Ex Vivo deneyler görüntüleme için yetişkin Zebra balığı üzerinden hazırlanması taze retina dilimleri

Özet

Retina doku Imaging geleneksel biyokimyasal yöntemlerle toplanan tek hücreli bilgiler sağlar. Bu iletişim kuralı üzerinden Zebra balığı retina dilimleri hazırlanması için confocal düşsel açıklar. Floresan genetik olarak kodlanmış sensörler ve göstergesi boyalar görselleştirme çok sayıda biyolojik süreçlerin ayrı retina hücre türlerinde izin vermeyin.

Özet

Retina, başlatır ve vizyon ilk adımları entegre karmaşık bir dokudur. Retina hücrelerinin disfonksiyon birçok kör edici hastalıklar özelliğidir ve gelecekteki tedaviler hücreleri normal çalışmasını temel anlayış üzerinde ne kadar farklı retina hakkında doğru katlayın. Katkıları belirli hücre tiplerinin retina hücre ortamda azalır çünkü bu tür bilgileri biyokimyasal yöntemlerle kazanıyor zor kanıtlamıştır. Canlı retina görüntüleme genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörler, giderek artan sayıda sayesinde bir hücre altı düzeyde çok sayıda biyolojik süreçlerin bir görünümünü sağlar. Ancak, bu teknik şimdiye Kurbağa yavrularını ve Zebra balığı larva, izole retina en dıştaki retina katmanları veya retina Canlı hayvanlarda daha düşük çözünürlükte görüntüleme için sınırlı olmuştur. Burada confocal mikroskobu ile canlı görüntüleme için yetişkin Zebra balığı üzerinden canlı ex vivo retina dilimler oluşturmak için bir yöntem mevcut. Bu hazırlık tüm retina katmanları ve çoğu hücre tipleri confocal görüntüleme deneyler perfüzyon kullanarak gerçekleştirmek için görünür enine dilimlerle verir. Transgenik Zebra balığı ifade floresan proteinler veya belirli retina hücre tipleri veya organelleri biyosensörler sağlam bir retina tek hücreli bilgi ayıklamak için kullanılır. Ayrıca, retina dilimleri floresan göstergesi boya, yöntemin çok yönlülük için ekleme ile yüklenebilir. Bu protokol Ca^{2 +} Zebra balığı koni photoreceptors içinde görüntüleme için geliştirilmiş, ancak uygun işaretleri ile bu Ca^{2 +} veya metabolitleri Müller hücreleri, bipolar ve yatay hücreler, microglia, amacrine hücreleri veya retina ölçmek için adapte ganglion hücrelerinin. Bu yöntem o hücre tipi eğitim için uygun değildir bu yüzden retina pigment epiteli dilimleri kaldırılır. Uygulama ile birden çok deneyler için bir hayvan seri dilimler oluşturmak mümkündür. Bu uyarlanabilir teknik retinal hücre biyolojisi, Ca^{2 +}ve enerji homeostazı hakkında birçok soru cevap için güçlü bir araç sağlar.

Giriş

Zebra balığı (Danio rerio) yaygın tıbbi ve temel bilimsel araştırma¹, küçük boyutu, hızlı bir gelişme ve omurgalı organ sistemleri sayesinde kullanılan olmak. Zebra balığı larva transgenesis için kurulan yöntemleri ile birlikte doğal şeffaflık yaşayan hayvan hücresel süreçler ayrıntılı görselleştirme etkin. Bir dizi genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörler Ca^{2 + 2}, hidrojen peroksit³, apoptotik harekete geçirmek⁴ ve ATP⁵algılamak için belirli Zebra balığı hücrelere hedef almış.

Zebra balığı larva vivo içinde görüntüleme devrimler neuroscience eşleme beyin devresi⁶ dahil olmak üzere, alanında yol açmıştır ve ilaç geliştirme merkezi sinir sistemi için⁷bozuklukları. Zebra balığı vizyon araştırma için uygundur çünkü onların retina Laminer yapısı ve yüksek omurgalılarda nöron tipleri bulunmaktadır ve bunlar sağlam görsel davranışları^8,9görüntüler. Retina dejenerasyonlar insan hastalığına benzer çeşitli başarıyla modellenmiş ve Zebra balığı^10,11bireysel photoreceptors bir retina²içinde^{oluşan bozucu canlı görüntüleme dahil olmak üzere, okudu, 12}.

Vivo larva Zebra balığı görüntüleme değerli bir araçtır, Balık büyüme ve gelişme pigmentasyon ve bazı farmakolojik tedaviler tüm hayvan nüfuz edemez gibi daha zor olur. Ayrıca, belirli hücresel süreçler daha sonraki zaman Puan anlayış fonksiyonu ve hastalık ilerleme için kritik yetişkin hayvanlarda yapmak geliştirme ve yaş ile değiştirme. Biyokimyasal immunoblot, quantitiative PCR, O₂ tüketimi ve metabolomic analizleri gibi yöntemleri Biyoloji bir bütün olarak retina hakkında önemli ipuçları sağlayabilir, ancak katkıları etkilenen tek tek hücre tiplerinin ayırt etmek zordur hastalık. İzole retina doku ex vivo Imaging bu sorunlar atlar ve düz Imaging bağlı retina affords dış retina¹³bir görünümünü, daha derin iç retina özellikleri gizlenmiş. Bu içinde sunulan tüm katmanları ve hücre tipleri açık bir görünümünü etkinleştirmek immunohistokimyasal analizleri, sabit ama sadece tek bir anlık görüntü normal fonksiyon ve hastalık dahil dinamik süreçlerin teklif gibi enine retina dilimler.

Burada, görüntüleme için yetişkin Zebra balığı üzerinden ex vivo enine retina dilimler oluşturmak için bir yöntem mevcut. Elektrofizyolojik ve morfolojik araştırmalar^14,15, zaman atlamalı ex vivo confocal kullanarak görüntüleme için önemli değişiklikler ile amfibi ve Zebra balığı retina dilimleri hazırlama yöntemleri benzer mikroskobu. Floresans yanıt biyosensörler veya boya dilimleri içinde gerçek zamanlı olarak farmakolojik ajanlar perfüzyon kullanarak teslim ederken confocal mikroskop ile izlenir. Yöntem photoreceptors görüntüleme için geliştirilmiş olsa da, Müller hücre, iki kutuplu hücreler, yatay hücreler, amacrine hücreleri veya retina ganglion hücrelerinin uygun floresan işaretleri ile görüntülenmesi için kullanmak için uygun olabilir. Ayrıca, dilimleri rapor hücre canlılığı, veziküler ulaşım, mitokondri işlev veya Redoks devlet hücre geçirgen floresan boyalar ile yüklenebilir. Bu çok yönlü hazırlık Ca^{2 +} dinamikleri, sinyal iletimi ve metabolik durumu da dahil olmak üzere retina hücre altı işlemleri geniş bir görselleştirme sağlar.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Üniversitesi Washington kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.

1. hazırlanması hayvanlar ve donanımları

Not: Retina pigment epiteli (RPE) olan pigmentasyon retina özellikleri karanlık ve confocal zaman ex vivoImaging dokusuna zarar retinanın dış çevreleyen doku karanlık bir sayfadır. Karanlıkta, Zebra balığı RPE retina uzak geri çekildi; karanlık uyum RPE retina üzerinden gelecek kaldırma önce dilimleme ve görüntüleme kolaylaştırmak için balık.

1. Balık su ile dolu bir yumurtlama tank balık aktarmak ve yumurtlama tank ile koyu kumaş sarma veya karanlık bir dolapta yerleştirin.
   1. Karanlık Zebra balığı ötenazi tam RPE ayrılması retina yakınındaki izin vermek için önce en az 1 h için uyum. 30 dk karanlık adaptasyon çoğu RPE, kaldırmak için yeterli olsa da parçaları arasında photoreceptors intercalated kalabilir.
2. Eritmek ~ 15 mL petrol jöle bir 50 mL ölçek sıcak tabakta ve 3 mL sıvı 3 mL kayma uç enjektör çizin. Şırınga ters çevir'i, bir tüp rafa yerleştirin ve Vazelin soğumasını sağlar.
3. Yeniden kullanılabilir bir Dilimleme odası düz 7 cm X 2,5 cm mikroskop Slayt üzerindeki olun.
   1. Açık tırnak cilası, slayt, ortasında 3 cm X 2,5 cm dikdörtgen oluşturmak için boya dar çizgiler kullanarak kurumasını bekleyin ve ardından tırnak cilası başka bir katman ekleme.
4. Görüntüleme merdivenler kapak dilimleri görüntüleme sırasında tutmak için paket fişi üzerinde hazırlamak. Dilimleri merdiveni "basamakları" oluşturacak.
   1. Statik görüntüleme veya en az düzeyde çözüm akışı ile enjeksiyon deneyler için vazelin 18 mm kare cam kapak paket fişi üzerinde iki düz geniş paralel şeritler oluşan vazelin merdivenler olun. İki basık uygulamak için şırınga kullanın ~ soğutmalı vazelin 0.5 cm kapak fişinde apart 1 cm uzun yayma.
5. Doku dilimleyici hazır.
   1. Çift kenar jilet etanol ile temiz ve kuru hava sağlar. Dört eşit parçaya makasla, önce uzunlamasına yarıya içine sonra her'bıçak arasında kes.
   2. Dilimleme odası doku dilimleyici sahnesinde yerini, Sahne Alanı'nda yatay olarak ortalayın ve uzun kenar hizalama kalıcı marker ile işaretlemek.
   3. Bir bıçak bölüm doku dilimleyici kol üzerine yüklemek, bıçak slayt üzerinde tırnak cilası dokunmadan düz ve ortalanmış yatıyor emin olduktan sonra bıçağı aparat hafifçe sıkın. Daha düşük topuzu ¼ ayarlayarak bıçak kol açmak, sonra yer filtre kağıdı görüntüleme odası ve test merkezinde bir parça kes. Eğer kağıt tamamen aracılığıyla kesme değil, bıçak yeniden bağlayın.
6. 10 cm kabında koyun soğutmalı vazelin tek bir küçük nokta Ģırınga kullanarak ~ sağdaki merkezinin 1,5 cm. Görüntüleme bir merdiven yukarı dönük olacak şekilde vazelin ile forseps kullanarak basın. Başka bir küçük vazelin nokta olun ~ görüntüleme odasının giriş kenarından 1 cm.
7. Vazelin şırınga 20 g iğne ile uygun ve o çıkarın. İğne şırınga üzerine tutun ve iki 1 cm uzun ince paralel şeritler vazelin Dilimleme odası merkezinde boyuna yapmak için kullanabilirsiniz. Şeritler uzay ~ 1 cm arayla.
8. Merkezi sarma tarafından yeniden kullanılabilir tel göz döngü aracı yapmak bir ~ 4 cm kesimi 30 g tungsten tel çifti etrafında bir kez sıkıca forseps kapalı. Döngünün çapı genellikle bir Zebra balığı göz, biraz daha büyük olana tel forseps aşağı ve yukarı kaydırarak ayarlayın ~ 2-3 mm. tel biter büküm ve onları laboratuvar bant kullanarak 6cm ahşap sopanın ucuna güvenli.
9. Zil'ın çözüm hazırlamak.
   1. 50 ek hisse senedi çözüm (Tablo 1) X çözülme ve sabah deneme HEPES tampon, bikarbonat zil'ın çözüm (Tablo 2) taze ekleyin; her 10 mL konik santrifüj tüpü veya steril cam şişe zil'ın çözeltisi içinde ek hisse senedi çözümün 200 µL sulandırmak. Statik görüntüleme deneyler için en az 30 mL deneme başına zil'ın çözeltisi hazırlamak. Perfüzyon deneyler için gerekli zil'ın çözüm hacmi toplam deneme saat ve akış hızı üzerinde bağlıdır.
   2. İlave çözüm pH 7.4 bir dijital pH probu veya pH kağıdı kullanarak olduğunu ve ayarlamak onay buna göre ile seyreltik NaOH veya HCl.
   3. İsteğe bağlı gaz bubbler manifold perfüzyon için kullanılan veya bir standart tıbbi oksijen tankı ve bir hortum ile donatılmış regülatör kullanarak en az 5 min için % 100 oksijen gazı ile köpüren tarafından desteklenmiştir zil'ın çözüm buz üzerinde oksijen. Mağaza kapalı konik santrifüj tüpü veya steril cam şişe diseksiyon mikroskop yakınındaki buzda zil'ın çözüm oksijenli; Bu çözüm için Imaging, diseksiyon ve boyalar veya farmakolojik sulandırmak için kullanın.
   4. Diğer çözümler deneyinde, Na⁺gibi kullanılıyorsa,-zil'ın çözüm (Tablo 3) ücretsiz, tekrarlamak merdiven 1.9.1.-1.9.3.
10. Petri yemekler, forseps, mikro-makas ve diğer araçları diseksiyon mikroskop yakınındaki toplamak ve bir balık su buz banyosu Zebra balığı ötenazi için hazırlanın.

2. retina dilimleri (bkz. şekil 1) hazırlanması

1. Çalışma ışık adaptasyon, (hangi-ebilmek RPE sopa daha sıkı yapmak için retina) en aza indirmek için kırmızı ortam ışığı altında ötenazi Zebra balığı buz banyosu daldırma tarafından dokunmatik yanıt kaybolur kadar genellikle 1-2 dk. balık bir petri Transfer edecek ve bir neşter cervically yerinden çıkar ama balık başını kesmek değil.
2. Tel döngünün bir göz etrafında bağ dokusu gevşetin için kullanın ve sonra bir yandan göz ileri döngü ile yavaşça çekin. Mikro-makas diğer elinde kullanılarak, gözün arka kesmemeye dikkat çekici ve göz altında beyaz optik sinir kesme.
3. Forseps bir petri soğuk zil'ın çözüm için buza kullanarak göz aktarmak ve ikinci göz için yineleyin. RPE retina kaldırılana kadar gözleri karanlıkta veya kırmızı ışık altında tutun.
4. Eyecups içinde bir damla soğuk zil'ın çözüm bir petri içinde düz cam slayt üzerindeki bir düşük güç diseksiyon mikroskop altında incelemek.
   1. Kornea ile iyi forseps pierce, sonra yavaşça çıkarın parçalarını temiz, kırılgan kornea ve forseps veya makas ile gümüş sklera. Kaldırmak ve objektif ve sklera çoğunu atmak ( şekil 1A' ya bakınız) ve izole kadeh en az.
   2. Yağ, sklera ve siyah RPE küçük bit parçalar için kadeh bağlı kalır ve retina daha sonra kaldırıldı. 2.4.1. adımda RPE retina ayıran, hassas izole retina zarar vermemesi için ekstra dikkatli kullanarak aynı adımlarla devam edin.
   3. Kadeh açık yan (RPE kadar) aşağı slayt üzerinde konumlandırın ve thirds veya taze tek uçlu jilet bir hareket ile üç aylık dönemler halinde kesilmiş (bkz. şekil 1B). Yüksek kavisli doku parçaları atmak.
5. Düz montaj retina filtre kağıt üzerinde.
   1. Filtre kağıt zil'ın çözüm ile ıslak ve slayt yanındaki kadeh parçalar yerleştirin. Düz forseps sağlam ıslak filtre kağıdı işlerken bu delinme önlemek için kullanın. Filtre kağıdı ve doku kapsayacak şekilde soğuk zil'ın çözüm ekleyin.
   2. Her elinde forseps kullanarak dikkatle filtre kağıdı her kadeh parça RPE ve Yani , yukarı dönük olacak şekilde göz arkası ile karşı karşıya photoreceptors altına sürükleyin. Kadeh parçaları tek bir hat boyunca filtre kağıdı ortasına yerleştirin (bkz. şekil 1 c). Kadeh parçalar sadece bir kenar veya köşe yakınlarında iyi Forseps ile yavaşça ele.
   3. Filtre kağıdı bağlı retina yardımcı olmak için bir kuru kağıt havlu 3 için ıslak filtre kağıdı yerleştirin s aşağı doğru nem fitil, ancak kuru haline doku izin. Kadeh adet düz filtre kağıt üzerinde yalan kadar yineleyin. Nazik emiş filtre kağıdı alt uygulama retina dümdüz yardımcı olur, ama bu adım gerekli değildir.
6. RPE siyah yaprak kadeh parçalar üzerinde kalır, iyi forseps yavaşça o uzakta--dan bir-başlangıç soyma için kullanın (bkz. şekil 1 d) doku zil'ın çözüm bir düşüş oturuyor iken köşe. Retina filtre kağıdı, tekrar 2.5.3 wicking adımda kaldırmak. Retina nedeniyle Ryslampa görsel pigmentler pembe görünebilir.
7. Retina diseksiyon ve düz merdiven 2,4-2,6 ikinci göz, isterseniz, soğuk zil'ın çözümde dalmış ilk düz monte retina tutmak montaj yineleyin. Dilimleme işlemi kolaylaştırmak için her iki retina parçalarını bir filtre kağıt üzerinde yerleştirilebilir. RPE kaldırıldıktan sonra deneyler karanlık gerektiren sürece protokol normal oda ışık altında yürütülen olabilir.
8. Bir slayt üzerinde filtre kağıdı yerleştirin ve içine bırakarak bir tek uçlu tıraş bıçağı olan bir dikdörtgen döşeme ~ filtre kağıt retina hattın iki tarafında 0.5 cm. Filtre kağıdı hazır Dilimleme odasına götürün uzun filtre kağıdı kenarları forseps kullanarak ince vazelin satırları itmek ve retina soğuk zil'ın çözüm 3-4 damla içinde bırakın.
   Not: Bazı boya, lipofilik boya gibi en iyi bu aşamada Dilimleme önce düz bağlar yüklenir. Bu yüklü, uzak bir doku ile kötü ve dilimleme odasında yıkanmış. Örneğin, 558/568 BODIPY yoğun lekeleri retina C¹² hücre membranları ve photoreceptor dış segmentleri (bkz. şekil 4A), yüklendiğinde ~ 5 µg/aşırı zil'ın çözüm bir makinaya ardından mL 15 dakika oda sıcaklığında (genellikle 23-27 ° C), .
9. Dilimleme odası doku dilimleyici Sahne Alanı'na transfer işaretli hat boyunca uzun kenarına getirin ve güvenli odası sahneye laboratuvar bant ile sona erer. Bir uçta başlayarak, retina ve filtre kağıdı Dilimleme kolunda firma, hafif basınç kullanarak kesmek. İlk dilim tam, kesilmiş onay sonra kesmek için mikrometre kullanmak ~ 400 µm dilimleri.
10. Görüntüleme merdiven bir araya getirin.
    1. Yer Petri kabına adım 1.7 görüntüleme için bitişik dilimlenmiş retina bölümleri ile dilimleme odası merdiven ( 1E anlamayagörmek). Çanak soğuk zil'ın çözüm ile içeriğini daldırın için doldurun.
    2. Forseps kullanmak ve dilimleri sular altında tutmak, yavaşça transfer filtre kağıdı ve retina merdivene Petri kabına soldan sağa doğru kaydırarak şeritler. Retina doğrudan dokunma için dikkat ediniz. Dilimlerini döndürme 90° ve filtre kağıdı kenarları vazelin içinde gömmek.
    3. İnce merdiveni Forseps ile retina katmanları diseksiyon mikroskop altında açıkça görünecek şekilde retina dilimleri yerleştirin (bkz. şekil 1G). Merdivenin her ucunda dilimler için doku içe doğru hareket doku enjeksiyonu veya akış sırasında en aza indirmek için diğer dilimleri doğru dönük olduğundan emin olun. İyi olmayan retina dilimleri silmek için filtre kağıdı yapıştırılır (bkz. şekil 2A).
11. İstenirse, boyalar retina dilimler halinde bu aşamada yük ve aşırı zil'ın çözüm görüntüleme önce yıkayın.
    Not: Propidium iyodür (PI) ve Höchst 33342 sağlam ölü ve tüm hücreleri, çekirdekleri sırasıyla leke (bkz. şekil 2B), oda sıcaklığında 20 dakika 5 µg/mL, retina dilimleri ile inkübe zaman. Tetramethylrhodamine (TMRM) biriken retina 1 inkübe boyunca aktif respiring mitokondri nM, oda sıcaklığında 30 dakika.
12. Dilimleri boyama iken, görüntüleme odası ve enjeksiyon aparatı hazırlayın. Şırınga zil'ın çözüm ile boru Temizleme ve kabarcıklar tasfiye, görüntüleme odası giriş hortumunun açık ucunu takın ve stopcock kapatmak için kullanın. Şırınga kaldırın ve enjeksiyon için reagent(s) ile doldurun, sonra boru için yeniden bağlayın.
13. Forseps vazelin görüntüleme odası giriş kenarına yakın nokta içine coverslip basarak görüntüleme odasına coverslip retina dilimleri ile aktarmak için kullanın (bkz. şekil 1 H). Görüntüleme odası dilimleri kapsayacak şekilde zil'ın çözüm ile doldurun.

3. görüntüleme retina dilimleri

1. Sahne Alanı'ndaki bir dik confocal mikroskop objektif daldırma 20 veya 40 X su ile donatılmış bağlı enjeksiyon aparatı ile doldurulmuş görüntüleme odası yerleştirin. Görüntüleme odası sahne klipler ile güvenli.
2. Merdiven üzerinde daldırma objektifin alt ve trans-ışıklı loş ışık altında merdivenin bir ucunda bir dilim odaklanmak. Her dilimin enine yönlendirme, photoreceptor dış segmentleri ve filtre kağıdı için güvenli yapışma varlığı için inceleyin.
3. Zaman atlamalı görüntüleme için en iyi dilimi seçin ve mikroskop bilgisayar yazılımı zaman atlamalı resim alma için yapılandırın. Tablo 4 çeşitli floresan işaretleri ve boyalar tipik görüntüleme ayarları özetlenmektedir.
   Not: Resim alma oranı mikroskop, floresan marker(s) ve biyolojik süreci okudu bağlı olarak değişir. Örneğin, 800 x 800 piksel çözünürlük, 2 µs/pixel inceden inceye gözden geçirmek hız ve 10-s kare hızı photoreceptors GCaMP3 ve kırmızı boya ile kalsiyum dinamiklerini görüntüleme için kullanın.
   1. Varsa, yazılımı dilim (photoreceptor dış segmentleri, hücre gövdeleri, çekirdeği) zaman atlamalı sırasında olası hale gelmesini yardımcı olmak için fiziksel simge yapılar izlemek için kullanır. Ayrıca gerçek zamanlı Floresans dilim izlemek için yazılımı kurar.
4. Görüntüleme başlar ve temel Floresans izleme. Floresans dilimi arasında (tipik olarak 2-5 dk içinde) stabilize, deney ile devam. Enjeksiyon, şırınga stopcock açın, sonra yavaş yavaş düşürmek ve geri iki kez karıştırma yardım için pistonu üzerinde çizin.
   Not: Örneğin, protonophore CCCP görüntüleme odasında 1 µM son bir konsantrasyon ulaşmak için konsantre çözeltisi enjekte edilerek mitokondriyal işlev ortadan kaldırmak. Bu GCaMP tarafından bildirilen photoreceptor sitozol patlama bir sağlam Ca^{2 +} , sonra TMRM tarafından bildirilen mitokondri zar potansiyel sürekli bir düşüş neden olmaktadır.
5. Yakından dilimleri drift için deneme sırasında izleyebilir ve mikro-ayarlamalar göre fiziksel yerler için yazılımı kullanın. Z yönünde enjeksiyon sırasında genellikle kayması ya da perfüzyon < 5 µm.

4. nerede çözümler değişen veya sürekli akan perfüzyon deneyler sırasında retina dilimleri görüntüleme

Not: Retina görüntüleme çözümleri değişti nerede perfüzyon deneyler sırasında dilimler veya sürekli akan Kur aşağıdaki değişiklikler ile statik görüntüleme veya enjeksiyon deneyler için benzer.

1. 1.4. adımda anlatılan vazelin merdivenler yerine daha dayanıklı balmumu merdivenler retina dilimleri çözüm akışı sırasında sabit tutmak için kullanın.
   1. İki küçük paralel silindir unflavored diş balmumu yer ~ 0.5 cm bir coverslip ayrı. Düz bir yüzeye bir her ikisine coverslip kenarına paralel doğru aşağı ve dışarı yaparken. Her ikisi de Puan edinildi düzleştirilmiş silindir #1 coverslip ile yatay olarak ( 1E rakam, sağ tarafta görmek) sonra smear vazelin mum şeritler bir spatula ile arasında ince bir tabaka.
   2. 2.10.2. adımda görüntüleme merdiven montajı, dilimlenmiş filtre kağıdı kenarları ince forseps (şekil 1G) kullanarak balmumu puanları basın.
2. Perfüzyon adım 2.12 için ayarlamak için şırınga rezervuar preoxygenated çözümleri ile doldurun veya isteğe bağlı gaz manifold her rezervuar çözümlerinde oksijen kullanın. Floş tüm boru ile zil'ın çözüm, tüm satırları açıldığında akışı ve büyük kabarcıklar tasfiye emin olun.
3. Adım 2,13 görüntüleme odasında doldurmadan önce şırınga yanal akışı sırasında kayan önlemek için coverslip maruz kalan her köşesinde üzerinde vazelin başka bir nokta eklemenizi sağlar.
4. Görüntüleme odası girdikten ve mikroskop sahnede monte sonra Aspiratörü üzerinde açın ve Aspiratörü boru bağlayın. Zil'ın çözüm akışını sınamak ve micropositioner odası taşmaları önce az miktarda sıvı çizilir böylece çıkış odası aspiratör tüp yerleştirmek için kullanın (genellikle ~ 2 mL/dk akış hızı için çözüm yüzey yukarıda 1 mm). Zil'ın çözüm adım 3.4 dilimleri seçerken akan tutun.
5. 3.4. adımda perfüzyon deney yapmak için ilk çözüm stopcock bu ikinci çözüm açılırken kapatarak çözümleri akışının geçiş yapın.
   1. Örneğin, hücre dışı Na⁺ görüntüleme odası üzerinden tüketmek için zil'ın çözüm veya Na⁺ile dolu iki şırınga rezervuarlar kullanın-ücretsiz çözüm (Tablo 3). Taban çizgisi oluşturun, sonra⁺Na geçmek için zil'ın çözüm akış-ücretsiz çözüm. Bu büyük sitozolik Ca^{2 +} photoreceptor dış kesimlerinde artırır ve hücre (bkz. şekil 4) organları ile sonuçlanır.
6. Akış hızı görüntüleme sırasında sürekli bu yüzden yerçekimi beslenen perfüzyon sistemleri için çözüm her Reservoir düzeyini izlemeniz. Oksijenli çözümleri ile gerektiği gibi rezervuar kontör veya sürekli oksijen gazı manifoldu ile köpüren korumak.

Sonuçlar

Sabit konumlandırma ve dilimleri enine yönlendirme enjeksiyon veya perfüzyon farmakolojik ajanların başarılı görüntüleme anahtarıdır. Dikkatle inceleyin ve dilimler confocal görüntüleme önce tüm retina katmanlar görünür (şekil 2A, dilim II) emin olmak için gerektiği gibi yeniden konumlandırmak. Bir dilim döndürülürse biraz ileri (şekil 2A, dilim III), dış segmentleri demetleri görünür hale gelir ...

Tartışmalar

Ex vivo görüntüleme taze Zebra balığı retina dilim photoreceptor Biyoloji^20,21,22eğitim için çok yönlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır ve çözümleme olgun, tek hücre tam sağlar benzersizdir farklılaştırılmış retina. Uygulama ile hatta retina aynı kısmından seri dilimleri kullanarak tek bir balık dokudan ile birden çok deney mümkündür. Sorunlar ve öneriler Elektrofizyoloji çalışmalar...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
zebrafish	Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility		stocks maintained in-house as stable transgenic lines
petroleum jelly	Fisher Scientific	19-090-843	for petroleum jelly syringe
3-mL slip tip syringe	Fisher Scientific	14-823-436	for petroleum jelly syringe
20g 3.8 cm slip tip needle	Fisher Scientific	14-826-5B	for petroleum jelly syringe
plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide	Fisher Scientific	12-550-A3	for eyecup dissection, slicing chamber
Seche Vite clear nail polish	Amazon	B00150LT40	for slicing chamber
18 mm X 18 mm #1 glass coverslips	Fisher Scientific	12-542A	for imaging ladders
unflavored dental wax	Amazon	B01K8WNL5A	for imaging ladders
double edge razor blades	Stoelting	51427	for tissue slicing
tissue slicer with digital micrometer	Stoelting	51415	for tissue slicing
filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size	EMD Millipore	HAWG01300	filter paper for mounting retinas
10 cm petri dish	Fisher Scientific	FB0875712	for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly
15 cm plain-tipped wood applicator stick	Fisher Scientific	23-400-112	for wire eye loop tool
30g (0.25 mm diameter) tungsten wire	Fisher Scientific	AA10408G6	for wire eye loop tool
D-glucose	Sigma Aldrich	G8270	component of supplement stock solution
sodium L-lactate	Sigma Aldrich	L7022	component of supplement stock solution
sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256	component of supplement stock solution
L-glutamine	Sigma Aldrich	G3126	component of supplement stock solution
L-glutathione, reduced	Sigma Aldrich	G4251	component of supplement stock solution
L-ascorbic acid	Sigma Aldrich	A5960	component of supplement stock solution
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	component of Ringer's solution
KCl	Sigma Aldrich	P9333	component of Ringer's solution
CaCl2 · 2H2O	Sigma Aldrich	C3881	component of Ringer's solution
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S8282	component of Ringer's solution
MgCl2 · 6H2O	Sigma Aldrich	M0250	component of Ringer's solution
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	component of Ringer's solution
Tris base	Fisher Scientific	BP152	component of Na+-free Ringer's solution
6 N HCl	Fisher Scientific	02-003-063	component of Na+-free Ringer's solution
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5655	component of Na+-free Ringer's solution
50 mL conical centrifuge tube	Denville Scientific	C1062-P	container for Ringer's solution
Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades	World Precision Instruments	501790	micro-scissors for eyecup dissection
Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips	World Precision Instruments	504510	fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation
single edge razor blades	Fisher Scientific	12-640	for eyecup dissection and trimming filter paper
EMD Millipore filter forceps	Fisher Scientific	XX6200006P	flat forceps for handling wet filter paper
C12 558/568 BODIPY	Fisher Scientific	D3835	stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature
propidium iodide (PI)	Fisher Scientific	P3566	stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Hoechst 33342	Fisher Scientific	62249	stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)	Fisher Scientific	T668	stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature
tissue perfusion chamber	Cell MicroControls	BT-1-18/BT-1-18BV [-SY]	imaging chamber for injection or perfusion
2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG)	Fisher Scientific	N13195	fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia
Olympus laser scanning confocal microscope	Olympus	FV1000	confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution
Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP)	Sigma Aldrich	C2759	experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM
miniature aspirator positioner	Cell MicroControls	FL-1	for perfusion
perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder	Warner Instruments	various	for perfusion