إعداد شرائح الشبكية الطازجة من الزرد الكبار السابقين فيفو التصوير تجارب

Summary

التصوير نسيج الشبكية يمكن أن توفر معلومات الخلايا المفردة التي لا يمكن جمعها من الطرق الكيميائية الحيوية التقليدية. ويصف هذا البروتوكول إعداد الشرائح الشبكية من الزرد لتصوير [كنفوكل]. فلوري وراثيا ترميز أجهزة الاستشعار أو الأصباغ مؤشر يسمح التصور للعديد من العمليات البيولوجية في أنواع مختلفة من الخلايا الشبكية.

Abstract

شبكية العين هي نسيج معقد يبدأ ويدمج الخطوات الأولى للرؤية. الخلل الوظيفي للخلايا الشبكية سمة مميزة للكثير من الأمراض المسببة للعمى، والعلاجات المستقبل يتوقف على التفاهمات الأساسية حول كيفية مختلفة الشبكية خلايا تعمل بشكل طبيعي. قد ثبتت صعوبة الحصول على مثل هذه المعلومات مع أساليب الكيمياء الحيوية نظراً لأن هي تناقص المساهمات لأنواع معينة من الخلايا في الوسط الخلية الشبكية. تصوير الشبكية حية يمكن أن توفر طريقة عرض للعديد من العمليات البيولوجية على المستوى سوبسيلولار، بفضل عدد متزايد من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية الفلورسنت وراثيا المرمزة. ومع ذلك، هذه التقنية كانت حتى الآن محدودة للضفادع الصغيرة واليرقات الزرد، طبقات الشبكية الأبعد من شبكية العين المعزولة، أو تصوير القرار أقل من شبكية العين في الحيوانات الحية. هنا نقدم طريقة لتوليد يعيش السابقين فيفو الشرائح الشبكية من الزرد الكبار لتصوير مباشر عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل]. هذا الإعداد غلة شرائح عرضية مع جميع طبقات الشبكية، ومعظم أنواع الخلايا المرئية لأداء تجارب التصوير [كنفوكل] استخدام التروية. إذ تعرب عن بروتينات الفلورسنت الزرد المحورة وراثيا أو أجهزة استشعار العوامل البيولوجية في أنواع محددة من الخلايا الشبكية أو العضيات تستخدم لاستخراج المعلومات خلية واحدة من شبكية سليمة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحميل الشرائح الشبكية مع الأصباغ الفلورية المؤشر، إضافة إلى براعة في الأسلوب. تم تطوير هذا البروتوكول للتصوير Ca^{2 +} داخل photoreceptors مخروط الزرد، ولكن بعلامات مناسبة فإنه يمكن تكييفها لقياس Ca^{2 +} أو نواتج الأيض في الخلايا أو الخلايا الأفقية والقطبين، microglia، الخلايا أماكريني أو الشبكية مولر خلايا العقدة. تتم إزالة ظهارة صباغ الشبكية من شرائح حتى هذه الطريقة ليست مناسبة لدراسة هذا النوع من الخلايا. مع الممارسة، من الممكن لإنشاء شرائح المسلسل من الحيوان واحدة لتجارب متعددة. يوفر هذا الأسلوب يمكن تكييفها أداة قوية للرد على العديد من الأسئلة حول بيولوجيا الخلايا الشبكية، Ca^{2 +}والتوازن الطاقة.

Introduction

الزرد (دانيو rerio) أصبحت تستخدم على نطاق واسع في البحوث العلمية الطبية والأساسية¹، نظراً لصغر حجمه، والتطور السريع ونظم الجهاز الفقاريات. الشفافية الطبيعية يرقات الزرد جنبا إلى جنب مع الأساليب المتبعة ترانسجينيسيس مكنت التصور تفصيلية للعمليات الخلوية في الحيوانات حية. استهدفت عددا من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية الفلورسنت وراثيا المرمزة إلى خلايا محددة الزرد للكشف عن Ca^{2 + 2}، وفوق أكسيد الهيدروجين³، أبوبتوتيك التنشيط⁴ و ATP⁵.

في فيفو تصوير يرقات الزرد أدى إلى اختراقات في مجال علم الأعصاب، بما في ذلك رسم خرائط للدماغ الدوائر⁶ وتطوير العقاقير للجهاز العصبي المركزي واضطرابات⁷. الزرد أيضا مناسبة للرؤية للبحث نظراً لأن ميزة شبكية العين على بنية طبقية وأنواع الخلايا العصبية للفقاريات العليا، وأنها عرض السلوكيات بصرية قوية^8،9. تم بنجاح على غرار عدة أنواع من تنكسات الشبكية مماثلة للأمراض البشرية ودرس في الزرد^10،11، بما في ذلك التصوير الحي من photoreceptors حدة التدهور داخل شبكية^{2، 12}.

بينما في فيفو تصوير الزرد اليرقات أداة قيمة، فإنه يصبح أكثر صعوبة كما الأسماك تنمو وتتطور تصبغ، وبعض العلاجات الدوائية لا تتخلل حيوان كامل. علاوة على ذلك، تغيير بعض العمليات الخلوية مع التنمية، والعمر، مما يجعل لاحق الوقت النقاط الحرجة للدالة التفاهم وتطور المرض في الحيوانات الكبار. أساليب الكيمياء الحيوية مثل إيمونوبلوت، كوانتيتياتيفي بكر واستهلاك₂ س وتحليلات metabolomic يمكن أن توفر أدلة هامة حول علم الأحياء الشبكية ككل، ولكن من الصعب أن نتبين إسهامات أنواع الخلايا الفردية تتأثر المرض. التصوير نسيج الشبكية معزولة السابقين فيفو يتجاوز هذه القضايا، وحين التصوير شقة المحملة شبكية العين يتيح عرض شبكية العين الخارجي¹³، يتم حجب ميزات الشبكية الداخلية أعمق. شرائح عرضية الشبكية، مثل تلك التي قدمت في ثابت تحليلات المناعي، تمكين رؤية واضحة لجميع الطبقات وأنواع الخلايا ولكن لا تقدم سوى لقطة واحدة من العمليات الديناميكية التي ينطوي عليها وظيفة طبيعية والمرض.

نقدم هنا، وسيلة لتوليد السابقين فيفو عرضية الشرائح الشبكية من الزرد الكبار للتصوير. ومشابه لأساليب لإعداد الشرائح الشبكية البرمائية والزرد للدراسات الكهربية والمورفولوجية^14،15، مع تعديلات هامة للفاصل الزمني التصوير السابقين فيفو استخدام [كنفوكل] الفحص المجهري. وتراقب الردود الأسفار من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية أو الصبغات في شرائح في الوقت الحقيقي مع مجهر [كنفوكل] بينما كان يلقي وكلاء الدوائية باستخدام التروية. بينما وضعت الطريقة للتصوير فوتوريسيبتورس، قد يكون من الممكن استخدامها لتصور الخلايا أو الخلايا ثنائية القطب، أفقي من الخلايا، الخلايا أماكريني أو خلايا الشبكية العقدة مولر مع علامات مضيئة مناسبة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحميل الشرائح مع الفلورية الأصباغ نفاذية الخلية لتقرير جدوى الخلية أو النقل حويصلية، الوظيفة المتقدرية أو حالة الأكسدة والاختزال. يسمح هذا الإعداد تنوعاً تصور طائفة واسعة من العمليات سوبسيلولار في جميع أنحاء الشبكية، بما في ذلك Ca^{2 +} ديناميات وتوصيل الإشارة والدولة الأيضية.

Protocol

ووافقت جامعة واشنطن رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة جميع التجارب على الحيوانات.

1. إعداد الحيوانات والمعدات

ملاحظة: ظهارة صباغ الشبكية (RPE) هو ورقة الظلام من الأنسجة المحيطة بالجزء الخارجي الشبكية يمكن أن يحجب ملامح الشبكية التي تصبغ وتلف الأنسجة عند [كنفوكل] التصوير فيفو السابقين. في الظلام، وهو تراجع عن RPE الزرد بعيداً عن الشبكية؛ الظلام تكيف الأسماك لتسهيل إزالة RPE من الشبكية المقبلة قبل تشريح وتصوير.

1. نقل الأسماك إلى خزان التفريخ مليئة بأسماك المياه، ثم التفاف خزان التفريخ مع النسيج المظلم أو وضعه في خزانة مظلمة.
   1. الظلام تكييف الزرد على الأقل 1 ح قبل القتل الرحيم للسماح بالقرب من الفصل الكامل RPE من الشبكية. التكيف مع الظلام 30 دقيقة كافية لإزالة معظم RPE، على الرغم من أن أجزاء منها قد تبقى المقحم بين photoreceptors.
2. تذوب ~ 15 مل البترول جيلي في كوب 50 مل على لوحة الساخن ومن ثم رسم 3 مل السائل في محقن تلميح 3 مل زلة. عكس المحاقن، ضع في أنبوبة الاختبار رف، وتسمح فازلين لتبرد.
3. جعل دائرة تشريح القابل لإعادة الاستخدام على شريحة مجهر عادي 7 × 2.5 سم.
   1. استخدام طلاء الأظافر واضحة، خطوط الطلاء الضيقة لإنشاء مستطيل 3 × 2.5 سم في وسط الشريحة، السماح لتجف ثم قم بإضافة طبقة أخرى من طلاء الأظافر إلى الخطوط.
4. إعداد سلالم التصوير في كشوف غطاء لعقد الشرائح أثناء التصوير. وسوف تشكل الشرائح "الدرجات" في السلم.
   1. لالتقاط الصور الثابتة أو تجارب حقن مع تدفق حل الحد الأدنى، جعل سلالم فازلين تتألف من الشريطين شقة واسعة موازية من فازلين على كشوف غطاء زجاج مربعة 18 ملم. استخدام المحاقن لتطبيق اثنين بالأرض ~ 1 سم مسحات طويلة لتبريد فازلين 0.5 سم بعيداً في كشف الغطاء.
5. وعلى استعداد تقطيع اللحم والأنسجة.
   1. تنظيف شفرة حلاقة حافة مزدوجة مع الإيثانول والسماح للهواء الجاف. قطع عليه إلى أرباع مع مقص، أولاً طوليا إلى نصفين، ثم عبر كل شفرة.
   2. مكان قاعة تشريح في مرحلة تقطيع الأنسجة وأنها مركز أفقياً على المسرح ووضع علامة على حافة طويلة مع علامة دائمة للمحاذاة.
   3. تحميل مقطع شفرة على ذراع تقطيع اللحم والأنسجة، وضمان تكمن الشفرة مسطحة، وتركزت على الشريحة دون لمس طلاء الأظافر، ثم تشديد جهاز شفرة برفق. انخفاض تشغيل الذراع شفرة عن طريق ضبط مقبض ¼، المكان ثم قطع قصاصة ورق التصفية في مركز دائرة التصوير والاختبار. في حالة عدم قطع الورق الكامل من خلال، قم بإعادة تحميل الشفرة.
6. استخدام المحاقن، ضع نقطة صغيرة واحدة لتبريد فازلين في طبق بتري 10 سم ~ 1.5 سم على يمين الوسط. اضغط سلم تصوير في ذلك استخدام الملقط مع فازلين مواجهة. جعل آخر صغير فازلين دوت ~ 1 سم من حافة مدخل قاعة التصوير.
7. وتناسب المحاقن فازلين مع إبرة ز 20 زجاجتين. اضغط الإبرة على المحاقن واستخدامها لجعل اثنين 1 سم شرائط متوازية طويلة رقيقة من فازلين طوليا في وسط الغرفة تشريح. مساحة الشرائط ~ 1 سم عن بعضها البعض.
8. جعل أداة حلقة عين أسلاك قابلة لإعادة الاستخدام بالتفاف وسط ~ الجزء 4 سم من سلك التنغستن ز 30 حول زوج من إغلاق الملقط مرة محكم. ضبط قطر الحلقة بانزلاق السلك أعلى أو لأسفل الملقط حتى أنها أكبر قليلاً من عين الزرد، عادة ~ 2-3 ملم. تويست نهايات الأسلاك وأمن لهم في نهاية عصا خشبية 6-سم باستخدام شريط المختبر.
9. إعداد حل للمسابقة.
   1. ذوبان الجليد 50 س الحل الأسهم الملحق (الجدول 1) وإضافة جديدة لحل المسابقة حبيس مخزنة، غير بيكربونات (الجدول 2) صباح يوم التجربة؛ تمييع 200 ميليلتر لتكملة الحل الأسهم في كل 10 مل من الحل للمسابقة في أنبوب الطرد المركزي مخروطية أو زجاجة معقمة. لتجارب التصوير ثابتة، إعداد على الأقل 30 مل من محلول في المسابقة لكل تجربة. حجم الحل في المسابقة في حاجة لتجارب نضح سيتوقف على معدل التدفق ووقت التجربة الكلية.
   2. تأكد أن الرقم الهيدروجيني للحل الذي استكمله 7.4 باستخدام مسبار درجة الحموضة الرقمي أو ورقة الأس الهيدروجيني وضبط تبعاً لذلك مع تمييع هيدروكسيد الصوديوم أو HCl.
   3. الأوكسجين الحل تستكمل المسابقة على الجليد بالسطح مع غاز الأكسجين 100% لمدة 5 دقائق على الأقل باستخدام صهريج الأوكسجين الطبي القياسية ومنظم مزودة بخرطوم مياه، أو المتشعبة bubbler الغاز اختياري يستخدم التروية. تخزين حل اﻷوكسيجين المسابقة على الجليد في أنبوب الطرد المركزي المخروطية مختومة أو زجاجة معقمة قرب مجهر التشريح؛ استخدام هذا الحل للتشريح، التصوير، وتمييع الأصباغ أو وكلاء الدوائية.
   4. إذا الحلول الأخرى المستخدمة في التجربة، مثل Na⁺--مجانية الحل للمسابقة (الجدول 3)، كرر الخطوات 1.9.1.-1.9.3.
10. جمع أطباق بيتري والملقط، والمقص الصغير وأدوات أخرى قرب مجهر التشريح، وإعداد حمام جليد المياه أسماك الزرد القتل الرحيم.

2-إعداد الشرائح الشبكية (انظر الشكل 1)

1. العامل تحت الحمراء الضوء المحيط للتقليل من التكيف مع الضوء (التي يمكن أن تجعل العصا RPE أكثر أحكاما لشبكية العين)، euthanize الزرد بالانغماس في حمام الثلج حتى استجابة اللمس يتم فقدان، عادة نقل السمك إلى طبق بتري 1-2 دقيقة واستخدام مشرط إلى سيرفيكالي انخﻻع لكن لا قطع رأس السمكة.
2. استخدم حلقة الأسلاك لترخي النسيج الضام حول عين واحدة، وثم سحب العين إلى الأمام برفق مع الحلقة في يد واحدة. باستخدام المقص الصغير في اليد الأخرى، قطع العصب البصري الأبيض تحت العين، مع الحرص على عدم قطع الجزء الخلفي العين.
3. نقل العين باستخدام الملقط إلى طبق بتري حل الباردة المسابقة على الجليد، وكرر للعين الثانية. تبقى العيون في الظلام أو تحت الضوء الأحمر حتى تتم إزالة RPE من الشبكية.
4. تشريح eyecups تحت مجهر تشريح طاقة منخفضة في قطره حل الباردة المسابقة على شريحة زجاج عادي في طبق بتري.
   1. بيرس القرنية مع الملقط غرامة، ثم إزالة القطع واضحة، بلطف القرنية هش والصلبة فضي مع الملقط أو المقص. إزالة وتجاهل العدسة ومعظم الصلبة العينية (انظر الشكل 1A)، والتعامل مع فنجان العين معزولة في الحد الأدنى.
   2. يمكن أن تظل متمسكة بفنجان العين قطعة من الدهون، وقطع صغيرة من الصلبة، وأسود RPE وإزالتها من الشبكية في وقت لاحق. إذا كان يفصل الشبكية من RPE في خطوة 2.4.1، المضي قدما في نفس الخطوات باستخدام الحذر لا إلى تلف الشبكية المعزولة حساسة.
   3. موقف الجانب فنجان العين المفتوحة إلى أسفل (RPE أعلى) على الشريحة، ويقتطع من الثلثين أو الأرباع بشفرة حلاقة حافة واحدة جديدة في اقتراح واحد (انظر الشكل 1B). تجاهل قطع الأنسجة التي عالية مقوسة.
5. جبل مسطح الشبكية على ورق الترشيح.
   1. الرطب قطعة من ورق الترشيح مع الحل للمسابقة ووضعه على الشريحة بجوار قطعة فنجان العين. استخدام الملقط شقة عند التعامل مع ورقة تصفية الرطب سليمة لتجنب ثقب عليه. إضافة حل الباردة المسابقة لتشمل كلا من ورق الترشيح والأنسجة.
   2. استخدام الملقط في كل ناحية، بعناية سحب الورقة تصفية تحت كل قطعة فنجان العين مع RPE و photoreceptors التي تواجه أعلى، أي مع الجزء الخلفي العين مواجهة. ضع القطع فنجان العين في خط واحد على طول وسط ورق الترشيح (انظر الشكل 1). التعامل مع القطع فنجان العين بلطف بالملقط غرامة فقط قرب الحافة أو الركن.
   3. لمساعدة شبكية العين التمسك بورق الترشيح، وضع ورقة تصفية الرطب على منشفة ورقية جافة 3 s الفتيل الرطوبة إلى الأسفل، ولكن لا تدع الأنسجة تصبح جافة. كرر حتى القطع فنجان العين تقع الشقة على ورق الترشيح. تطبيق الشفط لطيف على الجانب السفلي الورقة تصفية يساعد على شد الشبكية، ولكن هذه الخطوة غير ضرورية.
6. إذا بقيت أوراق سوداء من RPE على القطع فنجان العين، استخدم الملقط غرامة للطف قشر بعيداً بدءاً من أحد الزاوية (انظر الشكل 1) بينما يجلس الأنسجة في قطره الحل في المسابقة. وينبغي رفع الشبكية قبالة ورق الترشيح، كرر الخطوة فتل في 2.5.3. قد تظهر الشبكية الوردي بسبب أصباغ بصرية غير مقصور.
7. كرر تشريح الشبكية ومسطحة تصاعد الخطوات في 2.4-2.6 للعين الثانية، إذا رغبت، في إبقاء الشبكية المسطحة التي شنت أول منغمسين في حل البارد الجرس. تبسيط إجراء تشريح، ويمكن وضع القطع من كلا شبكية العين على الورق مرشح واحد. مرة واحدة قد أزيلت RPE، البروتوكول يمكن أن تنفذ تحت ضوء الغرفة العادي ما لم يستلزم تجارب الظلام.
8. ضع ورق الترشيح على شريحة وتقليم إلى مستطيل مع شفرة حلاقة حافة واحدة، تاركاً ~ 0.5 سم ورق الترشيح على جانبي خط شبكية العين. نقل أوراق الترشيح إلى قاعة تشريح المعدة ودفع حواف طويلة تصفية الورق في خطوط رقيقة فازلين باستخدام الملقط، وتزج شبكية العين في 3-4 قطرات حل البارد الجرس.
   ملاحظة: بعض الصبغات، مثل الأصباغ محبتين، هي أفضل تحميلها في شقة يتصاعد في هذه المرحلة قبل التقطيع. وهذه يمكن تحميلها، والاشرار بعيداً مع أنسجة، وغسلها في قاعة تشريح. على سبيل المثال، الخلية ج¹² بوديبي 558/568 مكثف بقع الشبكية الأغشية ومستقبله الجزء الخارجي (انظر الشكل 4A) عند تحميل في ~ 5 ميكروغرام/مل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (عادة من 23-27 درجة مئوية) وتليها يغسل في الحل في المسابقة الزائدة .
9. نقل قاعة تشريح لمرحلة تقطيع اللحم والأنسجة وضع الحافة الطويلة على طول خط ملحوظ آمنة الدائرة تنتهي إلى المرحلة مع الشريط المختبر. ابتداء من نهاية واحدة، قص الشبكية وتصفية الورق باستخدام الضغط الثابت، ولطيف على تشريح الذراع. الشيك الذي تم قص الشريحة الأولى تماما، ثم استخدم الميكرومتر لقطع ~ 400 ميكرون شرائح.
10. تجميع سلم التصوير.
    1. سلم مكان قاعة تشريح مع شرائح المقاطع الشبكية في طبق بتري من الخطوة 1.7 المتاخمة للتصوير (انظر الشكل 1E). ملء الطبق مع الحل الباردة المسابقة إلى غمر محتوياته.
    2. استخدام الملقط وحفظ الشرائح المغمورة، بلطف نقل شرائط من ورق الترشيح والشبكية للسلم بانزلاق طبق بيتري من اليسار إلى اليمين. الحرص على عدم لمس شبكية العين مباشرة. تدوير الشرائح من 90° ودفن حواف الورقة عامل التصفية في فازلين.
    3. ضع الشرائح الشبكية ناعما في السلم مع الملقط حتى تكون مرئية بوضوح تحت المجهر تشريح طبقات الشبكية (انظر الشكل 1). للشرائح في نهاية كل من السلم، ضمان أن تواجه الأنسجة إلى الداخل تجاه الشرائح الأخرى لتقليل الحركة للأنسجة أثناء الحقن أو التدفق. تجاهل أي الشرائح الشبكية التي ليست كذلك التقيد بورق الترشيح (انظر الشكل 2 أ).
11. إذا رغبت في ذلك، تحميل الأصباغ إلى شرائح الشبكية في هذه المرحلة وتغسل في حل الزائدة المسابقة قبل التصوير.
    ملاحظة: يوديد Propidium (PI) وهويشت 33342 قوة وصمة عار النوى الميت وكافة الخلايا، على التوالي (انظر الشكل 2)، عندما المحتضنة مع الشرائح الشبكية في 5 ميكروغرام/مل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تيتراميثيلرهوداميني (تمرم) يتراكم في الميتوكوندريا ريسبيرينج بنشاط في جميع أنحاء الشبكية عند المحتضنة في 1 نانومتر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
12. بينما يتم تلوين الشرائح، يعد جهاز التصوير الدائرة والحقن. استخدام المحاقن لتدفق الأنابيب مع الحل للمسابقة وتطهير فقاعات، وإرفاق نهاية مفتوحة الأنابيب إلى مدخل غرفة التصوير وإغلاق محبس الحنفية. إزالة المحاقن وملء مع reagent(s) للحقن، ثم إرفاقه بالأنابيب.
13. استخدام الملقط لنقل ساترة مع الشرائح الشبكية إلى غرفة التصوير، الضغط ساترة إلى نقطة هلام البترول قرب حافة مدخل قاعة التصوير (انظر الشكل 1 ح). ملء قاعة التصوير مع الحل للمسابقة لتغطية شرائح.

3-تصوير الشرائح الشبكية

1. مكان قاعة التصوير شغلها مع جهاز حقن متصلة على المسرح مجهر [كنفوكل] تستقيم مزودة بمياه X 20 أو 40 غمس العدسة. تأمين قاعة التصوير مع مقاطع المرحلة.
2. انخفاض العدسة غمس على السلم، والتركيز على شريحة في نهاية واحدة من السلم تحت ضوء خافت مضيئة عبر. فحص كل شريحة للتوجه عرضية، ووجود قطاعات الخارجي مستقبله، والتصاق آمنة لورق الترشيح.
3. قم بتحديد الشريحة أفضل للتصوير بمرور الوقت وتكوين برنامج المجهر للحصول على الصور انقضاء الوقت. ويوجز الجدول 4 إعدادات التصوير نموذجية لعلامات مضيئة والأصباغ المختلفة.
   ملاحظة: معدل اقتناء الصورة ستختلف المجهر، marker(s) الفلورسنت، والعملية البيولوجية التي تجري دراستها. على سبيل المثال، استخدام دقة 800 × 800 بكسل وسرعة المسح الضوئي المايكروثانيه بيكسل 2 معدل إطارات 10-s للتصوير ديناميات الكالسيوم في فوتوريسيبتورس مع GCaMP3 وصبغة حمراء.
   1. إذا كان متوفراً، استخدام البرمجيات لتتبع المعالم المادية في الشريحة (شرائح الخارجي مستقبله، الهيئات الخلية، نوى) للمساعدة في إعادة توجيه المحتملة أثناء الفاصل الزمني. أيضا إعداد البرنامج لرصد الأسفار في الوقت الحقيقي عبر الشريحة.
4. البدء بتصوير ورصد خط الأساس الأسفار. عندما تستقر الأسفار عبر الشريحة (عادة خلال 2-5 دقائق)، المضي قدما في التجربة. للحقن، فتح محبس الحنفية حقنه، ثم ببطء كساد ورسم مرة أخرى على المكبس مرتين للمعونة الاختلاط.
   ملاحظة: على سبيل المثال، إلغاء الوظيفة المتقدرية بالحقن حل مركزة من بروتونوفوري ااحد التوصل إلى تركيز نهائي من 1 ميكرومتر في قاعة التصوير. وهذا يدفع قوي Ca^{2 +} انفجار في سيتوسول مستقبله عنها جكامب، ثم انخفاض مطرد في غشاء الميتوكوندريا المحتملة عنها تمرم.
5. عن كثب رصد الشرائح من الانجراف خلال التجربة، واستخدام البرامج لإجراء التعديلات الصغيرة وفقا للمعالم المادية. عادة الانجراف في الاتجاه-Z أثناء الحقن أو نضح < 5 ميكرومتر.

4-تصوير الشرائح الشبكية خلال تجارب التروية فيها تغيير الحلول أو تتدفق باستمرار

ملاحظة: التصوير الشبكية شرائح أثناء تجارب التروية حيث يتم تغيير الحلول أو تتدفق باستمرار هي مشابهة للإعداد لتجارب التصوير أو حقن ثابتة، مع إدخال التعديلات التالية.

1. بدلاً من سلالم فازلين هو موضح في الخطوة 1، 4، استخدام سلالم الشمع أكثر ثباتا لعقد الشرائح الشبكية ثابت أثناء تدفق الحل.
   1. ضع اثنان اسطوانات متوازية صغيرة من الشمع الأسنان النكهة ~ 0.5 سم بعيداً عن ساترة. على سطح مستو، استخدام إبهام للضغط على كل اسطوانة السقوط والخروج نحو حافة موازية ساترة. نقاط على حد سواء (انظر الشكل 1E، الجانب الأيمن) ثم مسحه اسطوانات مسطح أفقياً مع ساترة #1 طبقة رقيقة من الفازلين بين الشمعية مع ملعقة.
   2. عند تجميع سلم التصوير في خطوة 2.10.2، اضغط على حواف شرائح ورق الترشيح إلى عشرات الشمع باستخدام الملقط غرامة (الشكل 1).
2. لإعداد التروية في الخطوة 2، 12، ملء الخزانات المحاقن مع حلول بريوكسيجيناتيد، أو استخدام المشعب الغاز الاختياري للحلول في كل خزان الأوكسجين. مسح جميع الأنابيب مع الحل للمسابقة، وضمان تدفق جميع خطوط عند فتح وإزالة فقاعات كبيرة.
3. قبل ملء قاعة التصوير في الخطوة 2، 13، استخدام المحاقن لمكان آخر نقطة هلام البترول أكثر من كل زاوية مكشوفة ساترة للحيلولة دون انزلاق جانبياً أثناء التدفق.
4. عندما تملأ قاعة التصوير والتي شنت على مرحلة مجهر، قم بتشغيل المضخة وتوصيل أنابيب المضخة. اختبار تدفق الحل المسابقة واستخدام ميكروبوسيتيونير أن يوضع أنبوب المضخة على الدائرة إلى الخارج حيث أن كميات صغيرة من السائل يتم رسمها قبل تجاوزات الدائرة (عادة ~ 1 مم فوق سطح الحل لمعدل تدفق 2 مل/دقيقة). يبقى الحل في المسابقة المتدفقة أثناء تحديد الشرائح في الخطوة 3.4.
5. لإجراء هذه التجربة في الخطوة 3.4 التروية، التبديل تدفق الحلول عن طريق إغلاق محبس الحنفية الحل الأول أثناء فتح للحل الثاني.
   1. على سبيل المثال، إلى استنزاف خارج الخلية نا⁺ من دائرة التصوير، استخدم خزانان حقنه مليئة بالمسابقة للحل أو Na⁺--مجاناً الحل (الجدول 3). تدفق الحل في المسابقة لإنشاء خط الأساس، ثم قم بالتبديل إلى نا⁺--مجاناً الحل. هذه النتائج في كاليفورنيا سيتوسوليك كبير^{2 +} زيادات في قطاعات الخارجي مستقبله وهيئات الخلايا (انظر الشكل 4).
6. لنظم نضح الجاذبية، ورصد مستوى الحل في كل خزان ولذلك معدل التدفق المستمر أثناء التصوير. أعلى قبالة الخزانات حسب الحاجة مع حلول اﻷوكسيجين، أو الحفاظ على الأوكسجين المستمر محتدما مع مشعب غاز.

النتائج

مستقرة لتحديد المواقع واتجاه شرائح عرضية هي المفتاح لتصوير ناجحة مع حقن أو نضح من وكلاء الدوائية. بعناية دراسة وتغيير موضع الشرائح قبل تصوير [كنفوكل] حسب الحاجة لضمان جميع طبقات الشبكية هي مرئية (الشكل 2A، شريحة الثاني). إذا كان يتم تدوير شريحة قليلاً إلى ا?...

Discussion

السابقين فيفو تصوير الشرائح الشبكية الزرد الطازجة وقد ثبت أن تكون أداة متعددة الاستخدامات لدراسة علم الأحياء^20،،من²¹²²، وهي فريدة من نوعها في ذلك فإنه يمكن تحليل الخلايا المفردة في ناضجة، تماما الشبكية المتباينة. مع الممارسة، من المم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
zebrafish	Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility		stocks maintained in-house as stable transgenic lines
petroleum jelly	Fisher Scientific	19-090-843	for petroleum jelly syringe
3-mL slip tip syringe	Fisher Scientific	14-823-436	for petroleum jelly syringe
20g 3.8 cm slip tip needle	Fisher Scientific	14-826-5B	for petroleum jelly syringe
plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide	Fisher Scientific	12-550-A3	for eyecup dissection, slicing chamber
Seche Vite clear nail polish	Amazon	B00150LT40	for slicing chamber
18 mm X 18 mm #1 glass coverslips	Fisher Scientific	12-542A	for imaging ladders
unflavored dental wax	Amazon	B01K8WNL5A	for imaging ladders
double edge razor blades	Stoelting	51427	for tissue slicing
tissue slicer with digital micrometer	Stoelting	51415	for tissue slicing
filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size	EMD Millipore	HAWG01300	filter paper for mounting retinas
10 cm petri dish	Fisher Scientific	FB0875712	for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly
15 cm plain-tipped wood applicator stick	Fisher Scientific	23-400-112	for wire eye loop tool
30g (0.25 mm diameter) tungsten wire	Fisher Scientific	AA10408G6	for wire eye loop tool
D-glucose	Sigma Aldrich	G8270	component of supplement stock solution
sodium L-lactate	Sigma Aldrich	L7022	component of supplement stock solution
sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256	component of supplement stock solution
L-glutamine	Sigma Aldrich	G3126	component of supplement stock solution
L-glutathione, reduced	Sigma Aldrich	G4251	component of supplement stock solution
L-ascorbic acid	Sigma Aldrich	A5960	component of supplement stock solution
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	component of Ringer's solution
KCl	Sigma Aldrich	P9333	component of Ringer's solution
CaCl2 · 2H2O	Sigma Aldrich	C3881	component of Ringer's solution
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S8282	component of Ringer's solution
MgCl2 · 6H2O	Sigma Aldrich	M0250	component of Ringer's solution
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	component of Ringer's solution
Tris base	Fisher Scientific	BP152	component of Na+-free Ringer's solution
6 N HCl	Fisher Scientific	02-003-063	component of Na+-free Ringer's solution
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5655	component of Na+-free Ringer's solution
50 mL conical centrifuge tube	Denville Scientific	C1062-P	container for Ringer's solution
Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades	World Precision Instruments	501790	micro-scissors for eyecup dissection
Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips	World Precision Instruments	504510	fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation
single edge razor blades	Fisher Scientific	12-640	for eyecup dissection and trimming filter paper
EMD Millipore filter forceps	Fisher Scientific	XX6200006P	flat forceps for handling wet filter paper
C12 558/568 BODIPY	Fisher Scientific	D3835	stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature
propidium iodide (PI)	Fisher Scientific	P3566	stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Hoechst 33342	Fisher Scientific	62249	stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)	Fisher Scientific	T668	stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature
tissue perfusion chamber	Cell MicroControls	BT-1-18/BT-1-18BV [-SY]	imaging chamber for injection or perfusion
2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG)	Fisher Scientific	N13195	fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia
Olympus laser scanning confocal microscope	Olympus	FV1000	confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution
Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP)	Sigma Aldrich	C2759	experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM
miniature aspirator positioner	Cell MicroControls	FL-1	for perfusion
perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder	Warner Instruments	various	for perfusion