جيل واستزراع من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار

Summary

جلد الإنسان يعمل كخط أول للدفاع ضد البيئة الخارجية. نحن نقدم طريقة لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار. هذه الخلايا الكيراتينيه معزولة هي مفيدة في الأجهزة التجريبية العديدة، وهي نموذج مناسب جداً لدراسة الآليات الجزيئية في البيولوجيا الجلدي في المختبر.

Abstract

والوظيفة الرئيسية للخلايا الكيراتينيه توفير السلامة الهيكلية للبشرة، وبالتالي الحفاظ على حاجز ميكانيكية على العالم الخارجي. وبالإضافة إلى ذلك، الخلايا الكيراتينيه تلعب دوراً أساسيا في البدء، والصيانة، وتنظيم الاستجابات المناعية البشرة بكونها جزءا من نظام المناعة الفطرية الاستجابة للمحفزات مستضدي بطريقة سريعة وغير محدد. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار، وتبين أن هذه الخلايا تستجيب للتمايز المحطة الطرفية المستحثة بالكالسيوم، الذي يقاس بتعبير زيادة من إينفولوكرين علامة تمييز. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تبين أن الخلايا الكيراتينيه معزولة تستجيب لتفعيل مسارات الإشارات داخل الخلايا التي يسببها 1β إيل مقاسا بتنشيط p38 MAPK المسار. أخذت معا، يصف لنا طريقة للعزل واستزراع من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار. لأن الخلايا الكيراتينيه نوع الخلية الغالبة في البشرة، يعد هذا الأسلوب مفيداً لدراسة الآليات الجزيئية في البيولوجيا الجلدي في المختبر.

Introduction

الجلد هو أكبر جهاز في جسم الإنسان، ويعمل كحاجز وقائي ضد البيئة الخارجية. ويتألف الجلد من طبقتين الرئيسية: الأدمة والبشرة، حيث يشكل البشرة الطبقة الخارجية من الجلد. نوع الخلية الأكثر وفرة في البشرة من الخلايا الكيراتينيه تتألف من أكثر من 95% من الخلية الجماعية^1،2. يتم الاحتفاظ بمراحل مختلفة من التمايز في البشرة الخلايا الكيراتينيه ويتم تنظيمها في الطبقات القاعدية والشائكة والحبيبية، وكورنيفيد التي تتوافق مع مراحل محددة من التمايز³. الوظيفة الأساسية للخلايا الكيراتينيه لتوفير السلامة الهيكلية للبشرة، وبالتالي إنتاج حاجز سليمة للعالم الخارجي.

الخلايا الكيراتينيه أيضا تمثل الخط الأول للدفاع ضد العوامل الممرضة في الجلد، وذلك دوراً هاما في الاستجابة المناعية الفطرية^4،5. تعرض الخلايا الكيراتينيه للمنبهات الخارجية يؤدي إلى تفعيل مسارات الإشارات داخل الخلايا، وفي وقت لاحق، إنتاج عدد من الوسطاء التهابات مختلفة بما في ذلك السيتوكينات والمستقطبات الببتيدات المضادة للميكروبات. هذه البروتينات المشتقة من keratinocyte المشاركة في الاستجابة الالتهابية عن طريق تجنيد وتفعيل الخلايا المناعية مثل الخلايا الجذعية، العَدلات، وخلايا T محددة^6،7. وهكذا، لأن الخلايا الكيراتينيه تلعب دوراً حاسما في العديد من العمليات البيولوجية، كان الأساس المنطقي لهذه التقنية المقدمة هنا لإنشاء نموذج في المختبر لدراسة البيولوجيا الجلد. كثيرا ما تستخدم الثقافات keratinocyte الأولية التي تم الحصول عليها من حديثي الولادة القلفة لدراسة البيولوجيا الجلد^8،9. ومع ذلك، مع الأسلوب الموصوفة هنا، الكيراتينيه من كلا الجنسين يتم الحصول عليها أدى تنوع البيولوجي أعلى من الخلايا.

نقدم هنا، بروتوكول مفصل لعزله وجيل من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار، بما في ذلك الصيانة وتجميد الخلايا الكيراتينيه. والهدف العام لهذا الأسلوب هو توليد الكيراتينيه البشرية الأساسية التي يمكن استخدامها كنموذج لدراسة البيولوجيا الجلدي في المختبر.

Protocol

جمع عينات الجلد من المتطوعين البالغين صحية خضوعه لجراحة التجميل يتطلب موافقة من اللجنة الأخلاقية في المؤسسات المضيفة. وأقر هذا البروتوكول الإقليمية الأخلاقية اللجنة من منطقة Midtjylland، الدانمرك (M-20110027). الأسلوب الموصوفة هنا هي المستمدة من دراسات مماثلة من ماسياق et al. ليو وكاراسيك¹¹و ¹⁰ .

1-عزل الخلايا الكيراتينيه من جلد الإنسان

1. ابدأ بتقديم الحلول التالية: حل 50 مل من 0.25% جلوكوز التربسين و 0.1 في المائة في دببس. ميكس وتصفية تعقيم (0.2 ميكرومتر) الحل. إعداد 10 مل ربمي-1640 + 2% FBS الحل، 50 مل من دببس و keratinocyte خالية من المصل المتوسطة (كسفم). إضافة ملاحق كسفم و 250 ميليلتر مع الجنتامايسين إلى 500 مل كسفم. قبل الحارة الحلول إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
2. جمع الجلد من المتطوعين البالغين صحية خضوعه لجراحة التجميل. عينات الجلد المستخدمة هي حوالي 10 سم × 15 سم، ولكن يمكن أن تختلف في الحجم. الحفاظ على الجلد باردة تحت بند النقل بنقل عينات الجلد في مربع الستايروفوم التي تحتوي على عنصر تبريد. إذا لزم الأمر، يمكن تخزين العينة الجلد عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
3. إزالة الدهون من أسفل المقطع الجلد باستخدام مقص معقم والمشارط، وملقط.
4. مشبك بالمقطع الجلد (حوالي 10 × 15 سم) على غلاف عقيمة على رأس لوحة باستخدام الإبر. أولاً، قم بتنظيف الجلد بوسادة شاش معقم جاف. ثم قم بتنظيف الجلد باستخدام وسادة شاش معقم مع الإيثانول 70%.
5. استخدام استواء سيرا على أقدام، قطع من الطبقة العليا (البشرة) قسم الجلد ووضعها في سم 9 طبق بيتري. ثم فورا إضافة 25 مل الحل دببس/التربسين/الجلوكوز (إعداد في الخطوة 1، 1) إلى طبق بيتري. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
6. استخدام ماصة إزالة الحل دببس/التربسين/الجلوكوز من طبق بيتري وإضافة 10 مل من RPMI 1640 + 2% FBS لإلغاء تنشيط التربسين.
7. استخدام الملقط اثنين، الآن إطلاق خلايا البشرة في المتوسط بلطف كشط والتحريض البشرة والمقصورة الجلد من أقسام الجلد.
8. تصفية تعليق خلية البشرة من خلال عامل تصفية معادن (حجم فجوة 1 ملم)، وجمع في أنبوب 50 مل. إضافة المقاطع الجلد المتبقية إلى أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل 1640 RPMI دون FBS ودوامه لتصفية س. 10 التعليق من خلال المعدن تصفية في أنبوب 50 مل الذي يحتوي على تعليق خلية البشرة. إضافة دببس إلى إجمالي حجم 50 مل.
9. الطرد المركزي بتعليق خلية لمدة 10 دقيقة في 450 x ز في درجة حرارة الغرفة.
10. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه خلية البشرة في حوالي 10 مل من 37 درجة مئوية كسفم تبعاً لحجم الخلية بيليه. عد الخلايا باستخدام تريبان الأزرق تلطيخ الأسلوب تحت المجهر. عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من قسم جلد 10 × 15 سم من حوالي 50-100 × 10⁶ خلايا. لكل قارورة الثقافة² 75 سم، نقل 8 × 10⁶ خلايا جنبا إلى جنب مع 12 مل 37 درجة مئوية كسفم. بلطف يهز قوارير الثقافة لضمان التوزيع الموحد للخلايا.
11. احتضان الخلايا الكيراتينيه في حاضنة 37 درجة مئوية مع 100% رطوبة و 5% CO₂. تغيير في المتوسط بعد يومين وثلاث مرات أسبوعيا. مرور الخلايا عند الثقافة روافد 70-80 ٪، التي تستغرق حوالي 2 أسابيع تبعاً لمعدل انتشار الخلايا الكيراتينيه.

2-باساجينج من الخلايا الكيراتينيه

1. الحرارة المبلغ المناسب لحل يدتا التربسين 0.05% إلى 37 درجة مئوية في حاضنة. استخدام 4.5 مل من محلول يدتا التربسين 0.05% قارورة ثقافة² 75 سم.
2. إزالة المتوسطة من الخلايا، وإضافة 4.5 مل/75 سم² الثقافة قارورة استعد قبل حل يدتا التربسين 0.05% للخلايا. ضع قارورة الثقافة في الحاضنة (37 درجة مئوية) وبعد حوالي 5 دقائق، تحقق تحت المجهر إذا كانت الخلايا قد بدأ تفكك.
3. عندما قد خففت حوالي 50% الخلايا، بلطف ضرب قارورة الثقافة ضد اليد لتخفيف الخلايا المتبقية. لإلغاء تنشيط التربسين، إضافة 6 مل ربمي-1640 + 2% FBS (37 درجة مئوية) إلى قارورة الثقافة² 75 سم ثم نقل تعليق خلية لأنابيب 50 مل.
4. شطف قوارير الثقافة مع 3 مل من RPMI 1640 + 2% FBS وإضافة إلى أنابيب 50 مل. الطرد المركزي خلايا لمدة 10 دقيقة في 450 x ز في درجة حرارة الغرفة.
   1. ريسوسبيند الخلايا الأعلاف في 10 مل كسفم (37 درجة مئوية). عد الخلايا ونقل 3 × 10⁶ خلايا 150 سم² ثقافة قارورة جنبا إلى جنب مع 20 مل كسفم (37 درجة مئوية). بلطف يهز قارورة الثقافة لضمان التوزيع الموحد للخلايا. تجميد الخلايا عند الثقافة روافد 80-90 ٪، الذي يستغرق حوالي 4-6 أيام تبعاً لمعدل انتشار الخلايا الكيراتينيه (انظر القسم 3، تجميد البروتوكول أدناه). توسيع نطاق الخلايا الكيراتينيه لتوليد الأرصدة المجمدة المناسبة.

3-تجميد الخلايا الكيراتينيه

1. الحرارة المبلغ المناسب لحل يدتا التربسين 0.05% إلى 37 درجة مئوية في حاضنة. استخدام 9 مل من محلول يدتا التربسين 0.05% 150 سم² ثقافة قارورة.
2. إزالة المتوسطة من الخلايا، وإضافة² مل 9/150 سم الثقافة قارورة استعد قبل 0.05% يدتا التربسين حل للخلايا. ضع قارورة الثقافة في الحاضنة (37 درجة مئوية) وبعد حوالي 5 دقائق، تحقق تحت المجهر إذا كانت الخلايا قد بدأ تفكك.
3. عندما قد خففت حوالي 50% الخلايا، بلطف ضرب قارورة الثقافة ضد اليد من أجل تخفيف الخلايا المتبقية. لإلغاء تنشيط التربسين، إضافة 12 مل ربمي-1640 + 2% FBS (37 درجة مئوية) إلى قارورة الثقافة² 150 سم ثم نضح تعليق خلية لأنابيب 50 مل.
4. شطف قوارير الثقافة مع 6 مل من RPMI 1640 + 2% FBS وإضافة إلى أنابيب 50 مل. الطرد المركزي هذه الأنابيب لمدة 10 دقيقة في 450 غ س في 4 درجات مئوية. تعد الخلية المثلج تجميد المتوسطة (كسفم + 10% [دمس]).
5. ريسوسبيند بيليه الخلية في كسفم + 10% [دمس]، عد الخلايا، وتجميد الخلايا في كثافة 6 × 10⁶ خلايا/مل باستخدام أساليب تجميد تجميد بطيء القياسية¹².
6. تخزين الخلايا الكيراتينيه في النتروجين السائل (مرحلة البخار) حتى جاهزة للاستخدام.

4-ذوبان الجليد واستزراع الخلايا الكيراتينيه المجمدة

1. سرعة ذوبان الجليد القنينات المجمدة المناسبة في حمام مائي 37 درجة مئوية. استخدام الإيثانول 70% لتنظيف الجزء الخارجي من كريوفيال. نقل العدد المناسب من الخلايا (خلايا/سم تقريبا 15,000²) قارورة ثقافة وفورا إضافة النمو قبل حرارة متوسطة (كسفم) إلى قارورة الثقافة.
   ويمكن استخدام أي حجم من قوارير الثقافة تبعاً للإعداد للتجربة.
2. استخدام 5 مل الثقافة المتوسطة قارورة ثقافة 25 سم² .

وأضاف العدد الخلايا قارورة الثقافة قد تختلف نظراً لنمو الخلايا تختلف من مانح إلى. احتضان خلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 100% رطوبة و 5% CO₂.

تغير المتوسط بعد يومين وثلاث مرات أسبوعيا استخدام الطازجة كسفم المعالجون مسبقاً.
ملاحظة: البيانات المتوفرة لدينا قد أثبتت أن 95% الخلايا المعزولة ببروتوكول الموصوفة هنا إيجابية بالنسبة لل 14 سيتوكيراتيني keratinocyte ماركر¹³في المتوسط.

النتائج

تمايز المحطة الطرفية المستحثة بالكالسيوم
الكيراتينيه البشرية تخضع للتمايز المحطة الطرفية عند المعاملة بالكالسيوم^14،،من¹⁵¹⁶. الكيراتينيه البشرية الأولية كانت معزولة ومثقف كما هو موضح في البروتوكول أعلاه. عندما حفز الخلايا مع ا...

Discussion

هنا، نحن تصف كيفية عزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار بسهولة، وكيف أن الثقافة لهم في المختبر. هذا النموذج يمكن أن يكون أحد تطبيقات واسعة للتحقيق في بيولوجيا الخلايا البشرة، ويمكن أن يكون مفيداً للباحثين المهتمين بدراسة الأمراض الجلدية.

بعض المز?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
KSFM	ThermoFisher Scientific	17005-034	Cell culture medium
KSFM supplements	ThermoFisher Scientific	37000-015	Supplements for KSFM
DPBS	ThermoFisher Scientific	14190-144	DPBS without Calcium and Magnesium
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	Dimethyl sulfoxid
Gentamycin	ThermoFisher Scientific	15710-049	Cell culture medium additive
Sterilization filter	Sartorius	16534	Syringe filter with a pore size of 0.2 µm
Trypsin	Sigma-Aldrich	T7409	Used to trypsinize cells
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	-
RPMI-1640	ThermoFisher Scientific	61870-010	-
FBS	ThermoFisher Scientific	16000044	Used to inactivate trypsin
Forceps	-	-	Forceps from any company can be used
Scissors	-	-	Scissors from any company can be used
Scalpel	Swann Morton	0501	Scalpels from any company can be used
70% ethanol	-	-	-
Gauze pads	NOBAMED	875420	Gauze pads from any provider can be used
Foot planer	Credo Solingen	1510	Foot planer from any provider can be used
Petri dishes	TPP	93100	Petri dishes from any provider can be used
Metal filter	-	-	In-house 1 mm hole size metal filter
75 cm2 culture flasks	NUNC	156499	-
150 cm2 culture flasks	TTP	90151	-
0.05% Trypsin-EDTA solution	ThermoFisher Scientific	25300-062	Used to trypsinize cells when passaging