Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Resumen

Se presenta un método que combina grabaciones de celulares-abrazadera del remiendo y la proyección de la imagen de dos fotones para registrar a transitorios de Ca^{2 +} en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro agudo.

Resumen

Proyección de imagen de calcio (Ca^{2 +}) es una herramienta poderosa para investigar la dinámica espacio-temporal de Ca^{2 +} señales intracelulares en las dendritas neuronales. CA^{2 +} las fluctuaciones pueden ocurrir a través de una variedad de membranas y mecanismos intracelulares y juega un papel crucial en la inducción de la plasticidad sináptica y la regulación de la excitabilidad dendrítica. Por lo tanto, la capacidad para registrar diferentes tipos de señales de Ca^{2 +} en ramas dendríticas es valiosa para estudiar cómo las dendritas integran información de grupos. El advenimiento de la microscopía de dos fotones ha facilitado este tipo de estudios significativamente mediante la solución de los problemas inherentes a la proyección de imagen en tejido vivo, como la dispersión de la luz y fotodaño. Además, a través de la combinación de técnicas electrofisiológicas convencionales con dos fotones Ca^{2 +} proyección de imagen, es posible investigar local Ca^{2 +} las fluctuaciones en las dendritas neuronales en forma paralela a las grabaciones de la actividad sináptica en Soma. Aquí, describimos cómo utilizar este método para estudiar la dinámica de local Ca^{2 +} transitorios (gatos) en las dendritas de las interneuronas inhibitorias GABAérgicas. El método puede ser aplicado también al estudio de dendríticas Ca^{2 +} en diferentes tipos neuronales en rebanadas de cerebro agudo.

Introducción

La contribución de una neurona a la actividad de la red está determinada por la naturaleza dinámica de las entradas sinápticas que recibe. Tradicionalmente, el método predominante de caracterizar la actividad sináptica en las neuronas dependía de grabaciones somáticas celulares-abrazadera del remiendo de corrientes postsynaptic evocadas por la estimulación eléctrica de los axones de paso. Sin embargo, única actividad de la sinapsis situada proximally se divulga con la verdad en este caso¹. Además, para evaluar los mecanismos específicos de la sinapsis, se han utilizado grabaciones de pares de neuronas y dendritas en un lugar específico a las sinapsis de interés y los mecanismos de integración dendrítica, respectivamente. Se logró un gran avance en el campo de la Fisiología sináptica a través de una combinación de técnicas ópticas y electrofisiológicas. Láser de excitación de dos fotones microscopía (2PLSM) en combinación con herramientas de optogenetic y Ca^{2 +} la proyección de imagen puede revelar grandes detalles de la organización dinámica de la actividad sináptica en las conexiones neuronales específicas en rebanadas de cerebro en Vitro e in vivo.

Varias ventajas claves hecho 2PLSM sobresalen la excitación convencional, un fotón microscopia²: (1) debido al carácter no lineal de excitación de dos fotones, la fluorescencia se genera solamente en el volumen focal, y representan todos los fotones emitidos señales útiles (sin necesidad de agujero de alfiler); (2) más de largo longitudes de onda, utilizados en 2PLSM, penetran en el tejido de dispersión más eficiente; Además, los fotones dispersos son demasiado diluidos para producir la excitación de dos fotones y la fluorescencia del fondo; (3) fotoenvejecimiento y fototoxicidad también se limitan al plano focal. Por lo tanto, a pesar del alto costo de los sistemas 2-fotón en comparación con los microscopios confocales convencionales, la 2PLSM sigue siendo un método de elección para la investigación de alta resolución de la estructura neuronal y función en tejido grueso vivo.

El primer uso de 2PLSM en el tejido de dispersión fue la imagen de la estructura y función de espinas dendríticas³. 2PLSM en combinación con Ca^{2 +} la proyección de imagen ha revelado esa función de espinas como compartimientos bioquímicos aislados. Ya que en muchos tipos neuronales existe una correspondencia biunívoca entre espinas y las sinapsis individuales⁴, dos fotones Ca^{2 +} imagen pronto se convirtió en una útil herramienta de reporting de la actividad de las sinapsis individuales en el tejido intacto^{5, 6,7,8}. Además, basado en la 2PLSM Ca^{2 +} proyección de imagen fue utilizado con éxito para supervisar la actividad de los canales de calcio solo y las interacciones no lineales entre las conductancias intrínsecas y sinápticas, así como para evaluar el estado y actividad dependiente regulación de Ca^{2 +} en las dendritas neuronales^{5,6,7,8,9,10,11}.

El calcio es un segundo mensajero intracelular ubicuo y su organización espacio-temporal subcelular determina la dirección de las reacciones fisiológicas, de los cambios en fuerza sináptica a la regulación de iones canales, crecimiento de la dendrita y la columna vertebral, como así como la muerte celular y la supervivencia. Dendríticas Ca^{2 +} elevaciones se producen mediante la activación de múltiples vías. Potenciales de acción (APs), backpropagating a las dendritas, abre voltaje-bloqueado calcio canales¹² y producir a relativamente global Ca^{2 +} transitorios (gatos) en las dendritas y espinas¹³. Transmisión sináptica se asocia con la activación de postsynaptic Ca^{2 +}-permeables receptores (NMDA, Ca^{2 +}-permeable al AMPA y kainato), activación sináptica gatos de^14,6,15. Por último, pueden generarse supralinear Ca^{2 +} eventos en dendritas bajo ciertas condiciones^11,12,13,16.

Emplea dos fotones Ca^{2 +} proyección de imagen en combinación con las grabaciones electrofisiológicas abrazadera del remiendo sintético Ca^{2 +}-indicadores fluorescentes sensibles, que por lo general se entregan a través de los electrodos de parche durante grabaciones de celulares . Un método estándar para la cuantificación de la dinámica de Ca^{2 +} se basa en el método de doble indicador^17,18. Utiliza dos fluoróforos con espectros de emisión bien separados (p. ej., una combinación de un rojo Ca^{2 +}-insensible tinta verde Ca^{2 +} indicadores, tales como verde de Oregon BAPTA-1 o Fluo-4) y tiene varias ventajas en comparación con el método de indicador único. Primero, una Ca^{2 +}-insensible tinte se utiliza para localizar pequeñas estructuras de interés (ramas dendríticos y espinas) donde se realizará la proyección de imagen de Ca^{2 +} . En segundo lugar, la relación entre el cambio en la fluorescencia verde y rojo (ΔG/R) se calcula como una medida de la [Ca^{2 +}], que es en gran parte insensible a los cambios en la fluorescencia basal debido a fluctuaciones en la [Ca^{2 +}]₀^{17 , 18}. por otra parte, cambios de fluorescencia pueden ser calibradas en términos de absoluta Ca^{2 +} concentraciones¹⁹.

Una preocupación general cuando dos fotones Ca^{2 +} de los experimentos en rebanadas agudos es celular salud y estabilidad de la adquisición de la imagen debido a la potencia del láser alta que normalmente se utiliza. Además, en experimentos de Ca^{2 +} proyección de imagen, hay preocupación por la perturbación y considerable sobreestimación de subcelular Ca^{2 +} dinámica debido a que los indicadores de Ca^{2 +} actúan como móvil altamente exógeno Ca^{2 +} almacenadores intermediarios. Por lo tanto, la elección del indicador de Ca^{2 +} y su concentración depende del tipo neuronal, la amplitud esperada de gatos y de la pregunta experimental.

Adaptamos el método de dos fotones Ca^{2 +} proyección de imagen para investigación de Ca^{2 +} las fluctuaciones en las dendritas de GABAérgico interneuronas^{9,10,11,20,21 , 22}. mientras que la mayor parte de los primeros Ca^{2 +} imagen estudios se realizaron en las principales neuronas, inhibitorios interneurons mostrar una gran variedad de funciones Ca^{2 +} mecanismos que son distintas a las de las células piramidales^{20 , 23 , 24}. estos mecanismos específicos de interneurona (p. ej., Ca^{2 +} permeable AMPA receptores) pueden desempeñar papeles específicos en la regulación de la actividad de la célula. Dendríticas Ca^{2 +} en interneuronas es un objetivo tentador para la posterior investigación, dos fotones Ca^{2 +} en las dendritas de estas células presenta desafíos adicionales, de un diámetro más fino de las dendritas y la falta de espinas para una particularmente alta Ca^{2 +} vinculante capacidad endógena. Como nuestra investigación intereses se centran en el estudio de interneurons hippocampal, el siguiente protocolo, si bien aplicable a distintas poblaciones neuronales, fue adaptado para hacer frente a esos desafíos.

Este protocolo fue ejecutado con un microscopio confocal comercial de dos fotones, que fue equipado con dos detectores externos, no descanned (NDDs), modulador electro-óptico (MOE) y un Dodt exploración contraste degradado (SGC) e instalado sobre una mesa óptica. El microscopio fue juntado con un láser de TI: zafiro multifotón modo-bloqueado a 800 nm (> 3 W 140 pulsos de fs, tasa de repetición de 80 Hz). El sistema de proyección de imagen fue equipado con una plataforma de electrofisiología estándar, incluyendo una cámara de perfusión con control de temperatura, una plataforma de traducción con dos micromanipuladores, un amplificador controlado por ordenador del microelectrodo, un digitalizador, un estímulo unidad y software de adquisición de datos.

Protocolo

Todos los experimentos fueron realizados siguiendo las directrices de bienestar animal de la Comisión de protección Animal de Université Laval y el Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal.

1. preliminar preparación (opcional: preparar 1 día de anticipación)

1. Preparar tres tipos de solución de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) (Normal, sacarosa y soluciones de recuperación, 1 L cada; ver tabla 1). Ajustar la osmolalidad de las soluciones a 300 ± 10 mOsm²⁵ y enfriar la ACSF sacarosa hasta un punto cerca del punto de congelación (0-4 ° C).
   Nota: El uso de una solución de corte bajo en sodio (ACSF-sacarosa) ayuda a preservar la viabilidad de las neuronas en las capas superficiales de rebanadas agudo²⁶.
2. Preparar 0,75 mL de solución de parche que contiene un fluoróforo rojo (por ejemplo, Alexa-594) y un indicador de calcio sintético verde (p. ej., Oregon Green BAPTA-1; ver tabla 1). Incluyen la biocitina (ver tabla 1) en la solución de parche si post hoc la identificación morfológica de las células registradas.
3. Ajustar la osmolalidad de la solución de 280 ± 5 mOsm y pH 7.35 ± 0.5. Mantener la solución en el refrigerador o en hielo en todo momento.
   Nota: Elección del indicador de calcio se debe basa su rango dinámico y la naturaleza de las Ca^{2 +} eventos investigados.
4. Utilizando un extractor de micropipeta, preparar pipetas de parche de Capillares de vidrio de borosilicato (véase Tabla de materiales) con una punta de 2 μm ≈ (resistencia de la pipeta de MΩ 3-5) y pipetas de estimulación de Capillares de vidrio de theta de borosilicato (véase tabla de Materiales) con una punta de 2-5 μm.
   Nota: La configuración del extractor para pipetas de un diámetro determinado y la forma se determinará por el tipo de filamento del extractor y resultados de la prueba de rampa para un determinado tipo de vidrio.

2. hipocampo sector preparación

1. Anestesiar el ratón (P13-20; la tensión y el sexo del ratón viene determinado por la pregunta experimental se aborda) con 1 mL de isoflurano sobre una toalla de papel dentro de una cámara de narcosis por inhalación. Cuando el animal está anestesiado profundamente, según lo evidenciado por la falta de movimiento y la respiración lenta, retire de la cámara de narcosis y decapitar con una guillotina.
2. Exponer el cráneo mediante la reducción de la piel con un pequeño par de tijeras de la parte posterior del cráneo a la nariz. Utilice un par de gubias hueso mini para hacer un agujero en el nivel de bregma. Luego utilice las tijeras para hacer un corte caudal a rostral a lo largo de la sutura sagital. Con las gubias Sujete la parte posterior de cada aleta de cráneo y levante hacia arriba y hacia afuera para extraer el cráneo cubriendo cada hemisferio.
3. Después de que el cerebro está completamente expuesto, socavar los nervios ópticos con una pequeña espátula. El cerebro del cráneo y colocarlos en una placa Petri conteniendo continuamente oxigenada, frío ACSF-sacarosa (ver tabla 1 para la concentración de sacarosa).
   1. Si el tejido de los ratones más viejos se requiere, realizar una perfusión intracardiaca mediante una jeringa (25G) con 20 mL de helado ACSF-sacarosa antes de la extracción de cerebro para obtener rebanadas de buena calidad.
4. Se preparan rebanadas de hipocampales del cerebro de animales extraídos.
   1. Deje que el frío cerebro de alrededor de 2 minutos Coloque un pedazo de papel de filtro en una placa de Petri llenas de hielo, transferir el cerebro en el papel de filtro. Diseccionar los dos hemisferios.
   2. Los hemisferios disecados (la orientación se determina por el objetivo experimental para obtener rebanadas de coronal, transversal u horizontal) del pegamento en una mesa de vibratome y sumergirlo en la bandeja de vibratome con helada ACSF oxigenada-sacarosa. Hacer 300-μm rodajas gruesas en una temperatura de aproximadamente 1 ° C utilizando un vibratome refrigerador o colocar el hielo alrededor de la bandeja de vibratome.
   3. Usando una brocha plana, se acumulan las rebanadas con el hipocampo (para 6 rebanadas por hemisferio) en un baño que contiene oxigenado ACSF-recuperación calentado a 37 ° C.
   4. Deja las rodajas en el baño de la ACSF-recuperación de al menos 45 minutos.

3. celulares Patch-clamp grabaciones

1. Establecido una rebanada hipocampal en un baño colocado debajo del objetivo (aumento: 40 x, apertura numérica: 0.8) de un microscopio de dos fotones de escaneo láser. Continuamente inundar el baño con oxigenada ACSF Normal calentada a 30-32 ° C a una velocidad de 2,5-3 mL/min.
2. Uso de contraste de interferencia diferencial infrarrojo (IR-DIC) o microscopía Dodt-SGC para localizar una celda de interés mediante su tamaño, forma y posición.
   Nota: Dependiendo de la población de neuronas específicas, un modelo de ratón transgénico puede utilizarse para localizar fácilmente las células de interés. En este caso, este paso puede reemplazarse con el uso de una fuente de luz fluorescente.
3. Llenar una pipeta de estimulación con una solución de la ACSF Normal que contiene el fluoróforo rojo (por ejemplo, Alexa-594).
4. Establece la pipeta de estimulación (conectada a una unidad de estimulación eléctrica) encima de la rebanada para que la punta esté en la misma región que la celda de interés.
5. Después de llenar la pipeta del parche con solución de parche y conectarlo a una fase principal, ponerlo sobre la rebanada de modo que su punta esté directamente sobre la célula de interés.
6. Encaja una llave de tres vías con una jeringa y conéctela a la pipeta de parche a través del tubo plástico. Inyectar una presión positiva constante en la pipeta de parche (≈ 0,1 mL) utilizando la jeringa. Mantenga la llave de paso en posición "close".
7. Activar el módulo de software de control de amplificador e interruptor al modo de pinza de voltaje haciendo clic en el botón "VC". Abra el software de adquisición de datos de electrofisiología (p. ej., clampex) para adquisición de señales electrofisiológicas y haga clic en el icono de "Prueba de membrana" que continuamente envía un pulso de voltaje cuadrado (5 mV, 10 ms), que es necesario controlar cambios en la resistencia de la pipeta.
8. Baje la pipeta de parche hasta que está justo encima de la celda objetivo. Al hacer contacto con la membrana celular, retire la presión girando la llave hasta la posición "abierta".
   Nota: El contacto con la membrana celular se detecta cuando un pequeño aumento en la resistencia de la pipeta (≈ 0.2 MΩ) se ve y una pequeña hendidura en la célula es causada por la presión positiva.
9. Aplicar una ligera presión negativa en la pipeta patch usando una jeringa de vacíela instalada en la llave de paso hasta que llegue a la resistencia de pipeta proporcionada por el software de 1 GΩ. En la ventana de 'Test de membrana' del software de adquisición de datos, fije la celda a -60 mV.
10. Siga aplicando presión negativa hasta que la célula se abre y se logra la configuración de célula entera. Detección de este estado de la célula se basa en el cambio repentino en la resistencia de la pipeta (de 1 GΩ a MΩ 70-500 dependiendo del tipo de interneurona) y la aparición de grandes transitorios capacitivas en la ventana de 'Test de membrana'.

4. dos fotones Ca^{2 +} imagen

1. Si está interesado en las respuestas postsinápticas excitatorias, añadir el gabazine de bloqueador de receptor GABA_A (10 μm) y el bloqueador de los receptores GABA_B CGP55845 (2 μm) en el baño de la ACSF.
2. En el módulo de software de control de amplificador, establecer la configuración de parche a pinza de corriente haciendo clic en el botón "CC" y registrar el patrón de la leña de la célula en respuesta a las inyecciones somáticas de la corriente de despolarización (0.8-1.0 nA, 1 s). Espere al menos 30 min para la célula que se llena de los indicadores presentes en la solución de parche.
   Nota: La celda patrón de disparo y propiedades activas se pueden utilizar para identificar el subtipo de la célula; por ejemplo, las células rápido disparando. Es importante para la concentración de indicador estabilizar a través de la difusión antes de comenzar a grabar gatos (ver tabla 2 para la solución de problemas).
3. AP-evocado gatos
   1. Utilizando el software de adquisición de imagen, iniciar la adquisición de imágenes. Localizar una dendrita de interés utilizando la señal de fluorescencia roja. Para asegurar una respuesta visible, primero, elegir una dendrita proximal (≤ 50 μm) como la eficiencia de AP backpropagation puede disminuir significativamente con la distancia de interneuronas GABAérgicas²².
   2. Utilizando la herramienta' rectangular' en el software de adquisición de imagen, zoom en la región de destinada y cambiar a la "xt" (linescan) modo. Posición la exploración a través de la rama dendrítica de interés. Con los controladores de intensidad del laser en el software de adquisición, establecer el régimen de dos fotones láser a un nivel de mínima energía donde la fluorescencia basal verde es poco visible, para evitar fototoxicidad.
   3. En el software electrofisiología de adquisición de datos software de adquisición de imagen y de ventana de 'Protocolo', crear un ensayo de grabación de la duración deseada que contenga una inyección actual somática de la amplitud deseada.
      1. Utilizando el software de adquisición de imagen, haga clic en el botón "Start record" y adquirir la fluorescencia continuamente durante 1-2 s. repetir la adquisición de la imagen 3 - 10 veces. Espere al menos 30 s entre exploraciones solo para evitar el fotoenvejecimiento. Si adquirir linescans en múltiples puntos a lo largo de una dendrita, llevarlos en orden aleatorio para evitar efectos de orden.
4. CCIS-evocado gatos
   1. Localizar una dendrita de interés utilizando la señal de fluorescencia roja.
   2. Ponga la pipeta de estimulación sobre la superficie de la rebanada sobre la dendrita de interés. Baje lentamente la pipeta de estimulación en su lugar, reduciendo al mínimo movimiento para evitar alterar la configuración de célula entera. Coloque la pipeta en 10-15 μm de la dendrita.
   3. Para visualizar la ubicación de microdominios sináptica en las dendritas aspiny, en el software de adquisición de la imagen pase a la 'xt' (linescan) modo y posición de la línea a lo largo de la rama dendrítica de interés.
   4. En la ventana de 'Protocolo' (de software de adquisición de datos de electrofisiología) y software de adquisición de imagen, crear un estudio de grabación que activa la unidad de estimulación después del comienzo de la prueba.
   5. Utilizando el software de adquisición, haga clic en el botón "Start record" para explorar a lo largo de la dendrita continuamente para adquisición de repetir s. 1-2 3 - 5 veces, esperar 30 s entre exploraciones para prevenir el fotoenvejecimiento.
      Nota: La longitud de exploración puede ajustarse dependiendo de la cinética del evento evocado, pero debe reducirse para evitar el fotodaño (ver tabla 2 para la solución de problemas).
   6. Repita el paso 4.5.5 en diferentes condiciones (por ejemplo, diferente intensidad, longitud de la estimulación, la introducción de un bloqueador de farmacológico, etc.) dependiendo de la pregunta concreta que se aborda.
   7. Detener la adquisición cuando la célula muestra signos de deterioro de la salud: despolarización por debajo de -45 mV, aumento en la línea de base nivel de Ca^{2 +} , deterioro morfológico de las dendritas (por ejemplo, el blebbing, fragmentación; ver tabla 2 para la solución de problemas).
   8. Para obtener información preliminar sobre la morfología de la célula y mantener un registro de la ubicación de la pipeta de estimulación, adquirir una Z -pila de la célula en el canal rojo. Utilizando el software de adquisición de 'xyz' modo, establecer los límites superior e inferior de la pila a toda la célula de la imagen con todos los procesos incluidos. La magnitud en 1 μm e iniciar la adquisición de la pila utilizando el botón "Iniciar registro".
   9. Cuando la Z-pila adquisición es completa, utilice la opción de "Proyección de la máxima" en el software para superponer todos los planes focales de la pila y Compruebe la calidad de la adquisición. Entonces, retraiga lentamente la pipeta del parche de la rebanada.
   10. Para corregir el slice para identificación morfológica post hoc , rápidamente retirar el segmento del baño utilizando un pincel plano y colocar entre dos papeles de filtro, en un plato de Petri llenas de ACSF. Vuelva a colocar la ACSF con una solución al 4% paraformaldehido (PFA) y dejar el plato en una habitación de 4 ° C o el refrigerador durante la noche.

5. inmunohistoquímica para Post Hoc identificación morfológica de las células registradas

Nota: Después de 1 noche de fijación en la PFA, el segmento puede almacenarse en tampón de fosfato (PB) con azida de sodio (0,5%) durante 1 mes.

1. Poner la rodaja en solución salina tamponada con Tris (TBS) con Triton X-100 (0.3%) y realizar 4 lavados (5-10 minutos cada uno).
2. Poner la rodaja en TBS-Triton 0.3% con 10% de suero normal de cabra (NGS) durante 1 hora.
3. Poner la rodaja en TBS-Triton 0.3% 1% NGS y un fluoróforo conjugado estreptavidina (p. ej., Alexa Fluor 546 conjugado estreptavidina, 1: 200) para la noche incubación.
4. Lavar 4 veces (5-10 min) en TBS.
5. Monte rebanadas en imagen con un microscopio confocal y microscopio. Para que una reconstrucción completa de la célula, adquirir un Z-stack (tamaño de paso: 1 μm) usando un objetivo de 20 x. Para una etiqueta de Alexa-546-conjugado de la proyección de imagen, uso que un 543 nm láser y una detección de 515-560 nm filtro establecido.

6. Análisis de los gatos

1. Extraer los valores de fluorescencia de las regiones de interés (ROIs) en las imágenes de linescan de los canales rojo y verdes y promedio de los valores de las múltiples repeticiones para cada condición reducir el ruido.
   Nota: Cuando linescan adquisición se realiza a lo largo de la dendrita, es posible extraer datos de varios reyes, que pueden corresponder a microdominios dendríticas (2-5 μm), y permitiendo el estudio de la compartimentalización señal de Ca^{2 +} .
2. Cada ROI, expresan los cambios en el Ca^{2 +} amplitud como:
   
   Nota: Aquí G es el valor de fluorescencia del canal verde; G₀ es el valor de fluorescencia de línea de base del canal verde durante el período de estimulación previa; R es el valor de fluorescencia de la canal rojo¹⁸. Excitación de dos fotones es muy localizada y no genera un fondo importante, resta de la fluorescencia de fondo no es necesario.

Resultados

Utilizando el protocolo presentado aquí, obtuvimos gatos evocados por inyección actual somática y por estimulación eléctrica en las dendritas de las interneuronas oriens/alveus en el área CA1 del hipocampo. Después de remendar una neurona, identificada en su forma y posición base, hemos adquirido el linescans a través de una dendrita proximal en varios puntos en el dado Distancias desde el soma (figura 1A). Se observó una disminución en la amplitud...

Discusión

El método que se muestra a continuación muestra cómo la combinación de dos fotones Ca^{2 +} proyección de imagen y electrofisiología patch-clamp se puede utilizar para estudiar dendríticas Ca^{2 +} en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro agudo. Este método permite el control de ambos el local Ca^{2 +} elevaciones evocadas por AP eléctrico de estimulación o backpropagating en segmentos dendríticos y la respuesta somática de la célula. Esta es una excelente herramienta para ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal Strain: Mouse CD1	Charles River	022
Isoflurane	AbbVie Corporation	0B506-099
CGP 55845 hydrochloride	Abcam	ab120337
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C4901
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Paraformaldehyde powder, 95%	Sigma-Aldrich	158127
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Potassium gluconate	Sigma-Aldrich	P1847
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich	T3253
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma-Aldrich	71643
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261
Alexa Fluor 594 Hydrazide	ThermoFisher Scientific	A10438
SR95531 (Gabazine)	Abcam	ab120042
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris	Sigma-Aldrich	A9062
Guanosine (GTP)-Na+	Sigma-Aldrich	G8877
Oregon Green BAPTA-1	ThermoFisher Scientific	O6812
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma-Aldrich	P1937
Streptavidin-conjugated Alexa-546	ThermoFisher Scientific	S11225
Patch Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Theta Borosilicate Glass Capillaries	Sutter Instrument	BT-150-10
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instrument
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope	Leica Microsystems
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser	Coherent
LAS AF Imaging Acquisition Software	Leica Microsystems
Temperature Controller TC-324B	Warner Instruments
MultiClamp 700B Amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A Digitizer	Molecular Devices
Confocal Translator	Siskiyou
Micromanipulator	Siskiyou
pClamp Data Acquisition Software	Molecular Devices
A365 Constant Current Stimulus Isolator	World Precision Instruments
Vibraplane Optical Table	Kinetic Systems