Подготовка Ломтики свежих сетчатки от взрослых рыбок данио для Ex Vivo изображений эксперименты

Резюме

Визуализации тканей сетчатки может предоставить информацию одной ячейки, которые не могут быть собраны от традиционных биохимических методов. Этот протокол описывает подготовка конфокальная томография сетчатки кусочки от данио рерио. Флуоресцентный генетически закодированный датчики или индикатор красители позволяют визуализации многочисленных биологических процессов в типах различных клеток сетчатки.

Аннотация

Сетчатка является сложной ткани, которая инициирует и интегрирует первые шаги видения. Дисфункция клеток сетчатки является отличительной чертой многих ослепительный заболеваний, и будущее терапии зависят от основных договоренностей о как различные сетчатки, что клетки нормально функционировать. Получение такой информации с биохимическими методами оказалось сложным делом, потому что вклад конкретной ячейке типов уменьшаются в обстановке клеток сетчатки. Живой сетчатки изображений может предоставить представление многочисленных биологических процессов на субклеточном уровне, благодаря растущее количество генетически закодированный флуоресцентные биодатчиков. Однако этот метод до настоящего времени была ограничена головастиков и личинки данио рерио, внешнего слоев сетчатки изолированных сетчатки или ниже резолюции томография сетчатки в живых животных. Здесь мы представляем метод для создания живых ex vivo сетчатки фрагменты из взрослых рыбок данио для живых изображений через confocal микроскопии. Эта подготовка дает поперечные срезы со всех слоев сетчатки и большинство типов клеток, видимые для выполнения конфокальный изображений эксперименты с использованием перфузии. Трансгенные данио рерио выражая флуоресцентные белки или биодатчики в типы конкретных сетчатки клетки или органеллы используются для извлечения информации одной ячейки из нетронутыми сетчатки. Кроме того фрагменты сетчатки могут быть загружены с флуоресцентный индикатор красители, Добавление метода универсальность. Этот протокол был разработан для визуализации Ca^{2 +} в zebrafish конус фоторецепторов, но с надлежащей маркеры могут быть адаптированы для измерения Ca^{2 +} или метаболитов в клетки Мюллер, биполярных и горизонтальные клетки, микроглии, Амакриновые клетки или сетчатки клетках ганглия. Пигментный эпителий сетчатки удаляется из кусочков, поэтому этот метод не подходит для изучения этого типа ячейки. С практикой это возможно для создания последовательных фрагментов из одного животного для нескольких экспериментов. Эта адаптируемых техника предоставляет мощный инструмент для ответа на многие вопросы о биологии клетки сетчатки, Ca^{2 +}и энергетического гомеостаза.

Введение

Данио рерио (Danio рерио) стала широко используется в медицинской и базовые научные исследования¹, из-за ее небольшого размера, быстрое развитие и позвоночных органов и систем. Естественный прозрачности данио рерио личинок в сочетании с установленными методами для трансгенез позволили подробные визуализации клеточных процессов в живых животных. Количество генетически закодированный флуоресцентные биодатчики были направлены конкретные данио рерио клеток, чтобы обнаружить Ca^{2 + 2}, перекись водорода³, apoptotic активации⁴ и⁵СПС.

В естественных условиях изображений данио рерио личинок привела к открытий в области неврологии, включая картирование мозга цепь⁶ и разработки лекарств для центральной нервной системы расстройств⁷. Данио рерио хорошо подходят для видения исследований, потому что их сетчатки располагают слоистые структуры и типы нейрон высших позвоночных животных, и они отображают надежного визуального поведения^8,9. Несколько типов сетчатки дегенерации аналогичных болезней человека были смоделированы успешно и учился в zebrafish^10,11, включая живые изображения отдельных фоторецепторов, вырождающихся в сетчатке^{2, 12}.

В то время как в естественных условиях личиночной данио рерио изображений является ценным инструментом, он становится более сложным, как рыба расти и развиваться пигментации, и некоторые фармакологические методы лечения не могут пронизывать весь животного. Кроме того некоторые клеточные процессы изменения с развитием и возраст, делая позднее время очков важна для понимания функций и прогрессирование болезни у взрослых животных. Биохимические методы, такие как immunoblot, quantitiative ПЦР, O₂ потребления и Метаболомные анализов может обеспечить важные подсказки о биологии сетчатки в целом, но это трудно различить взносов типов отдельных клеток, пострадавших от болезни. Imaging изолированных ткани сетчатки ex vivo обходит эти проблемы и хотя плоских изображений навесные сетчатки открывается вид наружной сетчатки¹³, глубже внутренний сетчатки особенности скрываются. Поперечная сетчатки ломтиками, такие, как те, которые представлены в фиксированной Иммуногистохимический анализ, дать четкое представление о всех слоев и типов клеток, но предлагают только один моментальный снимок динамических процессов, участвующих в нормальной функции и болезней.

Здесь мы представляем метод для генерации ex vivo поперечной сетчатки фрагменты из взрослых рыбок данио для изображений. Он похож на методы подготовки амфибий и данио рерио сетчатки ломтиками для электрофизиологических и морфологических исследований^14,15, с важными изменениями для визуализации ex vivo с помощью конфокальной промежуток времени микроскопия. Флуоресценции ответы биодатчики или красителей в ломтики контролируются в режиме реального времени с Конфокальный микроскоп пока поставляющ фармакологических агентов с помощью перфузии. В то время как метод был разработан для визуализации фоторецепторов, это может быть целесообразно использовать для визуализации ячеек, биполярных клеток, горизонтальные клетки, Амакриновые клетки или клетки сетчатки ганглия Мюллер с соответствующим флуоресцентные маркеры. Кроме того фрагменты могут быть загружены с люминесцентными красками клеток проницаемой для отчета жизнеспособности клеток, везикулярный транспорт, митохондриальной функции или окислительно-восстановительного состояния. Этот универсальный препарат позволяет визуализировать широкий спектр внутриклеточных процессов на протяжении всего сетчатки, включая Ca^{2 +} динамика, сигнала и метаболических состояние.

протокол

Все эксперименты на животных были утверждены университета Вашингтона институциональных животное уход и использование Комитета.

1. Подготовка животных и оборудования

Примечание: Пигментный эпителий сетчатки (ПЭС), это темный лист ткани вокруг снаружи сетчатки, чьи пигментация может скрывать сетчатки особенности и повреждать ткани когда конфокальное изображение ex vivo. В темноте НПП данио рерио отказался от сетчатки; Темный адаптировать рыбы для облегчения будущего удаления НПП от сетчатки до нарезки и обработки изображений.

1. Передавать нереста бак с водой рыбы, рыбы и затем обернуть нереста танк с темной ткани или поместить его в темный шкаф.
   1. Темный адаптировать данио рерио для по крайней мере за 1 час до эвтаназии разрешить вблизи полное разделение НПП от сетчатки. 30 мин темно-адаптации достаточно удалить большинство ПЭС, хотя куски могут оставаться вставными между фоторецепторов.
2. Расплава ~ 15 мл нефти желе в 50-мл стакан на горячей плите, а затем обратить 3 мл жидкости в шприц 3 мл скольжения подсказки. Инвертировать шприц, место в стойке пробирку и позволяют вазелином для охлаждения.
3. Делать многоразовые режущей камеры на равнине 7 см X 2,5 см микроскопа.
   1. С помощью четких лак, краска узкие линии для создания прямоугольника, 3 X 2,5 см в центре слайда, дайте ему высохнуть, а затем добавить еще один слой лака на линии.
4. Подготовка изображений лестниц на скользит крышка для хранения фрагментов во время визуализации. Ломтики составят «ступеньками» лестницы.
   1. Для статических изображений или инъекции эксперименты с минимальным решения потока сделайте вазелин лестницы, состоящий из двух плоской широкой параллельных полос вазелин на 18 мм квадратных стеклянные крышки скользит. Использовать шприц для применения двух уплощенная ~ 1 см длиной мазках охлаждением вазелин 0,5 см друг от друга на крышку выскальзования.
5. Готовые срез ткани.
   1. Очистите лезвие бритвы двойной край с этанолом и позволить ему воздух сухой. Разрезать его на четверти с ножницами, сначала вдоль пополам, пополам, а затем через каждое лезвие.
   2. Место среза камеры на сцене срез ткани, центр его горизонтально на сцене и Марк длинный край с постоянным маркером для выравнивания.
   3. Загрузить лопаточная часть на руку срез ткани, убедитесь, что лезвие лежит плоские и центрированы на слайде без касатьться Лак для ногтей, а затем осторожно затянуть аппаратом лезвия. Ниже лезвие руку, регулируя ручку ¼ повернуть, то место, где лом фильтровальной бумаги в центре тепловизионные камеры и испытаний отрезать его. Если документ полностью не прорезать, установите лезвие.
6. С помощью шприца, место одну небольшую точку охлаждением вазелин в чашке Петри 10 см ~ 1,5 см справа от центра. Нажмите изображения лестница в нее с помощью щипцов с вазелином, вверх. Сделать еще один небольшой вазелин dot ~ 1 см от края входе тепловизионные камеры.
7. Соответствовать вазелин шприц с иглой 20g и ЭСКАТО его. Удерживая иглу на шприц и использовать его для создания двух 1 см длинные тонкие параллельные полоски вазелин продольно в центре режущей камеры. Пространство полоски ~ 1 см друг от друга.
8. Сделать инструмент цикла глаз многоразовые проволоки, завернув в центре ~ сегмент 4 см 30 g Вольфрамные проволоки вокруг пару раз плотно закрыты щипцами. Отрегулировать диаметр цикла, двигая провод вверх или вниз щипцы, до тех пор, пока это немного больше, чем глаз данио рерио, обычно ~ 2-3 мм. концы проволоки и закрепите их в конце 6-см деревянной палочкой, с использованием лабораторных ленты.
9. Подготовьте раствор Рингера.
   1. Оттепель 50 X дополнение Стоковый раствор (Таблица 1) и добавить свежий раствор Рингера HEPES в буфер, не бикарбонат (Таблица 2) утром эксперимента; Разбавьте 200 мкл дополнения Стоковый раствор каждые 10 мл раствора Рингера в конической пластиковых пробирок или стерильной стеклянной бутылке. Для статических изображений экспериментов Подготовьте по крайней мере 30 мл раствора Рингера в эксперимент. Объем раствора Рингера, необходимые для перфузии эксперименты будет зависеть от скорости потока и времени всего эксперимента.
   2. Проверьте, что рН раствора дополнить с помощью цифровой рН зонд или бумага рН 7,4 и отрегулировать соответственно с разбавляют NaOH или HCl.
   3. Кислородсодержащих дополненными Рингера раствор на льду по восходящей с 100% кислород газ по крайней мере 5 минут, используя стандартные медицинские танк кислород и регулятор оснащены шлангом, или дополнительный газ барботер коллектор для перфузии. Хранят раствор Рингера кислородом на льду в запечатанном конические пластиковых пробирок или стерильной стеклянной бутылке рядом рассечение Микроскоп; Используйте это решение для вскрытия, изображений и для разбавления краски или фармакологических агентов.
   4. Если другие решения используются в эксперименте, например Na⁺-свободный раствор Рингера (Таблица 3), повторите шаги 1.9.1.-1.9.3.
10. Собирать Петри, щипцы, микро ножницы и другие инструменты вблизи Микроскоп рассечение и подготовить Ванна ледяной воде рыбы для данио рерио эвтаназии.

2. Подготовка сетчатки ломтиками (см. Рисунок 1)

1. Работа под красный освещенности для сведения к минимуму свет адаптации (которая может сделать палку НПП более плотно сетчатки), усыпить данио рерио путем погружения в ледяной ванне до тех пор, пока ответ ощупь теряется, обычно 1-2 мин передать Петри блюдо рыбы и использовать скальпеля для cervically вывихнуть, но не обезглавить рыбы.
2. Используйте провод петли для ослабления соединительной ткани вокруг один глаз, а затем потяните вперед глаза мягко с цикла в одной руке. С помощью микро ножницы с другой стороны, отрежьте белый зрительного нерва под глаза, стараясь не вырезать в задней части глаза.
3. Перевести глаза, используя пинцет в чашке Петри холодного звонка решения на льду и повторите для второго глаза. Держите глаза в темноте или под красный свет до тех пор, пока НПП удаляется от сетчатки.
4. Вскрыть выкручиваются под микроскопом рассечение малой мощности в капле раствора холодного звонка на слайде простого стекла в чашке Петри.
   1. Проколоть роговицы с тонкой щипцами, а затем аккуратно удалить кусочки прозрачной, ломкие роговицы и склеры серебристые с ножницами или щипцами. Снимите и выбросьте объектива и большую часть склеры (см. рис. 1а) и обрабатывать изолированных наглазник минимально.
   2. Куски жира, маленькие кусочки склеры, и черный ПЭС может оставаться прикрепленной к наглазник и удалены от сетчатки позже. Если сетчатка отделяет от НПП в шаге 2.4.1, продолжите те же шаги, с помощью особую осторожность, чтобы не повредить тонкий изолированных сетчатки.
   3. Положение наглазник открытой стороной вниз (ПЭС вверх) на слайде и разрезать на трети или кварталы с свежий одним краем лезвия в одном движении (см. рис. 1B). Выбросите куски ткани, которые высоко изогнуты.
5. Плоский горе сетчатки на фильтровальной бумаге.
   1. Влажные кусок фильтровальной бумаги с раствор Рингера и поместите его на слайде рядом с наглазник штук. Избежание проколов его используйте плоские щипцы при обработке нетронутыми мокрой фильтровальной бумаги. Добавьте решение холодного звонка для покрытия фильтровальной бумаги и ткани.
   2. С помощью щипцов в каждой руке, тщательно перетащите фильтр бумага под каждый кусок наглазник с ПЭС и фоторецепторов вверх, т.е. с задней части глаза вверх. Положение части наглазник в отдельной строке вдоль по центру фильтра бумаги (см. рис. 1 c). Обрабатывать наглазник куски аккуратно пинцетом штраф только возле ее край или угол.
   3. Чтобы помочь сетчатки придерживаться фильтровальная бумага, место мокрый фильтр бумага на сухой салфеткой для 3 s фитиль влагу вниз, но не позволяйте ткани становятся сухими. Повторяйте до тех пор, пока кусочки наглазник ли плашмя на фильтровальной бумаге. Применяя нежный всасывания к нижней фильтр-бумаги помогает сгладить сетчатки, но этот шаг не является необходимым.
6. Если черный листы НПП остаются на куски, наглазник, используйте тонкой щипцы для мягко чистить его прочь, начиная от одного угла (см. рис. 1 d) ткани, сидя в капле раствора Рингера. Следует сетчатки Поднимите фильтровальной бумаги, повторите шаг влагу в 2.5.3. Сетчатки может появиться розовый благодаря небеленой зрительных пигментов.
7. Повторите сетчатки диссекции и плоским монтажные шаги в 2.4-2.6 для второго глаза, при желании, сохраняя первую установлен телевизор с плоским сетчатки, погружен в раствор Рингера-холодной. Чтобы упорядочить процесс нарезки, кусочки обоих сетчатки может делаться на один фильтр-бумаги. После того, как был удален ПЭС, протокол может осуществляться при нормальной комнатной свет Если эксперименты требуют тьмы.
8. Поместите документ фильтр на слайде и обрезать его в прямоугольник с одним краем лезвия бритвы, оставляя ~ 0,5 см фильтровальной бумаги по обе стороны от линии сетчатки. Переместить фильтровальную бумагу в зале подготовленный нарезки, вставьте тонкий вазелин линий, с помощью щипцов края длинный фильтр-бумаги и погружать сетчатки в 3-4 капли раствора холодного звонка.
   Примечание: Некоторые красители, например липофильных красители, лучше всего загружаются в плоские кронштейны на данном этапе до нарезки. Эти можно загружен, злой прочь с ткани и промывают в зале нарезки. Например, C¹² 558/568 BODIPY интенсивно пятна сетчатки клетки мембран и наружной сегментов фоторецепторных (см. рис. 4A) при загрузке на ~ 5 мкг/мл за 15 мин при комнатной температуре (обычно 23-27 ° C), следуют мыть в раствор Рингера-избыток .
9. Передавать режущей камеры на сцену срез ткани, позиция длинной вдоль линии заметное и безопасного камеры заканчивается на сцену с лентой лаборатории. Начало в один конец, сократить сетчатки и фильтр-бумаги с помощью фирмы, нежное давление на нарезки руку. Проверьте, что Первый срез был сокращен полностью, затем использовать микрометр сократить ~ 400 мкм ломтиками.
10. Соберите изображений лестница.
    1. Место режущей камеры с нарезанный сетчатки секций в Петри из шага 1.7 рядом изображений лестница (см. Рисунок 1E). Блюдо Залейте раствор Рингера-холодной затопить его содержимое.
    2. С помощью щипцов и сохранения фрагментов погружения, мягко передавать полоски фильтровальной бумаги и сетчатки по лестнице, двигая Петри слева направо. Заботиться, чтобы не коснуться сетчатки непосредственно. Поворот секторов 90° и похоронить фильтровальная бумага краев вазелином.
    3. Мелко позиция сетчатки ломтики в лестнице с щипцами, так, что слоях сетчатки видны под микроскопом диссекции (см. Рисунок 1 g). Для фрагментов на каждом конце лестницы убедитесь, что ткань лицом внутрь к другим ломтики для сведения к минимуму движения ткани во время инъекции или потока. Отменить все сетчатки фрагменты, которые не являются хорошо придерживаться фильтровальную бумагу (см. рис. 2а).
11. При желании, загрузить красители сетчатки ломтиками на данном этапе и стирать в раствор Рингера-избыток до изображений.
    Примечание: Пропидий йодидом (PI) и Hoechst 33342 энергично пятно ядер мертвых и всех клеток, соответственно (см. рис. 2B), когда инкубировали с сетчатки ломтики на 5 мкг/мл в течение 20 минут при комнатной температуре. Тетраметилродамина (TMRM) накапливается в активно дышащими митохондрий всей сетчатке когда инкубировали в 1 Нм для 30 мин при комнатной температуре.
12. В то время как окрашивание срезов, подготовьте тепловизионные камеры и инъекции аппарата. Очистка труб с раствор Рингера и удалить пузыри, придавать тепловизионные камеры входе открытый конец трубы и закрыть запорный используйте шприц. Удалите шприц и заполнить его с reagent(s) для инъекций, а затем присоедините его к трубе.
13. Используйте щипцы для передачи coverslip сетчатки кусочками тепловизионные камеры, нажав coverslip в точку вазелин на краю входе тепловизионные камеры (см. Рисунок 1 H). Тепловизионные камеры заполните раствором Рингера для покрытия ломтиками.

3. томография сетчатки фрагментов

1. Место заполненные тепловизионные камеры с аппарат подключенным инъекций на сцене вертикально конфокального микроскопа, с 20 или 40 X воды, окуная объектива. Закрепите тепловизионные камеры с этап клипов.
2. Нижняя погружения объектив над лестницей и сосредоточиться на кусочек на одном конце лестницы под тусклым транс освещенные светом. Проверьте каждый фрагмент для поперечной ориентации, наличие внешнего сегментов фоторецепторных и безопасных адгезии к фильтровальной бумаги.
3. Выберите лучший кусочек для визуализации промежуток времени и настройте Микроскоп программное обеспечение для захвата изображений в промежуток времени. В таблице 4 описываются типичные параметры изображений для различных флуоресцентные маркеры и красители.
   Примечание: Скорость загрузки изображений будет варьироваться в зависимости от Микроскоп, флуоресцентный marker(s) и биологических процессов, которые изучаются. Например используйте 800 x 800 пикселей, скорость сканирования 2 МКС/пиксель и частоту кадров 10-s для визуализации динамики кальция в фоторецепторных клеток с GCaMP3 и красного красителя.
   1. Если возможно, используйте программное обеспечение для отслеживания физических достопримечательности срез (внешняя сегментов фоторецепторных, сотовые органов, ядра) для оказания помощи потенциальным переориентацию во время промежуток времени. Также настроить программное обеспечение для мониторинга в реальном времени флуоресценции через фрагмент.
4. Начать изображений и отслеживать базовые флуоресценции. Когда флуоресценции через срез стабилизируется (обычно в течение 2-5 мин), продолжите эксперимент. Для инъекций Откройте запорный шприц, затем медленно угнетают и привлечь обратно на поршень дважды, чтобы помочь смешивания.
   Примечание: например, отменить митохондрий путем инъекций концентрированный раствор protonophore CCCP до конечной концентрации 1 мкм в тепловизионной камере. Это побуждает надежные Ca^{2 +} ворвались в цитозоле фоторецептора, сообщил GCaMP, то устойчивое снижение митохондриального мембранного потенциала сообщил TMRM.
5. Внимательно следить за фрагментов для смещения во время эксперимента и использовать программное обеспечение, микро-коррективы согласно физической достопримечательности. Как правило дрейф в Z-направлении во время инъекции или перфузии является < 5 мкм.

4. томография сетчатки фрагменты во время экспериментов перфузии, где решения изменяются или текла постоянно

Примечание: Изображение сетчатки ломтики во время экспериментов перфузии, где решения изменяются или текла постоянно похож на установки для статических изображений или инъекции экспериментов, со следующими изменениями.

1. Вместо вазелина лестницы, описанный в шаге 1.4 Используйте крепкий воск лестницы провести сетчатки ломтики устойчивый во время решения потока.
   1. Место два небольших параллельных цилиндры неприправленный зубоврачебный воск ~ 0,5 см друг от друга на coverslip. На плоской поверхности используйте большой палец нажать вниз и наружу к параллельно краю coverslip каждого цилиндра. Оценка как плоские цилиндры горизонтально с #1 coverslip (см. Рисунок 1E, справа) затем смазать тонким слоем вазелина между восковые полоски с помощью шпателя.
   2. При сборке изображений лестница на шаге 2.10.2, нажмите краев нарезанные фильтровальной бумаги в воск баллы с помощью тонкой щипцы (рис. 1 g).
2. Чтобы настроить для перфузии на шаге 2.12, заполните шприц водохранилищ с preoxygenated решениями, или использовать Факультативный газового коллектора для насыщения кислородом решения в каждом резервуаре. Промойте все трубки с раствор Рингера, убедитесь, что все линии потока при открытии и очищать большие пузыри.
3. Перед заполнением тепловизионные камеры на шаге 2.13, используйте шприц поставить другой точка вазелин каждый подвергается угол coverslip, чтобы предотвратить его от боков скольжения во время потока.
4. Когда тепловизионные камеры заполнен и установлен на микроскопа, включите аспиратор и подключение шланга аспиратора. Проверка потока раствора Рингера и использовать micropositioner, чтобы расположить Аспиратор трубки над отток камеры так, что небольшое количество жидкости рисуются, прежде чем камера переполнения (обычно ~ 1 мм над поверхностью раствора для скорости потока 2 мл/мин). Держите раствор Рингера, пропуская при выборе фрагментов в шаге 3.4.
5. Для проведения эксперимента в шаге 3.4 для перфузии, переключение потока решений, закрыв кран первого решения при открытии второго решения.
   1. Например, чтобы разрушающих внеклеточный Na⁺ из тепловизионной камеры, используйте два шприца резервуары заполнены раствором Рингера или Na⁺-бесплатное решение (Таблица 3). Поток раствор Рингера для установления базового уровня, а затем переключиться на Na⁺-бесплатные решения. Это приводит к большой цитозольной Ca^{2 +} увеличение внешних сегментов фоторецепторных и клеток органов (см. Рисунок 4).
6. Для самотечных перфузии систем контролировать уровень решения в каждом резервуаре, поэтому скорость потока постоянна во время визуализации. Довершение водохранилищ, при необходимости с кислородом решения, или поддерживать непрерывное кислородом пузырьков с газового коллектора.

Результаты

Стабильные позиционирования и поперечной ориентации фрагменты являются ключом к успешной изображений с инъекций или перфузии фармакологических агентов. Тщательно изучить и изменить срезов до конфокальная томография при необходимости обеспечить всех слоев сетчатк...

Обсуждение

Ex vivo томография сетчатки Ломтики свежих данио рерио оказался универсальный инструмент для изучения фоторецепторных биологии^20,21,22и является уникальным в том, что он позволяет анализ единичных клеток в зрелых, полностью дифференц?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
zebrafish	Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility		stocks maintained in-house as stable transgenic lines
petroleum jelly	Fisher Scientific	19-090-843	for petroleum jelly syringe
3-mL slip tip syringe	Fisher Scientific	14-823-436	for petroleum jelly syringe
20g 3.8 cm slip tip needle	Fisher Scientific	14-826-5B	for petroleum jelly syringe
plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide	Fisher Scientific	12-550-A3	for eyecup dissection, slicing chamber
Seche Vite clear nail polish	Amazon	B00150LT40	for slicing chamber
18 mm X 18 mm #1 glass coverslips	Fisher Scientific	12-542A	for imaging ladders
unflavored dental wax	Amazon	B01K8WNL5A	for imaging ladders
double edge razor blades	Stoelting	51427	for tissue slicing
tissue slicer with digital micrometer	Stoelting	51415	for tissue slicing
filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size	EMD Millipore	HAWG01300	filter paper for mounting retinas
10 cm petri dish	Fisher Scientific	FB0875712	for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly
15 cm plain-tipped wood applicator stick	Fisher Scientific	23-400-112	for wire eye loop tool
30g (0.25 mm diameter) tungsten wire	Fisher Scientific	AA10408G6	for wire eye loop tool
D-glucose	Sigma Aldrich	G8270	component of supplement stock solution
sodium L-lactate	Sigma Aldrich	L7022	component of supplement stock solution
sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256	component of supplement stock solution
L-glutamine	Sigma Aldrich	G3126	component of supplement stock solution
L-glutathione, reduced	Sigma Aldrich	G4251	component of supplement stock solution
L-ascorbic acid	Sigma Aldrich	A5960	component of supplement stock solution
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	component of Ringer's solution
KCl	Sigma Aldrich	P9333	component of Ringer's solution
CaCl2 · 2H2O	Sigma Aldrich	C3881	component of Ringer's solution
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S8282	component of Ringer's solution
MgCl2 · 6H2O	Sigma Aldrich	M0250	component of Ringer's solution
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	component of Ringer's solution
Tris base	Fisher Scientific	BP152	component of Na+-free Ringer's solution
6 N HCl	Fisher Scientific	02-003-063	component of Na+-free Ringer's solution
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5655	component of Na+-free Ringer's solution
50 mL conical centrifuge tube	Denville Scientific	C1062-P	container for Ringer's solution
Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades	World Precision Instruments	501790	micro-scissors for eyecup dissection
Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips	World Precision Instruments	504510	fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation
single edge razor blades	Fisher Scientific	12-640	for eyecup dissection and trimming filter paper
EMD Millipore filter forceps	Fisher Scientific	XX6200006P	flat forceps for handling wet filter paper
C12 558/568 BODIPY	Fisher Scientific	D3835	stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature
propidium iodide (PI)	Fisher Scientific	P3566	stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Hoechst 33342	Fisher Scientific	62249	stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)	Fisher Scientific	T668	stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature
tissue perfusion chamber	Cell MicroControls	BT-1-18/BT-1-18BV [-SY]	imaging chamber for injection or perfusion
2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG)	Fisher Scientific	N13195	fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia
Olympus laser scanning confocal microscope	Olympus	FV1000	confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution
Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP)	Sigma Aldrich	C2759	experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM
miniature aspirator positioner	Cell MicroControls	FL-1	for perfusion
perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder	Warner Instruments	various	for perfusion