legen Sie die Stimulation Pipette auf der Oberfläche der Scheibe über die Dendriten von Interesse. Senken Sie langsam die Stimulation Pipette einrastet, Bewegung, um nicht zu stören, die ganz-Zell Konfiguration zu minimieren. Positionieren Sie die Pipette auf 10-15 µm aus dem Dendriten.
   3. Um den Speicherort der synaptischen Microdomains in Aspiny Dendriten zu visualisieren, in der Bild-Datenerfassungs-Software wechseln Sie zu der 'Xt' (womit) Modus und positionieren Sie die Linie entlang der dendritischen Zweig von Interesse.
   4. Erstellen Sie im "Protokoll" Fenster (der Elektrophysiologie Datenerfassungs-Software) und Bild-Datenerfassungs-Software eine Aufnahme-Studie, die die Stimulationseinheit nach dem Test Start auslöst.
   5. Mit der Software zur Datenerfassung, klicken Sie auf "Aufnehmen", entlang der Dendrit kontinuierlich für 1-2 S. Wiederholung Erwerb 3-5mal, Scannen warten 30 s zwischen den Scans, lichtbedingten zu verhindern.
      Hinweis: Die Länge der Scan kann abhängig von der evozierten Ereignis Kinetik angepasst werden, sondern sollte zur Vermeidung von lichtbedingten minimiert werden (siehe Tabelle 2 für die Fehlersuche).
   6. Wiederholen Sie Schritt 4.5.5 unter verschiedenen Bedingungen (z.B. unterschiedlicher Intensität/Länge der Stimulation, Einführung eines pharmakologischen Blocker usw.) abhängig von der konkreten Frage in Angriff genommen.
   7. Die Übernahme zu stoppen, wenn die Zelle Anzeichen zeigt für eine Verschlechterung der Gesundheit: Depolarisation unter-45 mV, Anstieg der Basislinie Ca^{2 +} Level, morphologische Verschlechterung der Dendriten (z.B., Blebbing, Fragmentierung, siehe Tabelle 2 für die Fehlersuche).
   8. Vorläufige Informationen über die Zellmorphologie und notieren Sie den Speicherort der Stimulation Pipette, einen Z -Stapel der Zelle in den Rot-Kanal zu erwerben. Mit der Software zur Datenerfassung in "Xyz" eingestellt, die Grenzen des oberen und unteren Stapel Bild die gesamte Zelle mit allen Prozessen enthalten. Die "Schrittweite" auf 1 µm und initiiert die Stack-Erfassung über die Schaltfläche "Aufnehmen".
   9. Wenn die Z-Stapel-Übernahme abgeschlossen ist, verwenden Sie die Option "Maximale Projektion" in der Software alle fokalen Pläne des Stapels zu überlagern und überprüfen die Qualität der Akquisition. Dann, zurücknehmen Sie langsam die Patch-Pipette aus der Scheibe.
   10. Beheben Sie die Scheibe für die post-Hoc morphologische Identifikation, schnell entfernen Sie die Scheibe aus dem Bad mit einem flachen Pinsel zu, und legen Sie es zwischen zwei Filterpapiere in eine Petrischale ACFS gefüllt. Ersetzen Sie der ACFS mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) Lösung und lassen Sie die Schale im 4 ° C oder im Kühlschrank über Nacht.

5. Immunohistochemistry für Post Hoc morphologische Identifikation von aufgezeichneten Zellen

Hinweis: Nach 1 Nacht der Fixierung in PFA, kann die Scheibe im Phosphatpuffer (PB) mit Natriumazid (0,5 %) bis zu 1 Monat aufbewahrt werden.

1. Legen Sie die Scheibe in Tris gepufferte Salzlösung (TBS) mit Triton x-100 (0,3 %) und durchführen Sie 4 Wäschen (5-10 min).
2. Legen Sie die Scheibe in TBS-Triton 0,3 % mit 10 % normalem Ziegenserum (NGS) für 1 h.
3. Setzen Sie die Scheibe in TBS-Triton 0,3 % mit 1 % NGS und einer Streptavidin konjugiert Fluorophor (z.B.Alexa Fluor 546 konjugiert Streptavidin, 1: 200) für Übernachtung Inkubation.
4. Waschen Sie 4 Mal (5-10 min) in TBS.
5. Montieren Sie Scheiben auf Objektträger und Bild mit einem konfokalen Mikroskop. Um eine vollständige Zelle Rekonstruktion haben, erwerben ein Z-Stapel (Schrittweite: 1 µm) mit einem 20 X Objektiv. Für imaging eine Alexa-546-konjugiert Label festgelegt verwenden Sie 543 nm Laser und eine 515-560 nm Erkennung filtern.

6. Analyse der Katzen

1. Die Fluoreszenz-Werte aus den Regionen von Interesse (ROIs) in die womit Bilder von den roten und grünen Kanäle extrahieren und Durchschnittswerte der mehrere Wiederholungen für jede Bedingung um Rauschen zu reduzieren.
   Hinweis: Wenn womit Erwerb entlang der Dendriten durchgeführt wird, ist es möglich, Extrahieren von Daten aus mehreren ROIs, die dendritischen Microdomains (2 bis 5 µm) entsprechen kann, und damit die Studie von Ca^{2 +} Signal Abschottung.
2. Drücken Sie für jede ROI die Änderungen in Ca^{2 +} Amplitude als:
   
   Hinweis: Hier G ist der Fluoreszenz-Wert aus den Grün-Kanal; G₀ ist der Ausgangswert für die Fluoreszenz von den Grün-Kanal während der Pre-Stimulationsdauer; R ist der Fluoreszenz-Wert aus dem roten Kanal¹⁸. Als zwei-Photon Erregung stark lokalisiert ist und keine signifikanten Hintergrund erzeugt, ist Subtraktion des Hintergrundfluoreszenz nicht erforderlich.

Ergebnisse

Mit den hier vorgestellten Protokoll, erhielten wir Katzen hervorgerufen durch somatische Stromeinspeisung und die elektrische Stimulation in Dendriten von Oriens/Alveus Interneuronen im Bereich CA1 des Hippocampus. Nach Patchen eines Neurons, identifiziert auf ihre Form und Position basierend, Wir erwarben Linescans über einem proximalen Dendriten an mehreren Punkten bei Entfernungen von Soma (Abbildung 1A) gegeben. Wir beobachteten eine Abnahme der Amplitu...

Diskussion

Die hier gezeigte Methode veranschaulicht, wie die Kombination der zwei-Photonen-Ca^{2 +} Bildgebung und Patch-Clamp Elektrophysiologie verwendet werden kann, für das Studium dendritischen Ca^{2 +} Signalisierung in neuronalen Dendriten in akuten Hirnschnitten. Diese Methode ermöglicht eine Überwachung der beiden lokalen Ca^{2 +} Erhebungen hervorgerufen durch elektrische Stimulation oder Backpropagating AP in dendritischen Segmenten und somatische Reaktion der Zelle. Dies macht es ein ausgezei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal Strain: Mouse CD1	Charles River	022
Isoflurane	AbbVie Corporation	0B506-099
CGP 55845 hydrochloride	Abcam	ab120337
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C4901
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Paraformaldehyde powder, 95%	Sigma-Aldrich	158127
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Potassium gluconate	Sigma-Aldrich	P1847
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich	T3253
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma-Aldrich	71643
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261
Alexa Fluor 594 Hydrazide	ThermoFisher Scientific	A10438
SR95531 (Gabazine)	Abcam	ab120042
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris	Sigma-Aldrich	A9062
Guanosine (GTP)-Na+	Sigma-Aldrich	G8877
Oregon Green BAPTA-1	ThermoFisher Scientific	O6812
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma-Aldrich	P1937
Streptavidin-conjugated Alexa-546	ThermoFisher Scientific	S11225
Patch Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Theta Borosilicate Glass Capillaries	Sutter Instrument	BT-150-10
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instrument
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope	Leica Microsystems
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser	Coherent
LAS AF Imaging Acquisition Software	Leica Microsystems
Temperature Controller TC-324B	Warner Instruments
MultiClamp 700B Amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A Digitizer	Molecular Devices
Confocal Translator	Siskiyou
Micromanipulator	Siskiyou
pClamp Data Acquisition Software	Molecular Devices
A365 Constant Current Stimulus Isolator	World Precision Instruments
Vibraplane Optical Table	Kinetic Systems