Préparation tranches rétiniennes fraîches de poisson-zèbre adulte pour Ex Vivo des expériences d’imagerie

Résumé

Imagerie tissu rétinien peut fournir des informations de cellule unique qui ne peut pas être recueillies de méthodes biochimiques traditionnelles. Ce protocole décrit la préparation de rétiniens tranches de poisson zèbre pour l’imagerie confocale. Fluorescentes codé génétiquement des capteurs ou indicateur colorants permettent la visualisation de nombreux processus biologiques en types distincts de cellules rétiniennes.

Résumé

La rétine est un tissu complex qui initie et intègre les prémices de la vision. La dysfonction des cellules de la rétine est une caractéristique de nombreuses maladies aveuglantes et thérapies futures dépendent de compréhensions fondamentale sur la rétine comment différente cellules de fonctionnent normalement. Obtenir ces informations avec des méthodes biochimiques s’est avérée difficile parce que les contributions des types de cellules particulières sont diminuées dans le milieu des cellules rétiniennes. Imagerie rétinienne direct peut fournir une vue de nombreux processus biologiques niveau subcellulaire, grâce à un nombre croissant de biocapteurs fluorescents génétiquement encodés. Cependant, cette technique a été jusqu'à présent limitée à des têtards et des larves de poisson zèbre, les couches rétiniennes ultrapériphériques des rétines isolés ou imagerie de résolution plus faible des rétines animaux vivants. Nous présentons ici une méthode pour générer des vivants ex vivo rétinienne tranches de poisson-zèbre adulte pour l’imagerie live par microscopie confocale. Cette préparation donne des tranches transversales avec toutes les couches rétiniennes et la plupart des types de cellules visibles permettant d’effectuer des expériences d’imagerie confocale utilisant une perfusion. Poisson zèbre transgéniques exprimant des protéines fluorescentes ou biocapteurs dans les types de cellules rétiniennes spécifiques ou organites sont utilisés pour extraire les informations de la cellule unique d’une rétine intacte. En outre, tranches rétiniens peuvent être chargés avec indicateur fluorescent colorants, ajoutant à la polyvalence de la méthode. Ce protocole a été développé pour l’imagerie Ca^{2 +} au sein de poisson-zèbre cônes photorécepteurs, mais avec des marqueurs de bon, il pourrait être adapté pour mesurer Ca^{2 +} ou métabolites dans Müller cellules, cellules bipolaires et horizontales, cellules microgliales, cellules amacrines ou la rétine cellules ganglionnaires. L’épithélium pigmentaire rétinien est retiré des tranches si cette méthode ne consiste pas pour l’étude de ce type de cellule. Avec la pratique, il est possible de générer des tranches de série d’un animal pour des expériences multiples. Cette technique adaptable fournit un outil puissant pour répondre à nombreuses questions sur la biologie des cellules rétiniennes, Ca^{2 +}et l’homéostasie énergétique.

Introduction

Le poisson zèbre (Danio rerio) a devenu employé couramment dans la recherche scientifique médicale et base¹, en raison de sa petite taille, de développement rapide et de systèmes d’organes vertébrés. La transparence naturelle des larves de poisson zèbre combinée à des méthodes établies pour la transgénèse ont permis une visualisation détaillée des processus cellulaires dans un animal vivant. Un certain nombre de biocapteurs fluorescents génétiquement codées ont été la cible de cellules spécifiques zebrafish pour détecter Ca^{2 + 2}, peroxyde d’hydrogène³, apoptotic activation⁴ et ATP⁵.

L’imagerie in vivo des larves de poisson zèbre a donné lieu à des percées dans le domaine des neurosciences, y compris la cartographie du cerveau circuits⁶ et⁷de troubles de développement de médicaments pour le système nerveux central. Poisson zèbre conviennent bien pour la recherche de vision parce que leurs rétines présentent la structure laminaire et types de neurones des vertébrés supérieurs, et ils affichent des comportements visuels robuste^8,9. Plusieurs types de dégénérescences rétiniennes analogues à la maladie humaine ont été modélisés avec succès et étudiées chez le poisson zèbre^10,11, y compris l’imagerie direct des photorécepteurs individuels dégénérer dans une rétine^{2, 12}.

En vivo imagerie de larves de poisson zèbre est un outil précieux, il devient plus difficile que les poissons grandissent et développent de pigmentation, et certains traitements pharmacologiques ne peuvent pénétrer un animal entier. En outre, certains procédés cellulaires changent avec l’âge et le développement faisant plus tard points dans le temps critique pour la fonction de la compréhension et la progression de la maladie chez les animaux adultes. Méthodes biochimiques tels qu’immunoblot, quantitative PCR, O₂ consommation et métabolomique analyses peuvent fournir des indices importants sur la biologie de la rétine dans son ensemble, mais il est difficile de discerner les contributions individuelles de types de cellules touchées par maladie. Imagerie des tissus rétiniens isolés ex vivo permet de contourner ces problèmes et tandis qu’imaging plate montés rétines offre une vue sur la rétine externe¹³, plus profonds intérieurs caractéristiques rétiniennes sont obscurcies. Tranches de rétinal transversal, telles que celles présentées dans fixe des analyses immunohistochimiques, permettent une vision claire de tous les calques et les types de cellules mais seulement offrent un aperçu unique des processus dynamiques impliqués dans la maladie et de la fonction normale.

Nous présentons ici une méthode pour générer des ex vivo transversal rétinienne tranches de poisson-zèbre adulte pour l’imagerie. Il est similaire aux méthodes employées pour préparer des amphibiens et des poissons zèbres tranches rétiniennes pour^14,des études électrophysiologiques et morphologiques¹⁵, avec des modifications importantes pour le laps de temps d’imagerie ex vivo utilisant confocal microscopie. Réponses de la fluorescence des biocapteurs ou colorants en tranches sont surveillés en temps réel avec un microscope confocal tout en livrant des agents pharmacologiques à l’aide de perfusion. Alors que la méthode a été développée pour l’imagerie des photorécepteurs, il peut être possible de l’utiliser pour visualiser les cellules Müller, cellules bipolaires, les cellules horizontales, les cellules amacrines ou cellules ganglionnaires rétiniennes avec des marqueurs fluorescents appropriés. En outre, tranches peuvent être chargés avec des colorants fluorescents perméable à la cellule de la viabilité cellulaire rapport, transport vésiculaire, la fonction mitochondriale ou état redox. Cette préparation polyvalente permet la visualisation d’un large éventail de processus subcellulaires tout au long de la rétine, y compris Ca^{2 +} dynamique, transduction du signal et état métabolique.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été approuvés par l’Université de Washington animalier institutionnel et Comité d’urbanisme.

1. préparer les animaux et les matériels

Remarque : L’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) est une feuille sombre du tissu entourant l’extérieur de la rétine dont la pigmentation peut obscurcir caractéristiques rétiniennes et endommager les tissus lorsque ex vivod’imagerie confocale. Dans l’obscurité, la RPE de poisson-zèbre est rentrée de la rétine ; obscurité adapter poisson pour faciliter le retrait futur du RPP de la rétine avant de trancher et de l’imagerie.

1. Transférer les poissons dans un réservoir de frai rempli d’eau de poissons, puis envelopper le réservoir frai avec tissu foncé ou placez-le dans un placard sombre.
   1. Obscurité adapter zebrafish pendant au moins 1 h avant l’euthanasie pour permettre à près la séparation complète du RPP de la rétine. adaptation à l’obscurité 30 min est suffisante pour enlever la plupart des RPE, bien que les morceaux de celui-ci peuvent rester intercalées entre les photorécepteurs.
2. Faire fondre le ~ 15 mL de pétrole gelée dans un bécher de 50 mL sur une plaque chauffante et puis dessinez 3 mL du liquide dans une seringue de 3 mL de glissement. Inverser la seringue, placer dans un tube à essai rack et permettre à la gelée de pétrole refroidir.
3. Faire une chambre de tranchage réutilisable sur une lame de microscope ordinaire 7 X 2,5 cm.
   1. À l’aide de vernis à ongles transparent, lignes étroites de peinture pour créer un rectangle de 3 X 2,5 cm dans le centre de la diapositive, laisser sécher et puis ajoutez une autre couche de vernis à ongles aux lignes.
4. Préparer des échelles d’imagerie sur les lamelles de tenir les tranches en imagerie. Les tranches seront formeront les « barreaux » de l’échelle.
   1. Pour l’imagerie statique ou expériences d’injection avec écoulement de la solution minimale, faire vaseline échelles constituée de deux bandes parallèles plates larges de vaseline sur les lamelles de 18 mm en verre. Utiliser la seringue pour appliquer deux aplati ~ frottis long de 1 cm de vaseline refroidi à 0,5 cm de distance sur la lamelle couvre-objet.
5. La coupeuse de tissu est prêt.
   1. Nettoyer une lame de rasoir double avec de l’éthanol et laisser sécher à l’air. Coupez-le en quartiers avec des ciseaux, tout d’abord longitudinalement en deux moitiés, puis sur chaque lame.
   2. Placez la chambre tranchage sur la scène de la coupeuse de tissu, centrez-le horizontalement sur la scène et marquez un long bord avec un marqueur permanent pour l’alignement.
   3. Charger une section de la lame sur le bras de coupeuse de tissu, s’assurer que la lame se trouve plates et centré sur la diapositive sans toucher le vernis à ongles, puis serrez légèrement l’appareil de la lame. Abaisser le bras de lame en ajustant le bouton ¼ tourner, puis placer un morceau de papier filtre dans le centre de la chambre de l’imagerie et l’épreuve Coupez-le. Si le papier n’est pas coupé entièrement par le biais, remonter la lame.
6. À l’aide de la seringue, placez un seul petit point de vaseline refroidi dans une boîte de Pétri 10 cm ~ 1,5 cm à droite du centre. Appuyez sur une échelle d’imagerie à l’aide de forceps avec la gelée de pétrole vers le haut. Faire un autre petit vaseline dot ~ 1 cm du bord d’entrée de la chambre d’imagerie.
7. Adapter la seringue de gelée de pétrole avec une aiguille de 20g et il décapsuler. Tenez l’aiguille sur la seringue et en profite pour faire deux bandes parallèles longues et minces de 1 cm de gelée de pétrole sur la longueur au centre de la chambre de tranchage. Les bandes d’espace ~ 1 cm de distance.
8. Faire un outil de boucle de œil fil réutilisable en enveloppant le centre d’un ~ segment de 4 cm de fil de tungstène 30 g autour d’une paire de fois bien fermée forceps. Ajuster le diamètre de la boucle en faisant glisser le fil vers le haut ou vers le bas la pince jusqu'à ce qu’il est légèrement plus grand qu’un oeil de poisson-zèbre, généralement ~ 2-3 mm. Torsadez les extrémités des fils et les fixer à l’extrémité d’un bâton en bois de 6 cm à l’aide de ruban de laboratoire.
9. Préparer une solution de Ringer.
   1. Décongeler les 50 X supplément solution mère (tableau 1) et ajoutez-le fraîche à une solution de Ringer tampon HEPES, non-bicarbonate (tableau 2), le matin de l’expérience ; diluer 200 µL de solution mère de supplément dans chaque 10 mL de solution de Ringer dans un tube à centrifuger conique ou une bouteille en verre stérile. Pour des expériences d’imagerie statiques, préparer au moins 30 mL de solution de Ringer par expérience. Le volume de solution de Ringer, nécessaire pour les expériences de perfusion dépendra du débit et le temps total d’expérience.
   2. Vérifier que le pH de la solution supplémenté est de 7,4 à l’aide d’une sonde pH numérique ou papier pH et ajuster en conséquence avec diluer NaOH ou HCl.
   3. Oxygéner supplémenté de Ringer sur glace par barbotage avec 100 % de gaz oxygène pendant au moins 5 min à l’aide d’un réservoir d’oxygène thérapeutique standard et régulateur équipé d’un tuyau ou le collecteur de barboteur gaz facultatif utilisé pour la perfusion. Stocker la solution de Ringer oxygénée sur glace dans un tube à centrifuger conique étanche ou une bouteille de verre stériles près le microscope à dissection ; Utilisez cette solution pour la dissection, imagerie et pour diluer les teintures ou agents pharmacologiques.
   4. Si les autres solutions sont utilisées dans l’expérience, tels que Na⁺-gratuit solution de Ringer (tableau 3), répétez les étapes 1.9.1.-1.9.3.
10. Recueillir des boîtes de Pétri, forceps, micro-ciseaux et autres outils près le microscope à dissection et préparez un bain d’eau glacée de poisson zebrafish euthanasie.

2. préparation des tranches rétiniennes (voir Figure 1)

1. Travail sous un éclairage ambiant rouge afin de minimiser l’adaptation de lumière (qui peut rendre le bâton pre plus étroitement à la rétine), euthanasier zebrafish par immersion dans un bain de glace jusqu'à ce que la réponse tactile est perdue, généralement 1 à 2 min. transférer les poissons dans une boîte de Pétri et utiliser un scalpel pour doivent disloquer mais pas décapiter le poisson.
2. Desserrez tissu conjonctif autour d’un œil la boucle, puis tirez sur l’oeil en avant doucement avec la boucle dans une main. En revanche, à l’aide de micro-ciseaux couper le nerf optique blanc sous l’oeil, en prenant soin de ne pas pour couper le fond de le œil.
3. Transférer le œil avec une pincette pour une boîte de Pétri de solution de Ringer froid sur la glace et répéter pour le deuxième œil. Gardez les yeux dans l’obscurité ou sous lumière rouge jusqu'à ce que le pre est supprimé de la rétine.
4. Disséquer les œilletons sous un microscope de dissection de faible puissance dans une goutte de solution de Ringer froid sur une lame de verre plat dans une boîte de Pétri.
   1. Percer la cornée avec une pince fine, puis retirez délicatement les morceaux de claire et cassante cornée et sclérotique argenté avec une pince ou des ciseaux. Retirez et jetez la lentille et la plupart de la sclère (voir Figure 1 a) et gérer le œilleton isolé minimalement.
   2. Morceaux de graisse, petites portions de la sclère ou RPE noir peuvent rester attachés à le œilleton et retiré de la rétine plus tard. Si la rétine détache la RPE à l’étape 2.4.1, aller de l’avant avec les mêmes étapes à l’aide de redoubler de prudence ne pas d’endommager la rétine sensible isolée.
   3. Position ouverte côté œilleton (pre vers le haut) sur la diapositive et les couper en tiers ou quarts avec un grattoir à lame unique fraîche en un seul mouvement (voir Figure 1 b). Jeter des morceaux de tissu qui sont fortement courbées.
5. Rétine Mont plat sur un papier filtre.
   1. Mouillez un morceau de papier filtre avec une solution de Ringer et placez-le sur la diapositive à côté les morceaux de le œilleton. Faire pinces plates en manipulant le papier-filtre humide intact afin d’éviter toute perforation il. Ajouter une solution de Ringer froid pour couvrir le filtre papier et le tissu.
   2. Avec une pincette dans chaque main, glisser avec précaution le papier-filtre sous chaque pièce œilleton avec le RPE et photorécepteurs vers le haut, c'est-à-dire avec l’arrière de le œil vers le haut. Placer les morceaux de le œilleton en une seule ligne le long du centre du papier filtre (voir Figure 1). Gérer les morceaux œilleton doucement avec une pince fine seulement près d’un bord ou un coin.
   3. Pour aider les rétines à respecter le papier filtre, placez le papier filtre mouillé sur une serviette en papier sèche pour 3 s à évacue l’humidité vers le bas, mais ne pas laisser le tissu s’assèchent. Répétez jusqu'à ce que les morceaux de le œilleton se trouvent plat sur le papier filtre. Application légère succion sur le dessous du papier-filtre aide aplatir la rétine, mais cette étape n’est pas essentielle.
6. Si noirs feuilles de RPE restent sur les pièces de le œilleton, utiliser des pinces fines à éplucher doucement à partir d’un coin (voir Figure 1) tandis que le tissu est assis dans une goutte de solution de Ringer. Devrait la rétine décoller le papier filtre, répéter l’étape mèche en 2.5.3. La rétine peut sembler rose due à des pigments visuels écrus.
7. Répétez la dissection de la rétine et plat montage étapes de 2,4 à 2,6 pour le deuxième œil, si vous le souhaitez, garder la rétine premier plat monté, immergée dans une solution de Ringer froid. Afin de simplifier la procédure de découpage en tranches, morceaux des deux rétines peuvent être placés sur un papier filtre. Après avoir retiré la RPE, le protocole est réalisable sous une lumière ambiante normale à moins que les expériences nécessitent des ténèbres.
8. Placer le papier filtre dans une diapositive et ajuster en un rectangle avec une lame de rasoir seul, laissant ~ 0,5 cm de papier filtre de chaque côté de la ligne des rétines. Déplacer le papier filtre à la chambre de tranchage préparée, pousser les bords du papier filtre long dans les lignes minces de vaseline à l’aide de pinces et immerger les rétines dans 3-4 gouttes de solution de Ringer froid.
   Remarque : Certains colorants, tels que des colorants lipophiles, sont chargés mieux en supports plat à ce stade avant de trancher. Ceux-ci peuvent être chargés, méchants loin avec un mouchoir et lavés dans la chambre de tranchage. Par exemple, C¹² 558/568 BODIPY intensément taches rétinienne cell membranes et segments externes photorécepteur (voir la Figure 4 a) lors du chargement à ~ 5 µg/mL pendant 15 min à température ambiante (en général de 23 à 27 ° C), suivie d’un lavage dans une solution de Ringer excès .
9. La chambre de tranchage de transfert à l’étape de trancheuse de tissu, placez le long du bord le long de la ligne tracée et fixer les extrémités de la chambre à la scène avec du ruban adhésif de laboratoire. Commençant à un bout, couper la rétine et le papier filtre en exerçant une pression ferme et douce sur le bras de tranchage. Vérifiez que la première tranche a été coupée entièrement, puis utilisez le micromètre à couper ~ 400 µm tranches.
10. Assemblez l’échelle d’imagerie.
    1. Place la chambre de tranchage avec des sections rétiniennes en tranches dans la boîte de Pétri de l’étape 1.7 adjacent à l’imagerie ladder (voir Figure 1E). Remplir le plat avec une solution de Ringer froid à submerger son contenu.
    2. À l’aide de pinces et de garder les tranches submergés, doucement transfert bandes de papier filtre et la rétine à l’échelle en le faisant glisser de la boîte de Pétri de gauche à droite. Prendre soin de ne pas pour toucher directement les rétines. Faire pivoter les tranches de 90° et d’enterrer les bords du papier filtre en gelée de pétrole.
    3. Positionner finement tranches rétiniennes à l’échelle avec une pince afin que les couches de la rétiniens sont clairement visibles sous le microscope à dissection (voir Figure 1). Pour obtenir des tranches à chaque extrémité de l’échelle, faire en sorte que le tissu est vers l’intérieur vers les tranches afin de minimiser le mouvement du tissu pendant l’injection ou le débit. Jeter les tranches rétiniennes qui ne sont pas bien respectées le papier filtre (voir la Figure 2 a).
11. Si vous le souhaitez, charger des colorants en tranches rétiniennes à ce stade et se laver dans une solution de Ringer excédentaire avant l’imagerie.
    Remarque : L’iodure de Propidium (PI) et Hoechst 33342 robustement tacher noyaux de morts et de toutes les cellules, respectivement (voir Figure 2 b), incubés avec tranches rétiniennes à 5 µg/mL pendant 20 min à température ambiante. Tétraméthylrhodamine (TMRM) s’accumule dans les mitochondries activement respiration tout au long de la rétine lorsque incubés à 1 nM pendant 30 min à température ambiante.
12. Pendant que les tranches sont de coloration, préparer les appareils d’imagerie de la chambre et l’injection. Utiliser la seringue pour rincer le tube avec une solution de Ringer et purger les bulles, fixer l’extrémité ouverte du tuyau à l’entrée d’imagerie de la chambre et fermer le robinet. Retirer la seringue et remplissez-le de présenter pour l’injection, puis rattacher au tuyau.
13. Forceps permet de transférer la lamelle avec tranches rétiniennes à la chambre d’imagerie, poussant la lamelle vers le point de gelée de pétrole près du bord de l’entrée de la chambre d’imagerie (voir la Figure 1 H). Remplir la chambre d’imagerie avec une solution de Ringer pour couvrir les tranches.

3. imagerie rétiniennes tranches

1. Placez la chambre remplie d’imagerie avec le dispositif d’injection connectés sur la scène d’un microscope confocal vertical équipé d’une eau de 20 ou 40 X lentille de trempage. Fixez la chambre d’imagerie avec des clips de la scène.
2. Abaisser la lentille du plongement sur l’échelle et se concentrer sur une tranche à une extrémité de l’échelle sous faible lumière trans-éclairé. Examinez chaque tranche pour orientation transversale, présence des segments externes des photorécepteurs et adhérence sécurisée sur le papier filtre.
3. Sélectionnez la meilleure tranche pour l’imagerie de laps de temps et configurer le logiciel de microscope pour l’acquisition d’images de temps écoulé. Tableau 4 donne un aperçu des paramètres d’imagerie typiques pour les différents marqueurs fluorescents et colorants.
   Remarque : Le taux d’acquisition d’images variera selon le microscope, marqueur fluorescent et des processus biologiques à l’étude. Par exemple, utiliser une cadence de 10 s, 2 vitesse de balayage de µs/pixel et résolution 800 x 800 pixels pour l’imagerie dynamique du calcium dans les photorécepteurs avec GCaMP3 et un colorant rouge.
   1. Le cas échéant, utiliser le logiciel pour tracer des repères physiques dans l’écaille (segments externes des photorécepteurs, corps cellulaires, noyaux) pour faciliter la réorientation éventuelle pendant le laps de temps. Également mis en place le logiciel pour surveiller en temps réel par fluorescence dans l’ensemble de la tranche.
4. Commencer l’imagerie et surveiller la fluorescence de la ligne de base. Lorsque fluorescence dans l’ensemble de la tranche se stabilise (généralement moins de 2-5 min), procéder à l’expérimentation. Pour injection, ouvrir le robinet de la seringue, puis lentement enfoncer et faire reculer le piston double à l’aide de mélange.
   NOTE : par exemple, supprimer la fonction mitochondriale en injectant une solution concentrée de la protonophore CCCP pour atteindre une concentration finale de 1 µM dans la salle d’imagerie. Ceci induit une robuste Ca^{2 +} fait irruption dans le cytosol de photorécepteur rapporté par GCaMP, puis une diminution constante au potentiel de membrane mitochondrial rapporté par TMRM.
5. Suivre de près les tranches de la dérive pendant l’expérience et utiliser le logiciel pour faire des micro-ajustements selon les repères physiques. Généralement dériver dans la direction Z pendant l’injection ou la perfusion est < 5 µm.

4. imagerie rétiniennes tranches au cours d’expériences de perfusion où les solutions sont modifiées ou coulées en continu

Remarque : Imagerie rétinienne tranches au cours d’expériences de perfusion lorsque les solutions sont changées ou coulé en continu est semblable à la configuration pour des expériences d’imagerie ou injection statiques, avec les modifications suivantes.

1. Au lieu de la gelée de pétrole échelles décrits à l’étape 1.4, utiliser des échelles de cire pour tranches rétiniens stable durant l’écoulement de la solution.
   1. Placer les deux petits cylindres parallèles de cire dentaire non aromatisé ~ 0,5 cm de distance sur un lamelle couvre-objet. Sur une surface plane, appuyez chaque cylindre puis vers le bord parallèle de la lamelle à l’aide d’un pouce. Marquer les deux cylindres aplaties horizontalement avec un lamelle couvre-objet #1 (voir la Figure 1E, côté droit) puis enduisent une fine couche de gelée de pétrole entre les bandes de cire avec une spatule.
   2. Lors du montage de l’échelle d’imagerie à l’étape 2.10.2, appuyez sur les bords du papier de filtre en tranches dans les scores de cire à l’aide de pinces fines (Figure 1).
2. Pour mettre en place une perfusion à l’étape 2.12, remplir les réservoirs de seringue avec preoxygenated solutions, ou utiliser le collecteur de gaz en option pour oxygéner les solutions dans chaque réservoir. Purger tous les tuyaux avec une solution de Ringer, s’assurer que toutes les lignes de flux lorsque ouverte et purge des grosses bulles.
3. Avant de remplir la chambre d’imagerie à l’étape 2.13, utilisez la seringue au lieu d’un autre point de gelée de pétrole sur chaque coin exposée de la lamelle couvre-objet pour l’empêcher de glisser latéralement au cours de l’écoulement.
4. Lorsque la chambre d’imagerie est remplie et montée sur la platine du microscope, allumer l’aspirateur et raccordez le tuyau de l’aspirateur. Tester le flux de solution de Ringer et l’autre permet de situer le tube de l’aspirateur au-dessus de la chambre de sortie afin que les petites quantités de liquide sont débourbées avant que la chambre déborde (généralement ~ 1 mm au-dessus de la surface de la solution pour un débit de 2 mL/min). Garder une solution de Ringer qui coule tout en sélectionnant les tranches à l’étape 3.4.
5. Pour mener l’expérience à l’étape 3.4 pour perfusion, passer le flux des solutions en fermant le robinet d’arrêt de la première solution lors de l’ouverture de la deuxième solution.
   1. Par exemple, pour épuiser extracellulaire Na⁺ de la chambre d’imagerie, utiliser deux réservoirs de seringue remplies de solution de Ringer ou de Na⁺-gratuit solution (tableau 3). Couler une solution de Ringer pour établir la ligne de base, puis basculez vers Na⁺-solution sans. Cela se traduit par grand Ca cytosolique^{2 +} augmente dans les segments externes des photorécepteurs et de corps cellulaires (voir Figure 4).
6. Pour les systèmes de perfusion gravitaire, surveiller le niveau de solution dans chaque réservoir donc le débit est constant au cours de l’imagerie. Couronner de réservoirs selon les besoins avec les solutions oxygénées ou d’entretien continu d’oxygène bouillonnant avec le collecteur de gaz.

Résultats

Un positionnement stable et l’orientation transversale de tranches sont essentiels à l’imagerie réussie avec injection ou perfusion d’agents pharmacologiques. Examiner soigneusement et repositionner les tranches avant l’imagerie confocale selon les besoins pour s’assurer que toutes les couches rétiniennes sont visibles (Figure 2 a, tranche ii). Si une tranche est tournée légèrement vers l’avant (Figure 2 a, tran...

Discussion

Ex vivo imagerie rétinienne tranches de poisson zèbre fraîche s’est avéré pour être un outil polyvalent pour l’étude des photorécepteurs biologie^20,21,22et est unique parce qu’il permet l’analyse des cellules individuelles dans un âge mûr, entièrement rétine différenciée. Avec la pratique, il est possible de réaliser des expériences multiples avec des tissus provenant d’un seul poisson, même e...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
zebrafish	Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility		stocks maintained in-house as stable transgenic lines
petroleum jelly	Fisher Scientific	19-090-843	for petroleum jelly syringe
3-mL slip tip syringe	Fisher Scientific	14-823-436	for petroleum jelly syringe
20g 3.8 cm slip tip needle	Fisher Scientific	14-826-5B	for petroleum jelly syringe
plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide	Fisher Scientific	12-550-A3	for eyecup dissection, slicing chamber
Seche Vite clear nail polish	Amazon	B00150LT40	for slicing chamber
18 mm X 18 mm #1 glass coverslips	Fisher Scientific	12-542A	for imaging ladders
unflavored dental wax	Amazon	B01K8WNL5A	for imaging ladders
double edge razor blades	Stoelting	51427	for tissue slicing
tissue slicer with digital micrometer	Stoelting	51415	for tissue slicing
filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size	EMD Millipore	HAWG01300	filter paper for mounting retinas
10 cm petri dish	Fisher Scientific	FB0875712	for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly
15 cm plain-tipped wood applicator stick	Fisher Scientific	23-400-112	for wire eye loop tool
30g (0.25 mm diameter) tungsten wire	Fisher Scientific	AA10408G6	for wire eye loop tool
D-glucose	Sigma Aldrich	G8270	component of supplement stock solution
sodium L-lactate	Sigma Aldrich	L7022	component of supplement stock solution
sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256	component of supplement stock solution
L-glutamine	Sigma Aldrich	G3126	component of supplement stock solution
L-glutathione, reduced	Sigma Aldrich	G4251	component of supplement stock solution
L-ascorbic acid	Sigma Aldrich	A5960	component of supplement stock solution
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	component of Ringer's solution
KCl	Sigma Aldrich	P9333	component of Ringer's solution
CaCl2 · 2H2O	Sigma Aldrich	C3881	component of Ringer's solution
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S8282	component of Ringer's solution
MgCl2 · 6H2O	Sigma Aldrich	M0250	component of Ringer's solution
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	component of Ringer's solution
Tris base	Fisher Scientific	BP152	component of Na+-free Ringer's solution
6 N HCl	Fisher Scientific	02-003-063	component of Na+-free Ringer's solution
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5655	component of Na+-free Ringer's solution
50 mL conical centrifuge tube	Denville Scientific	C1062-P	container for Ringer's solution
Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades	World Precision Instruments	501790	micro-scissors for eyecup dissection
Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips	World Precision Instruments	504510	fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation
single edge razor blades	Fisher Scientific	12-640	for eyecup dissection and trimming filter paper
EMD Millipore filter forceps	Fisher Scientific	XX6200006P	flat forceps for handling wet filter paper
C12 558/568 BODIPY	Fisher Scientific	D3835	stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature
propidium iodide (PI)	Fisher Scientific	P3566	stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Hoechst 33342	Fisher Scientific	62249	stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)	Fisher Scientific	T668	stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature
tissue perfusion chamber	Cell MicroControls	BT-1-18/BT-1-18BV [-SY]	imaging chamber for injection or perfusion
2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG)	Fisher Scientific	N13195	fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia
Olympus laser scanning confocal microscope	Olympus	FV1000	confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution
Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP)	Sigma Aldrich	C2759	experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM
miniature aspirator positioner	Cell MicroControls	FL-1	for perfusion
perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder	Warner Instruments	various	for perfusion