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Method Article
A pele humana age como uma primeira linha de defesa contra o ambiente externo. Apresentamos um método para isolar os queratinócitos humanos primários da pele adulta. Estes queratinócitos isolados são úteis em inúmeras configurações experimentais e são um modelo altamente adequado para estudar os mecanismos moleculares em biologia cutânea em vitro.
A principal função dos queratinócitos é fornecer a integridade estrutural da epiderme, mantendo assim uma barreira mecânica ao mundo exterior. Além disso, os queratinócitos desempenham um papel essencial na iniciação, manutenção e regulamento de epidérmicos respostas imunes por ser parte do sistema imunológico inato, respondendo a estímulos antigênicos de forma rápida e não específica. Aqui, descrevemos um protocolo para isolamento de queratinócitos humanos primários da pele de adulto e demonstrar que estas células respondem à diferenciação terminal induzida por cálcio, como medido por um aumento da expressão da involucrin de marcador de diferenciação. Além disso, mostramos que os queratinócitos isolados são responsivos à IL-1 β-induzida por ativação de vias de sinalização intracelulares, medida pela ativação da via MAPK p38. Tomados em conjunto, descrevemos um método para isolamento e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele adulta. Porque os queratinócitos são o tipo de célula predominante na epiderme, este método é útil para estudar os mecanismos moleculares em biologia cutânea in vitro.
A pele é o maior órgão do corpo humano e serve como uma barreira protetora contra o ambiente externo. A pele é composta de duas camadas principais: a derme e epiderme, onde a epiderme constitui a camada mais externa da pele. O tipo mais abundante de células na epiderme é os queratinócitos que compreende mais de 95% da célula em massa1,2. Os queratinócitos são mantidos em vários estágios de diferenciação na epiderme e são organizados em camadas basais, espinhosos, granulares e cornificadas que correspondem às fases específicas de diferenciação3. A principal função dos queratinócitos é fornecer a integridade estrutural da epiderme, produzindo assim uma barreira intacta ao mundo exterior.
Os queratinócitos também representam a primeira linha de defesa contra patógenos na pele e, portanto, desempenham um papel importante na resposta imune inata4,5. Exposição dos queratinócitos a estímulos externos leva à ativação das vias de sinalização intracelulares e, posteriormente, a produção de um número de vários mediadores inflamatórios, incluindo citocinas, quimiocinas e peptídeos antimicrobianos. Estas proteínas derivadas de queratinócitos participarem na resposta inflamatória, recrutamento e ativação de células imunes como específico T células6,7, neutrófilos e células dendríticas. Assim, porque os queratinócitos desempenham um papel crucial em inúmeros processos biológicos, a lógica por trás da técnica apresentada aqui foi gerar um modelo in vitro para estudar a biologia da pele. Culturas de queratinócitos primários obtidas de prepúcio neonatal são frequentemente utilizadas para estudar pele biologia8,9. No entanto, com a técnica descrita aqui, queratinócitos de ambos os sexos são obtidos resultando em uma maior diversidade biológica das células.
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o isolamento e a geração de queratinócitos humanos primários da pele de adulto, incluindo manutenção e congelamento de queratinócitos. O objetivo geral deste método é gerar queratinócitos humanos primários que podem ser usados como um modelo para estudar Biologia cutânea in vitro.
A coleta de amostras de pele de voluntários adultos saudáveis, submetidos à cirurgia plástica requer aprovação do Comitê de ética das instituições de acolhimento. Este protocolo foi aprovado pelo Regional éticas Comitê da região Midtjylland, Dinamarca (M-20110027). O método descrito aqui é derivado de estudos semelhantes por Maciaq et al . 10 e Liu e Karasek11.
1. isolamento de queratinócitos da pele humana
2. passagem de queratinócitos
3. congelamento dos queratinócitos
4. descongelar e cultivo queratinócitos congelados
Diferenciação Terminal induzida por cálcio
Queratinócitos humanos passam por diferenciação terminal após tratamento com cálcio14,15,16. Queratinócitos humanos primários foram isolados e cultivados conforme descrito no protocolo acima. Quando aproximadamente 50-60% de confluencia, as células foram estimuladas com cálcio (1.2 mM) ou veículo e fotos das células foram tiradas no dia 0, 1 e 2.
Aqui, descrevemos como isolar facilmente queratinócitos humanos primários da pele adulta e como a cultura deles em vitro. Este modelo pode ter uma aplicação ampla para a investigação da biologia das células epidérmicas e pode ser útil para pesquisadores interessados no estudo de doenças cutâneas.
Algumas das vantagens do protocolo descrito aqui é que, em contraste com os queratinócitos isolados do prepúcio neonatal obtido de recém-nascido machos submetidos à circuncis?...
. O autor não tem nenhum conflito de interesses.
O autor deseja agradecer a Annette Blak Rasmussen e Kristine Moeller para seu suporte técnico
Name | Company | Catalog Number | Comments |
KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | - |
RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | - |
FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
Forceps | - | - | Forceps from any company can be used |
Scissors | - | - | Scissors from any company can be used |
Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
70% ethanol | - | - | - |
Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
Metal filter | - | - | In-house 1 mm hole size metal filter |
75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | - |
150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | - |
0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
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