Oluşturma ve birincil insan lenfositi yetişkin cilt, kültür

Özet

İnsan derisi dış ortamda karşı savunma ilk satırı olarak davranır. Biz yetişkin cilt üzerinden birincil insan lenfositi izole bir yöntem mevcut. Bu izole lenfositi çok sayıda deneysel kurulumları yararlıdır ve kutanöz Biyoloji vitro. moleküler mekanizmalar çalışmak için son derece uygun bir model vardır

Özet

Keratinositler ana işlevi böylece dış dünya için mekanik bir engel Bakımı epidermis, yapısal bütünlüğünü sağlamaktır. Buna ek olarak, keratinositler hızlı, spesifik olmayan şekilde antijenik uyaranlara yanıt doğuştan gelen bağışıklık sisteminin bir bölümü olarak başlatma, bakım ve düzenleme epidermal bağışıklık yanıtı, temel bir rol oynar. Burada, biz birincil insan lenfositi yetişkin deri, izolasyon için bir iletişim kuralı tanımlamak ve bu hücreler farklılaşma işaret involucrin artan bir ifade göre ölçülen kalsiyum kaynaklı terminal farklılaşma yanıt göstermektedir. Buna ek olarak, izole lenfositi aktivasyonu p38 MAPK tarafından ölçülen duyarlı hücre içi sinyal yolları için IL-1β-indüklenen aktivasyonu olduğunu göstermektedir. Birlikte ele alındığında, yalıtım ve yetişkin cilt üzerinden birincil insan keratinositler, kültür için bir yöntem açıklanmaktadır. Lenfositi epidermis baskın hücre tipinde olduğu için bu moleküler mekanizmalar Kutanöz Biyoloji içinde vitroçalışma için yararlı bir yöntemdir.

Giriş

Deri insan vücudunun en büyük organı ve dış çevreye karşı koruyucu bir bariyer görevi görür. Deri iki ana katmandan oluşur: dermis ve epidermis nerede epidermis derinin en dış tabakası oluşturan,. Epidermisin en bol bulunan hücre türü hücre kitle^1,%295'den fazla oluşan lenfositi değil. Keratinositler farklılaşma epidermisin içinde çeşitli aşamalarında korunur ve farklılaşma³belirli aşamalarında karşılık Bazal, spinöz, taneli ve cornified katmanlar halinde düzenlenir. Keratinositler birincil işlevi böylece dış dünyaya sağlam bir bariyer üreten epidermis, yapısal bütünlüğünü sağlamaktır.

Keratinositler da deride patojenlere karşı savunma ilk satırı temsil eder ve bu nedenle doğuştan gelen bağışıklık yanıtı^4,5' te önemli bir rol oynamaktadır. Keratinositler pozlama dış uyaranlara karşı harekete geçirmek için hücre içi sinyal yolları ve daha sonra üretim, sitokinler, kemokinler ve antimikrobiyal peptidler gibi çeşitli inflamatuar aracılar birkaç açar. Bu keratinosit kaynaklı proteinler alımı ve dendritik hücreler, nötrofil ve belirli T hücreleri^6,7gibi bağışıklık hücreleri aktive tarafından inflamatuar yanıt olarak katılmak. Böylece, keratinositler çok sayıda biyolojik işlemlerinde çok önemli bir rol oynamak çünkü burada sunulan teknik arkasındaki mantığı deri Biyoloji çalışmaya bir vitro modeli oluşturmak için idi. Yenidoğan sünnet derisi elde edilen birincil keratinosit kültürler genellikle deri Biyoloji^8,9incelemek için kullanılır. Ancak, burada açıklanan tekniği ile lenfositi üzerinden her iki cinsiyette hücreleri daha yüksek bir biyolojik çeşitlilik sonucu elde edilir.

Burada, yalıtım ve yetişkin deri, birincil insan lenfositi nesil için detaylı bir protokolü keratinositler dondurma ve bakım dahil olmak üzere mevcut. Bu yöntem genel amacı Kutanöz Biyoloji içinde vitroçalışma için bir model olarak kullanılan birincil insan lenfositi üretmektir.

Protokol

Sağlıklı yetişkin gönüllü plastik cerrahisi uygulanan deri örnekleri koleksiyon ana bilgisayar kurumlarında etik kurul onayı gerektirir. Bu iletişim kuralı bölgesel Etik Komitesi, bölge Midtjylland tarafından Danimarka (M-20110027) kabul edildi. Burada açıklanan yöntemi Maciaq vd tarafından benzer çalışmalardan elde edilir ¹⁰ ve Liu ve Karasek¹¹.

1. insan deri lenfositi yalıtım

1. Başlatmak aşağıdaki çözümleri yaparak: 50 mL solüsyon % 0.25 tripsin ve % 0.1 glikoz DPBS içinde. Mix ve filtre (0.2 µm) çözüm sterilize. RPMI-1640 + % 2 FBS çözüm, DPBS ve keratinosit serum-Alerjik orta (KSFM) 50 mL 10 mL hazırlayın. KSFM takviyeleri ve 250 µL viomisin, 500 mL KSFM ekleyin. 37 ° C kullanmadan önce için çözümleri önceden ısıtmak.
2. Cilt sağlıklı yetişkin gönüllüler plastik cerrahisi uygulanan toplamak. Kullanılan deri örnekleri yaklaşık 10 cm x 15 cm, vardır ama boyutu değişebilir. Ulaşım altında deri serin deri örnekleri soğutma bir öğeyi içeren bir Styrofoam kutusu taşıma tarafından tutmak. Gerekirse, deri örneği 4 ° C'de gecede depolanabilir.
3. Steril makas, neşter ve forseps kullanarak cilt bölümü altında gelen yağ çıkarmak.
4. Cilt bölümü (yaklaşık 10 cm x 15 cm) steril bir kapak iğneleri kullanarak bir plaka üzerine toka. Önce Cilt Kuru steril gazlı bez pad ile temizleyin. Sonra deri % 70 etanol ile steril gazlı bez pad kullanarak temiz.
5. Bir ayak planer kullanarak, Cilt bölüm üst tabakası (epidermis) kesin ve bir 9 cm Petri kabına yerleştirin. O zaman, hemen 25 mL (1.1 adımda hazırlanan) DPBS/tripsin/glukoz çözeltisi Petri kabına ekleyin. 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
6. Bir pipet kullanarak DPBS/tripsin/glikoz çözüm Petri kabına kaldırın ve 10 mL RPMI-1640 + %2 FBS tripsin devre dışı bırakın ekleyin.
7. İki forseps kullanarak, şimdi epidermal hücrelerin orta yavaşça kazıma ve epidermal ve deri bölümleri dermal bölmesinin Tantanacı serbest.
8. Epidermal hücre süspansiyon bir metal filtre (1 mm delik boyutu) filtre ve bir 50 mL tüp içinde toplamak. RPMI-1640 FBS ve girdap olmadan 10 mL süspansiyon ile metal filtre epidermal hücre süspansiyon içeren bir 50 mL tüp içine 10 s. filtre içeren bir 50 mL tüp için geri kalan cilt bölümleri ekleyin. DPBS toplam hacmi 50 mL için ekleyin.
9. Hücre süspansiyon vasıl 450 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi.
10. Süpernatant kaldırmak ve epidermal hücre Pelet 37 ° C KSFM hücre Pelet boyutuna bağlı olarak yaklaşık 10 ml resuspend. Trypan boyama yöntemi mikroskop altında mavi kullanarak hücreleri saymak. Yaklaşık 50-100 x 10⁶ hücre hücre bir 10 cm x 15 cm cilt bölümünden elde edilen sayıdır. Her 75 cm² kültür şişesi için 8 x 10⁶ hücreleri ile birlikte 37 ° C KSFM 12 mL aktarın. Yavaşça hücrelerin tekdüze dağılım sağlamak için kültür şişeler sallamak.
11. %100 nem oranı ve % 5 CO₂37 ° C kuluçka lenfositi kuluçkaya. Orta 2 gün ve üç kez haftalık sonra değiştirin. Geçiş hücreleri lenfositi proliferasyon oranını bağlı olarak yaklaşık 2 hafta sürer % 70-80 birleşmesi kültürdür.

2. passaging keratinositler

1. Bir kuluçka 37 ° C'de % 0.05 tripsin-EDTA çözüm uygun miktarda ısı. 4.5 mL % 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi bir 75 cm² kültür şişesi için kullanın.
2. Orta hücrelerden kaldırın ve 4.5 mL/75 cm² kültür şişesi % 0.05 tripsin-EDTA çözüm hücrelere önceden ısınmış ekleyin. İnkübatör (37 ° C) kültür şişeye koyun ve hücreleri gevşeme başlattıysanız yaklaşık 5 dakika sonra mikroskop altında kontrol edin.
3. Hücreleri yaklaşık % 50'si gevşetti, hafifçe kalan hücreleri gevşetmek için el karşı kültür şişeye çarptı. Sonra tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için 75 cm² kültür şişesi için 6 mL RPMI-1640 + %2 FBS (37 ° C) ekleyin ve hücre süspansiyon 50 mL tüpler için transfer.
4. Kültür şişeler RPMI 1640 + %2 3 mL ile durulayın FBS ve 50 mL tüpler için ekleyin. Hücreler için 450 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi.
   1. KSFM (37 ° C) 10 mL pelleted hücrelerde resuspend. Hücreleri saymak ve 3 x 10⁶ hücreler bir 150 cm² kültür şişesi ile birlikte KSFM (37 ° C) 20 mL transfer. Yavaşça hücrelerin tekdüze dağılım sağlamak için kültür şişeyi sallayın. Kültür bağlı olarak (bkz: Bölüm 3, iletişim kuralı aşağıdaki buz gibi) lenfositi nükleer silahların yayılmasına karşı oranı yaklaşık 4-6 gün sürer % 80-90 birleşmesi olduğunda hücreleri dondur. Keratinositler uygun dondurulmuş hisse oluşturmak için genişletin.

3. lenfositi dondurulması

1. Bir kuluçka 37 ° C'de % 0.05 tripsin-EDTA çözüm uygun miktarda ısı. 9 mL % 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi 150 cm² kültür şişesi için kullanın.
2. Orta hücrelerden kaldırın ve 9 mL/150 cm² kültür şişesi % 0.05 tripsin-EDTA çözüm hücrelere önceden ısınmış ekleyin. İnkübatör (37 ° C) kültür şişeye koyun ve hücreleri gevşeme başlattıysanız yaklaşık 5 dakika sonra mikroskop altında kontrol edin.
3. Hücreleri yaklaşık % 50'si gevşetti, yavaşça kültür şişeye el karşı kalan hücreleri gevşetmek için çarptı. O zaman, tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için 150 cm² kültür şişesi için 12 mL RPMI-1640 + %2 FBS (37 ° C) ekleyin ve hücre süspansiyon 50 mL tüpler için Aspire edin.
4. Kültür şişeler RPMI 1640 + %2 6 mL ile durulayın FBS ve 50 mL tüpler için ekleyin. 450 x g 4 ° C'de 10 dakika için tüpler santrifüj kapasitesi Orta (KSFM + % 10 DMSO) soğuk buz gibi hücre hazırlayın.
5. Hücre Pelet KSFM + % 10 DMSO resuspend, hücreleri saymak ve hücreleri bir yoğunluk olarak 6 x 10⁶ hücre/mL standart yavaş dondurma dondurma yöntemleri¹²kullanarak, Don.
6. Keratinositler sıvı azot (Buhar fazı) kullanıma hazır kadar saklayın.

4. çözülme ve donmuş lenfositi kültür

1. Hızla bir 37 ° C su banyosu uygun dondurulmuş şişeleri çözülme. % 70 etanol cryovial dışını temizlemek için kullanın. Hücreleri (yaklaşık 15.000 hücreler/cm²) uygun sayıda bir kültür şişesi aktarmak ve hemen kültür şişeye Önceden ısıtılmış büyüme orta (KSFM) ekleyin.
   Kültür şişeler herhangi bir boyut deneme kurulumuna bağlı olarak kullanılabilir.
2. 5 mL kültür orta bir 25 cm² kültür şişesi için kullanın.

Hücre sayısı hücrelerinin büyümesini donör donör değiştiğinden kültür şişeye değişebilir eklendi. Hücreleri %100 nem oranı ve % 5 CO₂37 ° C kuluçka kuluçkaya.

Değişim orta 2 gün sonra ve üç kez haftalık taze Önceden ısıtılmış KSFM kullanarak.
Not: Bizim veri ortalama burada açıklanan protokol tarafından izole hücreler % 95'i keratinosit-marker cytokeratine-14¹³için olumlu olduğunu gösterdi.

Sonuçlar

Terminal farklılaşma kalsiyum kaynaklı
İnsan lenfositi terminal farklılaşma üzerine kalsiyum^14,15,16ile tedavi tabi. Birincil insan lenfositi izole ve yukarıdaki protokolünde açıklandığı gibi kültürlü. Ne zaman yaklaşık % 50-60 birleşmesi, hücreleri kalsiyum (1,2 mM) ile teşvik ya da araç ve hücreleri resimlerini 0, 1 ve 2 günde alınmıştır. Şekil 1 k...

Tartışmalar

Burada, kolayca yetişkin cilt üzerinden birincil insan lenfositi yalıtmak ve onları vitrokültür anlatan. Bu model epidermal hücre biyolojisi incelenmesi için geniş bir uygulama olabilir ve araştırmacılar Kutanöz hastalıkları okumak isteyen için yararlı olabilir.

Burada açıklanan protokol avantajları bir kısmı yeni doğan erkek sünnet geçiren elde yenidoğan sünnet derisi üzerinden izole lenfositi aksine yetişkin hastalarda birincil insan lenfositi hem erkek ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
KSFM	ThermoFisher Scientific	17005-034	Cell culture medium
KSFM supplements	ThermoFisher Scientific	37000-015	Supplements for KSFM
DPBS	ThermoFisher Scientific	14190-144	DPBS without Calcium and Magnesium
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	Dimethyl sulfoxid
Gentamycin	ThermoFisher Scientific	15710-049	Cell culture medium additive
Sterilization filter	Sartorius	16534	Syringe filter with a pore size of 0.2 µm
Trypsin	Sigma-Aldrich	T7409	Used to trypsinize cells
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	-
RPMI-1640	ThermoFisher Scientific	61870-010	-
FBS	ThermoFisher Scientific	16000044	Used to inactivate trypsin
Forceps	-	-	Forceps from any company can be used
Scissors	-	-	Scissors from any company can be used
Scalpel	Swann Morton	0501	Scalpels from any company can be used
70% ethanol	-	-	-
Gauze pads	NOBAMED	875420	Gauze pads from any provider can be used
Foot planer	Credo Solingen	1510	Foot planer from any provider can be used
Petri dishes	TPP	93100	Petri dishes from any provider can be used
Metal filter	-	-	In-house 1 mm hole size metal filter
75 cm2 culture flasks	NUNC	156499	-
150 cm2 culture flasks	TTP	90151	-
0.05% Trypsin-EDTA solution	ThermoFisher Scientific	25300-062	Used to trypsinize cells when passaging