رقائق موائع جزيئية لنثر الخفيفة الديناميكية في الموقع حيود الأشعة السينية كريستال و في الموقع لعلم البلورات المسلسل

Summary

ويصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية تلفيق وتشغيل أجهزة موائع جزيئية لجمع البيانات حيود الأشعة السينية في درجة حرارة الغرفة. بالإضافة إلى ذلك، فهو يصف كيفية رصد تبلور البروتينات التي تشتت الضوء الحيوي والحصول على كيفية معالجة وتحليل البيانات الحيود.

Abstract

ويصف هذا البروتوكول تصنيع أجهزة موائع جزيئية مع خلفية الأشعة السينية منخفضة الأمثل جونيوميتير على أساس الهدف الثابت المسلسل علم البلورات. الأجهزة هي منقوشة من الغراء الإيبوكسي باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة، وهي مناسبة في الموقع تجارب حيود الأشعة السينية في درجة حرارة الغرفة. الآبار العينة هي غطاء على كلا الجانبين مع windows إحباط بوليميد البوليمرية التي تتيح جمع البيانات حيود مع خلفية الأشعة السينية منخفضة. يعد هذا الأسلوب تلفيق المتساهلة وغير مكلفة. بعد مصادر رقاقة سيد سو-8، يمكن إكمال تصنيع جميع خارج تنظيم في بيئة معمل بحوث نموذجية. استخدام بروتوكول تصميم وتصنيع الرقائق أحكام بصمام الشعرية إلى ميكروفلويديكالي تقسيم فعل مائي إلى قطيرات نانولتر محددة الحجم. هذه الآلية تحميل يتجنب فقدان عينة من قناة الميت-حجم، ويمكن بسهولة أن يؤديها يدوياً دون استخدام المضخات أو غيرها من المعدات ليشتغل السوائل. يصف لنا قطرات نانولتر الحجم كيف معزولة من حل البروتين يمكن أن تكون المراقبة في عين المكان بضوء دينامية تناثر التحكم البروتين كريستال التنو والنمو. بعد أن تزرع البلورات مناسبة، يمكن جمعها datasets حيود الأشعة السينية كاملة باستخدام جونيوميتير على أساس في الموقع المحدد الهدف الأشعة السينية المسلسل البلورات في درجة حرارة الغرفة. وينص البروتوكول على البرامج النصية المخصصة لمعالجة مجموعات البيانات الحيود باستخدام مجموعة من أدوات البرمجيات لحل وتحسين بنية بلورية البروتين. ويتجنب هذا النهج التحف ربما فعل أثناء البرد--الحفاظ على أو كريستال دليل المناولة في تجارب علم البلورات التقليدية. نحن الحاضر ومقارنة ثلاثة هياكل البروتين التي كانت تحل باستخدام بلورات صغيرة بإبعاد حوالي 10-20 ميكرومتر نمت في رقاقة. بلورة وديفراكتينج في الموقع، المناولة والميكانيكية ومن ثم يتم تصغير اضطرابات بلورات هشة. تفاصيل البروتوكول كيفية تلفيق رقاقة موائع جزيئية شفافة الأشعة سينية مخصص مناسب للبلورات المسلسل في الموقع . كما يمكن أن تستخدم تقريبا كل كريستال لجمع البيانات الحيود، هذه رقائق موائع جزيئية أسلوب توصيل كريستال فعالة جداً.

Introduction

معرفة هيكل ثلاثي الأبعاد للبروتين ضروري لفهم وظيفتها. حتى الآن الحصول على هياكل القرار قرب الذري هي الأكثر شيوعاً بالبلورات بالأشعة السينية. وهذا الأسلوب يعرض البلورات البروتينية للإشعاع بالأشعة السينية وثم يتم تحليل أنماط الحيود الناتج لتصميم الهيكل والصقل. في البلورات بالأشعة السينية التقليدية، يتم تسجيل dataset حيود كاملة من كريستال وحيد وكبير ومن الناحية المثالية، عند درجات حرارة المبردة. هذه البلورات، ومع ذلك، ليست معظمها تافهة لتنمو، وتحديد شروط مناسبة البرد--الحفاظ على يمكن أن يصبح تحديا في حد ذاته، وقد يتسبب أيضا في بعض الأحيان الانحرافات من هيكل البروتين الأصلي⁵.

أتاحت التطورات التكنولوجية الأخيرة في أشعة ليزر الإلكترون الحر (FEL) وبيملينيس السنكروتروني حل هياكل من بلورات أصغر، كالجديد بيملينيس التركيز الجزئي، شعاع الأشعة السينية زيادة تألق، وأصبح تحسين أجهزة كشف بالأشعة السينية تتوفر^6،7. بشكل عام، يسهل بلورات صغيرة تنمو من كبير وعيب بلورات الحرة^8،9. ومع ذلك، بلورات صغيرة تعاني من الأشعة السينية الإشعاع الضرر أسرع بكثير من بلورات كبيرة. هذا سبب بلورة كبيرة بالمقارنة مع، يجب توقع أعلى جرعة الأشعة سينية كريستال إلى حجم أصغر ديفراكت إلى قرار مماثل. ولذلك، كثيرا ما لم يتم حماية المبردة حتى كافية لتسجيل مجموعة من بيانات حيود كاملة من ميكروكريستال واحد.

للتغلب على هذه العقبة، أصبح علم البلورات المسلسل الأسلوب المفضل لجمع ودمج أنماط الحيود من العديد من ميكروكريستالس عشوائياً موجها للحصول على مجموعة كاملة من بيانات. الإشعاع هو التقليل إلى أدنى حد الأضرار العمدي كريستال بنشر إجمالي جرعة الأشعة السينية المستخدمة لحل بنية بروتين على عدد كبير من بلورات^5،10. في 'ديفراكت قبل تدمير' تجربة FEL، كل الكريستال يستخدم فقط لواحد من التعرض باستخدام نبضات الأشعة السينية فيمتو ثانية. بيملينيس الصغير-التركيز على المصادر السنكروتروني الجيل الثالث بدوره يمكن أن تؤدي البلوري المسلسل مع بضع ميلي ثانية واحدة قصيرة الأشعة السينية التعرض^11،12،،من¹³¹⁴. دون التذبذب الكريستال أو التناوب أثناء جمع البيانات، ومع ذلك، يمكن تسجيل إلا جزئيا براج تأملات ومن ثم عشرات الآلاف أو أكثر من أنماط الحيود مطلوبة عادة ل تصميم هيكل¹⁵. وحتى الآن، وضعت مجموعة متنوعة من أساليب تقديم عينة لعلم البلورات المسلسل، كما تمت مراجعتها مؤخرا^14،،من^1617،،من¹⁸¹⁹. بين تلك، أساس هدف ثابت عدة تسليم نموذج استراتيجيات تم بنجاح جنبا إلى جنب مع تناوب الكريستال أثناء التعرض للأشعة السينية أن إلى حد كبير أنماط الحيود أقل يمكن أن توفر أيضا مجموعات كاملة حين أيضا تستهلك أقل عينة مقارنة لعلم البلورات المسلسل الكلاسيكي سجلت التجارب التي تكون فيها الصور الثابتة^7،16،،من^2021،،من^{2223 , 24}.

نقدم بروتوكولا لاختلاق أجهزة موائع جزيئية مع خلفية الأشعة السينية منخفضة. الأجهزة هي منقوشة من الغراء الإيبوكسي 5-دقيقة باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة وهي مناسبة لتجارب حيود الأشعة السينية في الموقع في درجة حرارة الغرفة التي تستفيد من دمج إعداد عينة مباشرة في إنشاء الأشعة السينية، كما الحال مع حل وقت الدراسات التي تتبع حركية الناجمة عن خلط^18،19. قنوات موائع جزيئية هي غطاء على كلا الجانبين مع إحباط بوليميد البوليمرية، أسفر عن الأشعة السينية ويندوز مع سمك مجتمعة حوالي 16 ميكرومتر التي تسمح لتصوير خلفية الأشعة السينية منخفضة. توفر جميع المواد المستخدمة جيدة مقاومة للمذيبات. يعد هذا الأسلوب تلفيق بسيطة وغير مكلفة نسبيا. بعد مصادر رقاقة سيد سو-8، يمكن إكمال تصنيع جميع خارج تنظيم في إعداد مختبر بحوث نموذجية.

في مثال على تطبيق، ونحن تصف رقائق goniometer تستند إلى هدف ثابت المسلسل علم البلورات. أولاً، يتم مناقشة اعتبارات التصميم والتصنيع باستخدام أحكام بصمام الشعرية إلى ميكروفلويديكالي تقسيم فعل مائي في عدد مختار من قطرات نانولتر الحجم. هذه الآلية تحميل يتجنب فقدان عينة من قناة الميت-حجم وتقسيم يمكن بسهولة إجراء يدوياً دون استخدام المضخات أو غيرها من المعدات ليشتغل السوائل. هذه قطرات معزولة نانولتر الحجم من حل البروتين المراقبة في الموقع باستخدام تشتت الضوء الحيوي (DLS) لمراقبة البروتين كريستال التنو والنمو. وقد ثبت سابقا أنه يمكن إجراء قياسات DLS في أجهزة موائع جزيئية تتكون من بنية بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) المستعبدين إلى^25،شرائح زجاجية²⁶. لأن طبقة بوليميد إرسال عالية لأطوال موجية أطول من 550 نانومتر، النهج الذي يمكن توسيعه للقياسات في الأشعة السينية رقائق شفافة أيضا، عند استخدام^27،الطول موجي ليزر مناسبة²⁸. استناداً إلى نتائج دائرة الأراضي والمساحة، ويمكن ملاحظة نويات أولية، ويمكن وقفها مزيد الحبرية التبخر للحصول على بلورات البروتين أقل ولكن أكبر.

بعد أن تزرع البلورات كافية، مجموعات كاملة من حيود الأشعة السينية يمكن ثم جمعها باستخدام جونيوميتير على أساس في الموقع المحدد الهدف الأشعة السينية المسلسل البلورات في درجة حرارة الغرفة. وتجهز حيود مجموعات البيانات باستخدام مجموعة من أدوات البرامج والبرامج النصية المخصصة لحل بنية بلورية البروتين. هذا الأسلوب يتجنب المصنوعات اليدوية غالباً ما فعل أثناء البرد--الحفاظ على المستخدمة في التجارب علم البلورات التقليدية.

قارنا ثلاثة هياكل الهدف البروتين التي تم حلها باستخدام حول 10-20 ميكرومتر بلورات صغيرة تزرع في رقاقة للقرار Å أفضل ثم 2. بلورة وديفراكتينج في الموقع، المناولة والميكانيكية ومن ثم يتم تصغير اضطرابات بلورات هشة. يمكن تطبيق هذا البروتوكول للبلورات البروتينية التي ديفراكت بدقة عالية، فضلا عن دقة منخفضة (1.7 Å إلى 3.0 Å). كما يمكن أن تستخدم تقريبا كل كريستال الحيود، يضيع عينة صغيرة، مما يجعل هذا أسلوب توصيل كريستال فعالة جداً.

يوفر هذا البروتوكول دليل مفصل حول كيفية تحضير رقائق موائع جزيئية شفافة الأشعة السينية في الموقع البروتين تبلور والحيود جمع البيانات. الإجراء صمم بعناية الاستفادة من الدقة موائع جزيئية دون الحاجة إلى معدات متطورة في المعمل. أيضا، يمكن تنفيذ جمع البيانات في بيمليني السنكروتروني دون الحاجة إلى goniometer المتخصصة أو المرطب سهولة استنساخ النتائج غير الخبراء. يمكن تطبيق تقنية قدمت ميلي ثانية المسلسل البلوري جمع البيانات في درجة حرارة الغرفة مع الحفاظ على حد أدنى أضرار الإشعاع ودون إدخال الإجهاد للبلورات بعد نمو بالتعامل مع الحماية من البرد أو كريستال. ومن ثم فالاسلوب وصف مناسبة لأي مشروع بلورة البروتينات.

Protocol

1-رقاقة تصميم وتصنيع ماجستير

1. تصميم قناع
   1. مخطط الهندسات القناة المطلوبة باستخدام برنامج رسم CAD مناسبة. لكل طبقة مقاوم الضوء، وإعداد قناع فردية. جميع التصاميم المستخدمة في هذا البروتوكول وتناقش بالتفصيل في مقطع النتائج وتتوفر أوتوكاد '. دوغ ' تنسيق في التكميلية الملف 1.
      ملاحظة: لبناء PDMS جميع الأجهزة، لا ينبغي أن تتجاوز نسبة الارتفاع إلى العرض قناة 01:10 لمنع انهيار قناة. إحباط بوليميد وراتنج الإيبوكسي شُفي أكثر ثباتا ومن حيث المبدأ ينبغي أن تسمح أيضا نسب أعلى. ومع ذلك، نحن عمدا لا تتجاوز في 01:10 يمكن أن تكون نسبة، حيث أن الأولى تصاميم prototyped كأجهزة PDMS التقليدية.
   2. ترجمة ملفات CAD-مستحلب الفيلم فوتوماسكس. استخدام دقة ك نقطة في البوصة 64 اسمي لتمكين ميزات دقيقة وصولاً إلى حوالي 5 ميكرون حجم.
      ملاحظة: يمكن أن يتم ذلك من خلال خدمة تجارية. قد تفضل التصوير خدمات مختلف الاتفاقيات الرسم تنسيق ملف التحويل لتصوير قناع. يرجى الاستفسار عن الاتفاقيات الرسم المفضل مقدما لتجنب مشكلة شاقة في إطلاق النار أثناء عملية التحويل. سيكون نمط أقنعة مع ميزات شفافة على خلفية سوداء SU8 ميزات مقاوم الضوء على رقاقة تؤتي الوظيفية PDMS ميكروتشانيلس أثناء صب النسخ المتماثلة. بدوره، ميزات سوداء على خلفية شفافة أقنعة مطلوبة لإعداد قوالب PDMS مناسبة لتصنيع الرقائق بالأشعة السينية. ونحن نوصي يأمر كلا قطبية قناع للسماح بالمصادقة النماذج والتصميم في وقت مبكر اختﻻق أجهزة PDMS قبل ترجمة التصميم رقائق الأشعة السينية.
2. تصنيع SU8 الرئيسي
   ملاحظة: هذه هي العملية الوحيدة التي يلزم القيام بها في تنظيم. في حالة عدم توفر معدات تنظيم الحرجة، إكمال الخطوة يمكن الاستعانة بمصادر خارجية ممس مسبك خدمة الشركات التي تقدم جاهزة سادة SU8 منقوشة. SU8 العملية وفقا لتعليمات ورقة البيانات. تلخيص الخطوات 1.2.1 إلى 1.2.4 العام SU8 تلفيق الرئيسي سير العمل، مع المعلمات كاملة لتصميم رقاقة الأشعة السينية ثلاثة طبقة المدرجة في الجدول 1. مقدمة إلى SU8 متعدد الطبقات المحاذاة قد نشرت سابقا²⁹.
   1. مقاومة من أجل حوالي 1 مل SU8 على معطف يفر وتدور 3 بوصة SU8 وصولاً إلى سمك المطلوب باستخدام سرعة الدوران المناسب والوقت كما هو محدد في الجدول 1 (الشكل 1، الخطوة 1). قبل خبز مقاوم الضوء وفقا لسمك طبقة في 65 و 95 درجة مئوية لبضع دقائق. القيام خبز قبل يصلب SU8 لمنع ذلك التمسك النبائط وتحسين مقاومة الالتصاق بالركيزة (الشكل 1، الخطوة 2).
   2. كشف مقاوم الضوء للأشعة فوق البنفسجية-الضوء كما هو محدد في الجدول 1 تليها مرحلة ما exposure خبز عند 95 درجة مئوية لإكمال حفازة فوتوريكشن التي يتم تهيئتها من خلال التعرض (الشكل 1، الخطوة 3).
   3. كرر هذه الخطوات لكل طبقة اللاحقة. ثم قم بمحاذاة فوتوماسكس الطبقة اللاحقة مع سيد باستخدام قناع راصفة وقدمه ذات الورنيّة الورنيّة محاذاة علامات²⁹.
   4. يغسل SU8 لم يتعرضوا كل مقاومة بتطوير الرقاقة في البروبيلين غليكول الميثيل خلات خماسي البروم ثنائي الفينيل (بجميا)، حتى الايزوبروبانول الشطف لم يعد يكشف حليبي هطول الأمطار (الشكل 1، الخطوة 4). الجاف ليفر مع النيتروجين المضغوط.
      ملاحظة: الايزوبروبانول مذيب فقراء ل SU8 وهطول الأمطار، تشير إلى بقايا أونكوريد المتبقية.
3. تصنيع PDMS العفن
   1. ضع قطعة من رقائق الألومنيوم (15 × 15 سم) في طبق بتري (10 سم) وسيد SU8 على رقائق الألومنيوم في طبق بتري لسهولة إزالة الرئيسي بعد علاج PDMS.
   2. مزيج من السيليكون قاعدة مع علاج عامل (10:1)، أدى إلى مبلغ إجمالي قدرة 25 غ، بقوة مع ملعقة في جرة أو خالط ميكانيكية. رقاقة 3 بوصة في طبق بتري (10 سم) يستهلك حوالي 25 جرام PDMS أن يسفر عن 5 مم لوح سميك.
   3. من أجل PDMS قبل مختلطة على SU8-سيد (الشكل 1، الخطوة 5) إلى ارتفاع من 4 مم-ديسيككاتي PDMS لمدة 5 دقائق لإزالة فقاعات الهواء حتى لا، أو تبقى فقط بعض فقاعات على السطح PDMS.
   4. علاج PDMS في فرن عند 70 درجة مئوية ح 1. ثم قطع PDMS شُفي مع مشرط ولطف قشر العفن PDMS من سيد SU8 (الشكل 1، الخطوة 6). قطع كل الطريق وصولاً إلى الشكل الرئيسي لمنع الشقوق PDMS أثناء تقشير.
   5. اختياري: إعداد شرائح مستعرضة من قوالب PDMS للتأكد من أن كل الطبقات SU8 على الشريحة الرئيسية لها سمك المطلوب (الشكل 1). قناة موائع جزيئية المبكر تخطيط الاختبار يمكن أن يؤديها في جميع PDMS الرقائق.
      ملاحظة: يمكن أن الرهينة PDMS مصبوب النسخة المتماثلة مباشرة إلى ركيزة زجاج بعد اللكم منافذ الوصول (الخطوة 3، 3) إلى PDMS عن طريق س₂ بلازما التنشيط باستخدام 20 ثانية، 0.4 [مبر] س₂، 50 ث، 13.56 ميغاهرتز. وكما أشير في القسم 1.2.، وهذا يتطلب عكس قناع القطبية ومن ثم رقاقة المخطط التفصيلي لتصنيع الرقائق بالأشعة السينية.

2. في الموقع تصنيع الرقائق الأشعة السينية

1. يضعف كلا السلائف راتنج الإيبوكسي في الإيثانول إلى تركيز إيثانول نهائي من 40 wt %. مجموع كتلة 0.25 غرام من كل السلائف راتنج الإيبوكسي في الإيثانول يعتبر كافياً لشرائح² 1 سم واحد.
   ملاحظة: وهذا يقلل لزوجة الإيبوكسي 5 دقيقة الناتجة لتبسيط خالية من فقاعة خلط وصب النسخ المتماثلة-العفن، وتقليل سمك طبقة الإيبوكسي الشفاء النهائي. الإيثانول يتبخر عن طريق PDMS أثناء الخطوة علاج.
2. ديغا العفن PDMS في مجفف فراغ لمدة 30 دقيقة، ذلك لأنها يمكن أن تستوعب فقاعات الهواء الصغيرة من الراتنج الإيبوكسي خلال الخطوة صب.
3. قص إحباط بوليميد لحوالي 70 × 70 مم وتمتد حولها 75 × 50 مم زجاج شريحة باستخدام الشريط للحصول على سطح مسطح وجامدة مع الشريط في المؤخرة. تنشيط البلازما إحباط مع 50 ث، 13.56 ميغاهرتز، 0.4 البلازما₂ [مبر] س ل 20 ثانية، ثم احتضان إحباط-الشريحة كاملة في محلول مائي من المجلد 1% (3-أمينوبروبيل) تريميثوكسيسيلاني (ابتس) أو (3-جليسيديلوكسيبروبيل) تريميثوكسيسيلاني (جبتس) لمدة 5 دقائق في 20 درجة مئوية.
4. مزيج دقيق كلا الحلول السلائف الإيبوكسي الإيثانول المخفف لضمان سلوك المعالجة المثلى. استرداد PDMS-قوالب من فراغ الغرفة ووضعها على سطح مسطح. ثم بسرعة الاستغناء عن معالجة تجميعية راتنج مختلطة على كل المجهرية في القالب باستخدام ميكروبيبيتي (حوالي 10 ميليلتر كل 1 سم² من المجهرية) (الشكل 1، الخطوة 7 ألف).
5. استرداد شطيرة إحباط الشريحة بوليميد من الحل (ابتس أو خلال) سيلاني مائي. الجاف لإحباط مع الهواء المضغوط أو النيتروجين.
6. ضع شطيرة إحباط-الزجاج-الشريحة بوليميد مستعدة على راتنج الإيبوكسي المودعة (الشكل 1، الخطوة 7b). اضغط بقوة الشريحة الزجاجية يعلق على إحباط بوليميد ضد العفن PDMS. ضع ورقة معدنية على الشريحة الزجاجية ومن ثم إيداع الأوزان للضغط يصل إلى 1.4 N/سم² ح 1، بينما علاج راتنج الإيبوكسي في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: من الناحية المثالية، لا راتنج يبقى على إحباط في المجالات التي تتمتع فيها بنيات في العفن الارتفاع القصوى. وتناظر هذه الآبار بلورة البلورة تتم فيها بعد ذلك.
   1. اختياري: إذا صب دقيقة من ميزات الصغيرة أمر بالغ الأهمية، يمكن أن يتعزز العفن PDMS مع إطار ألومنيوم أثناء صب الخطوة³¹.
7. إزالة الشريحة الزجاجية وإحباط بوليميد الإيبوكسي منقوشة تقشير من العفن PDMS (الخطوة1 الشكل 8). بلازما تنشيط الجانب الإيبوكسي منقوشة مع 50 ث، 13.56 ميغاهرتز، 0.4 البلازما₂ [مبر] س ل 20 ثانية.
8. بعد إزالة إحباط بوليميد من غرفة البلازما، احتضان إحباط الإيبوكسي منقوشة في حل % ابتس مائي (أو جبتس) المجلد 1 لمدة 5 دقائق في 20 درجة مئوية. وبالمثل، يعد إحباط بوليميد الأمم المتحدة منقوشة ثانية مع تفعيل سيلاني % جبتس (أو ابتس) المجلد 1 تكميلية. بعد الاحتضان، الجاف لإحباط كل منظم وغير منظم بالهواء المضغوط.
9. ضع الإيبوكسي الجانب مواجهة على سطح مستو، استخدام التوتر السطحي لقطرة الماء تحت كوسيط لمنع الشباك إحباط وضمان أقصى حد التسطيح. ثم ضع إحباط بوليميد المنشط الثاني في الأعلى ومسحه بإصبعك من زاوية واحدة بعكس ذلك لجعلها على السندات وتجنب تكوين فقاعات بلطف.

3-الوصول إلى منافذ لتوصيل السوائل

1. إعداد 4 مم سميكة ألواح PDMS في طبق بتري وفقا للخطوات 1.3.1 إلى 1.3.3 دون استخدام SU8--ماجستير. قص لوح إلى كتل PDMS ذات الحجم المناسب لتغطية جميع مداخل الموانئ في الرقاقة، دون تغطية المقصورات تبلور الفردية للرقاقة.
2. تنشيط البلازما على حد سواء، الرقاقة و PDMS كتلة في 50 ث، 13.56 ميغاهرتز، 0.4 البلازما₂ [مبر] س ل 20 ثانية. للترابط الكيميائي، ثم احتضان كل جزء في المجلد 1% ابتس أو جبتس محلول لمدة 5 دقائق في 20 درجة مئوية. الجاف لكل جزء بالهواء المضغوط واضغط لوح PDMS على رقاقة إحباط.
3. لتحسين الترابط ووضع الرقاقة على لوح PDMS مسطحة، وتغطية ذلك بإحباط بلاستيكية، تليها شريحة زجاجية نظيفة وكتلة معدنية. وأخيراً، إيداع الأوزان للضغط يصل إلى 1.4 N/سم² لحوالي 1 ساعة.
4. لكمه لكمه ثقوب الوصول مع خزعة 0.75 ملم في كل موقف حيث يتم وضع علامة في تصميم رقاقة الموانئ مدخل ومخرج وختم ظهره بالشريط. الرقاقة الآن موجوداً لأي أنابيب مع قطر خارجي مطابقة قطر الحفرة (على النحو المفصل في الخطوة 4، 2).

4-السطحية في المعاملة

1. إعداد 01:20 إضعاف وزن 9% فلوروبوليمير الأسهم في المذيبات مخفضات لتركيز 0.45 في المائة بالوزن نهائي. تخزين الحلول الأسهم وتخفيف في ثلاجة في الظلام في 4 درجات مئوية.
2. تحميل في 01:20 إضعاف فلوروبوليمير في محقن 1 مل اللوير لوك. إرفاق 27 × 5/8 "إبرة للمحاقن، ومن ثم أنابيب PTFE إلى الإبرة.
3. توصيل الأنابيب إلى منفذ شريحة الأشعة السينية وحقن الحل العامل فلوروبوليمير إعدادها في الخطوة 4، 1 حتى يتم شغل جميع القنوات.
4. ضع الرقاقة مع الجانب المسطح لأسفل على لوحة ساخن 190 درجة مئوية لمدة 5 دقائق إلى تتبخر جميع المذيبات في إيداع في فلوروبوليمير في طلاء رقيقة.
   ملاحظة: عند استخدام هندسة جديدة، تحقق من إذا تم انسداد القنوات مع فلوروبوليمير خلال هذه العملية طلاء. إذا كان الأمر كذلك، كذلك تمييع الحل الأسهم.

5-إعداد البروتين

1. وزن ثوماتين المجففة بالتبريد وتذوب في حل المخزن مؤقت مدرجة في الجدول 2 بحجم مناسب للحصول على تركيز بروتين نهائي من 40 مغ مل^-1.
2. دياليزي إيزوميراز الجلوكوز ضد المخزن المؤقت المدرجة في الجدول 2 ووفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
3. إعداد ثيوريدوكسين البروتين كما هو موضح مسبقاً قبل شوبرت et al. ³⁰.
4. تحقق من تركيزات البروتين النهائي التغيرية باستخدام معاملات انقراض الملخصة في الجدول 2، حساب بواسطة البرنامج بروتبارام³².
5. إعداد جميع الحلول باستخدام الماء عالي النقاوة وتصفية لهم مع فلتر 0.2 ميكرون.
6. الطرد المركزي الحلول البروتين في 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في س 16100 ز، وتأخذ المادة طافية لبلورة التجارب.

6-البروتين تبلور في رقاقة الأشعة السينية

1. لبلورة البروتينات في رقائق موائع جزيئية، مزيج من كميات متساوية من البروتين الحل والحل مرسب. ويرد في الجدول 2تركيز البروتين وتكوين المخزن المؤقت ومرسب تكوينها. إعداد وحدة تخزين إجمالي من حوالي 20 ميليلتر لملء رقاقة موائع جزيئية.
2. فورا بعد الاختلاط، حقن الحل بمنفذ مدخل للرقاقة عن طريق حقنه، بالإضافة إلى 27 × 5/8 "إبرة وأنابيب PTFE مع القطر الخارجي 0.75 مم (مفصلة في الخطوة 4، 2).
   ملاحظة: يتطلب إجراءات ملء تخطيط المسلسل فتيلة مسبقة للرقاقة مع النفط المفلورة، والذي يتم أسهل عن طريق تحميل النفط المفلورة من المنفذ منفذ قبل الحقن الحل تبلور من خلال مدخل الميناء. جميع تحميل خطوات ينبغي رصد استخدام مجهر للتحكم في الضغط حقنه التطبيقية ومعدل تدفق المقابلة. "
3. بعد أن يتم تعبئة شرائح، فصل المقصورات تبلور الفردية عن طريق حقن النفط المفلورة في مدخل ميناء الرقاقة. ختم الرقاقة بحظر كافة منافذ مداخل ومخارج للرقاقة. قد يكون ذلك عن طريق إدراج مشبك الورق.
   ملاحظة: نظراً للمقصورات تبلور تمتلئ بحل البروتين/مرسب، النفط المفلورة فقط يملأ القناة مدخل للرقاقة، دون التأثير على الحل في المقصورات التبلور.
4. لتقليد بخار نشر بلورة حركية، ضع رقاقة مختومة في درجة الحرارة المحيطة والجو العادي للسماح الحبرية في حجرة التبلور تقليص بتبخر المياه من خلال إحباط بوليميد.
5. بعد كريستال ويلاحظ تكوين عبر مجهر أو DLS القياسات (الخطوة 7)، نقل رقاقة موائع جزيئية كاملة في حل مرسب المناسبة، وقف المزيد من التبخر من آبار تبلور حتى حيود الأشعة السينية يتم إجراء التجربة.

7-دينامية تناثر الضوء القياسات في الآبار تبلور في رقاقة

ملاحظة: أجريت قياسات DLS مع قوة ليزر ناتج من 100 ميغاواط، وموجه من 660 اكتشفت شمال البحر الأبيض المتوسط، وعلى ضوء متناثرة في زاوية تشتت 142 °. لأن كل نموذج التحقيق الحلول مائي الانكسار من المياه (n = 1.33) واستخدمت في جميع العمليات الحسابية.

1. رقاقة موائع جزيئية في مكان في تنسيق SBS بلايت حامل الصك دائرة الأراضي والمساحة باستخدام المحول هو موضح في الخطوة 8، 1. إدراج المحول في الجهاز.
2. عناية ضبط تركيز الليزر داخل حجرة رقاقة موائع جزيئية باستخدام يجهز x، y، z-المرحلة. لأن رقاقة موائع جزيئية رقيقة جداً، ضبط z-المستوى بتطبيق خطوات الزيادة الصغيرة.
   ملاحظة: يؤكد تكيف صحيح اعتراض عالية وذيل سلس مهمة ترابط تلقائي الناتجة من قياس DLS. يمكن إنشاء ملف معايرة يتطابق مع موقف كل بلورة الفردية في رقاقة موائع جزيئية، يسمح قياسات DLS الآلي في أماكن عديدة على مر الزمن.
3. تنفيذ كل قياس DLS في 293 ك ل 30 ثانية وتكرار قياس كل 5 دقائق حتى نهاية التجربة التبلور.
   ملاحظة: يمكن أن يتبع التنو الأولى بتوزيع نصف قطرها من القياسات DLS على مر الزمن، وتشكيل الكريستال ناجحة يمكن إلا متبوعاً بالتوازي مع المجهر بنيت في قارئ لوحة دائرة الأراضي والمساحة.

8-حيود جمع البيانات

1. محولات بيمليني المنقل
   1. طباعة المحولات ل goniometer لوحة الموقف وتدوير رقائق الأشعة السينية أثناء جمع البيانات بلورية.
   2. اختﻻق المحولات ل goniometer قاعدة على طابعة 3D هواية الصف باستخدام إعدادات المعلمة الافتراضية كما أوصت به الشركة المصنعة.
      ملاحظة: صممت المحولات باستخدام نظام 3D CAD وإرفاق الملفات تنسيق المحولات في '. STL '--تنسيق ملف بالملحق.
   3. إصلاح رقائق الأشعة السينية للمحول باستخدام شريط مزدوج الوجهين.
2. في الموقعية البلورات بالأشعة السينية
   1. جمع بيانات الحيود باستخدام حجم شعاع من 10 × 5 ميكرومتر (فوم الشخصية الضبابي) في 296 "ك. استخدام الأشعة السينية" مع طاقة 12.8 كيلو إلكترون فولط، وتدفق 2.2 · 10¹¹ الفوتونات · s^-1 في شعاع الموهنة وأنماط الحيود السجل باستخدام جهاز كشف بكسل هجين م 6 بيلاتوس بي سي.
      ملاحظة: تستخدم بلورات الجلوكوز إيزوميراز أو ثيوريدوكسين موائع جزيئية الأجهزة المحتوية على ثوماتين، في الموقع الأشعة السينية تجارب بلورية في بيمليني EMBL P14 من السنكروتروني "الثالث بترا". قد يختلف حجم تركيز شعاع المتاحة والتمويه في سائر مصادر الأشعة السينية. ويرد في الجدول 3عدد البلورات البروتينية المكشوفة، عدد أنماط الحيود المسجلة من كل بلورة ونطاق زاوية التذبذب في التعرض، ووقت التعرض.
   2. عملية تعيين نمط حيود متتالية اثنين على حدة باستخدام برنامج XDS³³. استخدام البرنامج النصي باش "xds.sh" الموجودة في الملحق.
   3. إنشاء ملفات HKL لكل مجموعة بيانات من جميع البلورات ومقياس لهم باستخدام البرمجيات XSCALE³³. استخدام البرنامج النصي باش "xscale.sh" في الملحق لإنشاء ملف إدخال إكسسكالي.
      ملاحظة: ينبغي تحجيم مجموعات البيانات فقط من البلورات التي لها معاملات الارتباط أكبر من 90 في المائة، مما يشير إلى وجود درجة عالية من تماثل،. › ‹I/σ (ط) معيار المحافظ (> 2) ينبغي أن تستخدم لتحديد شل القرار أعلى. يمكن استبدال الجزيئية باستخدام برنامج مولريب³⁴ من جناح CCP4³⁵ الحصول على مراحل لزيادة نموذج بناء باستخدام إحداثيات ثلاثي الأبعاد للبروتين مصرف بيانات (PDB) هو مبين في الجدول 3.
   4. صقل جميع الهياكل نظير استخدام Refmac5^35،36 واستخدام أبله³⁷ للتفتيش البصري للنموذج النهائي.
      ملاحظة: تضاف تلقائياً أثناء عملية صقل جزيئات المذيبات وتحتاج إلى فحص لتأكيد المواقف معقولة كيميائيا. يجب تفقد جميع النماذج لتحديد القيم المتطرفة راماشاندران.

9-بيانات التقييم

1. أضرار الإشعاع
   1. تحليل اضمحلال السلطة الحيود على مر الزمن باستخدام أسلوب وصف أوين وآخرون³⁸. لذلك، حساب مجموع I/σ(I) (التي قدمها XDS³³) من جميع الأفكار مفهرس لكل تقييم حيود dataset (2 نمط حيود على التوالي)، لاستخدامها كقيمة مرجعية. استخدام البرنامج النصي باش "ISigma.sh" من الملحق.
   2. تطبيع قوة حيود كل dataset إلى السلطة يعني حيود من مجموعة البيانات الأولى.
   3. تحليل تغيير قيم رميس على مر الزمن بأخذ القيم رميس من Correct.LP الملفات التي تم الحصول عليها من XDS³³ (سحق السيناريو "Rmeas.sh" من الملحق).
2. التوجه كريستال
   1. تحديد زوايا أويلر للحصول على معلومات حول توزيع لتوجهات كرستل فيما يتعلق بنظام الإحداثيات المخبرية. حساب زوايا أويلر من المصفوفة التوجه XDS في ملف الإخراج إكسبارم³⁹ باستخدام برنامج Matlab. استخدام البرنامج النصي باش "rotation_matrix.sh" لاستخراج مصفوفة التناوب من كل بلورة من الملف إكسبارم. استخدام ملف الإخراج كمدخلات في Matlab لحساب زوايا أويلر استخدام rotro2eu.m دالة Matlab (ملف تكميلي).
      ملاحظة: نشرت وصفاً مفصلاً للحساب بالنسبة زاريني وآخرون⁴⁰.
   2. تحويل زوايا أويلر التي تم الحصول عليها من التقدير الدائري إلى درجات. مجموعة زوايا أويلر التي تم الحصول عليها لجميع التناوب ثلاث طائرات (xy xz وزي)، في الصفوف من 10° وارسم لهم باستخدام برنامج Origin9.

النتائج

الإيبوكسي مادة ملء ممتازة لتصنيع الرقائق بالأشعة السينية. أنها رخيصة وبسيطة وقوية إلى عملية دون الحاجة إلى أدوات متخصصة (الشكل 1). خفض اللزوجة الإيبوكسي باذابته مع وزن 40 ٪ إيثانول تيسير إزالة الراتنج الزائدة أعلى البئر التبلور، أسفر عن تعريف الأشعة السينية ويندوز. وأسفر ارتفاع الإيثانول تخفيف العيوب في الراتنج يشفي. عن طريق تحليل الأشعة السينية رقاقة المقاطع العرضية، عقدنا العزم سمك الإطار الإجمالي لكلا الجانبين أن حوالي 19 ميكرومتر سميكة، وجدا قريبة من القيمة الاسمية سمك رقائق بوليميد المستخدمة من 2 × 7.5 ميكرومتر (الشكل 2)

كانت معزولة المحاكمات تبلور في عدة نانولتر الحجم رد فعل المقصورات كل، استخدام إليه صمام شعرية كما هو موضح سابقا⁴¹. هذه التقنية تحميل 'مخزن-آنذاك-إنشاء' تجنب فقدان عينة من قناة الميت-حجم ويمكن بسهولة إجراء يدوياً، مما يلغي الحاجة ﻻستخدام مضخات أو غيرها من المعدات ليشتغل السوائل⁴². هو معبي الرقاقة مع النفط المفلورة قبل تحميل العينة المائية. التوتر السطحي في الواجهة الزيت عن الماء بين فتيلة النفط ونتائج العينة مائي في فرق ضغط عبر الواجهة. هذا ضغط لابلاس يعتمد على نصف قطر انحناء والتوتر السطحي للواجهة. للتقليل من الطاقة، يجب تقليل الواجهة سطحه، وما يعادل زيادة إنصاف أقطار رئيسية من انحناء عند حجم ثابت إلى أقصى حد. وقد واجهة انحناء منخفضة في قناة واسعة انخفاض ضغط لابلاس ثم واجهة انحناء عالية في مقطع قناة ضيقة. ولذلك، المكونات العينة يدخل تفضيلي والتدفقات من خلال الواسعة تجاوز القناة بدلاً من تتدفق من خلال القيود صمام الشعرية الضيقة. وأخيراً، تبعتها المكونات العينة النفط المفلورة لفصل الآبار عينة إلى قطيرات مستقلة.

وقد تحقق تحميل قوية وموثوق بها مع معدلات تدفق يصل إلى 1 مل/ساعة في كل من مسلسل وترتيبا جيدا موازية (الشكل 3). في تخطيط 'المسلسل'، كذلك تضيقات صمام مدخل والشعرية تسلسلياً ترتبط من خلال قناة تجاوز³¹. على النقيض من ذلك، في تخطيط 'موازية'، اثنين من القنوات الرئيسية منفصلة توصيل جميع مداخل جيدا أو الشعرية صمامات فقط⁴³. كلا المفهومين الترتيب تضافرت سابقا مع وضع عنصر التحكم لتكوين الشاشة، واحد جوانب مفيدة في البروتين تبلور^43،44. تصميم المسلسل باثنين فقط من منافذ السوائل، مدخل واحد ومخرج واحد. منافذ السائل أقل، ونظرا لهذا، هو أبسط لبناء وتشغيل. تخطيط موازية له 4 منافذ السوائل، 2 للقناة الرئيسية التي تربط الآبار و 2 لربط الصمامات الشعرية للسماح للهواء أو الهروب فائض من النفط. ومن ثم متابعة التحميل من كلا الجانبين القناة الرئيسية. هذا التخطيط قد عموما أقل مقاومة تدفق لعدد متساو من الآبار بسبب ما تجاوز أقصر. ومن ثم فإنه أكثر ملاءمة لتحجيم أعلى الأجهزة مع عدد كبير من الآبار. أيضا، الآبار عينة نحو أقرب معا، مما يوفر مزايا للتصوير الآلي.

عينة كاملة تحميل لوحظ لكلا التخطيطين، إذا بنيت أما كاثنين-ارتفاع أو تصميم ثلاثة-الارتفاع. في تصميم الارتفاع اثنين، بالعينة جيدا والقنوات الجانبية متساوية الطول. يتطلب تصميم الارتفاع ثلاثة قناع ثالثة، طبقة SU8 إضافية وخطوة محاذاة لزيادة ضمان أن الآبار عينة أصبح أعلى من السابق تجاوز القنوات. ويعزز هذا الارتفاع-الفارق دخول جيدا من خلال شعري نفس أحكام بصمام المبدأ القائل بأن توقف تدفق في التشنج عينة السائل. هنا، يناظر السقف جيدا أعلى انخفاض ضغط لابلاس غضروف الزاحفة وتدفق على طول باتجاه تجاوز هو يفضل إلا بعد الآبار قد شغل تماما مثل أن تضيقات صمام منع مزيد من تدفق وتحويل ذلك إلى أسفل التجاوز. ومع ذلك، لا تتطلب تحميل ناجح الآبار لتكون أعلى من التجاوز حسب أحكام ملائمة بصمام الشعرية يمكن أيضا أن يتحقق عن طريق ضبط عرض القناة تبعاً لذلك دقة. ومع ذلك، في تجربتنا، الآبار أعلى أداء أقوى إلى حد كبير وتحميل مجاني عيب لوحظ عند تصل إلى عشرة إضعاف أعلى معدلات التدفق في كل ارتفاع ثلاثة تصاميم مقارنة بنظرائهم اثنين-ارتفاع. هذا التأثير كان أكثر وضوحاً في تخطيط موازية.

لتقليد بخار نشر بلورة حركية، استغلت نفاذية محدودة لإحباط بوليميد للتحكم في تبخر المياه مع مرور الوقت. معدلات التبخر التجريبية فقد حددت كميتها عن طريق رصد تغير حجم الحبرية على مر الزمن بمساواته انخفاض المساحة السطحية وكذلك الارتفاع (الشكل 4). لا تمضي قدما التبخر من آبار تبلور في رقاقة الأشعة السينية بطريقة خطية، كما تقلص مساحة الإسقاط تزامن مع زيادة النتائج تركيز ذائبة في معدل تبخر انخفاض على مدى الساعة⁴⁵. بعد تبخر الأولية بمعدل خطي تقريبا عن 0.5 nL ح^-1 في ويلز للهندسة تخطيط المسلسل.

لفهم أفضل لحركية التبلور، أجريت قياسات DLS في الآبار تبلور رقاقة موائع جزيئية. الأولى DLS القياسات، استخدمت شريحة PDMS المستعبدين في شريحة زجاجية لتوفير أفضل الخصائص البصرية للتجربة تشتت الضوء. وكان هذه الشريحة نفس الأبعاد تماما الرقاقة بالأشعة السينية. وقد PDMS نفاذية بخار الماء أعلى من بوليميد للنوافذ بوليميد في رقاقة الأشعة السينية⁴⁵. نظراً لتدفق جداول خطيا مع المسافة، مسار التبخر بوليميد إطارات جيدا يمكن مطابقتها مع نافذة PDMS مقابلة لسمك مناسب.

وتبين النتائج DLS أن توزيع نصف قطرها يتغير بمرور الزمن (الشكل 4 أ-ب)، مما يدل على أن القياسات DLS تسمح بالكشف عن نويات أولية قبل أن يلاحظ الجزيئات البلورية الأولى. يمكن استخدام هذه المعلومات نوكليتي وتنمو بلورات مفردة الواحدة وكذلك عن طريق ضبط معدل التبخر خارجياً ومن ثم مستويات سوبيرساتوريشن في مرحلة مبكرة من نويات⁴⁶.

رقاقة الأشعة السينية ثابتة على محول مطبوعة 3D ل goniometer لوحة متوافقة SBS في بيمليني EMBL من السنكروتروني P14 في "البتراء الثالث" (الشكل 5A). وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام إطار مطبوعة 3D أصغر لرقائق الأشعة السينية جبل بيمليني القياسية المنقل²¹. يكون حجم من 10-20 ميكرومتر (الشكل 5B) بلورات ثاوماتين وديفراكت يصل إلى دقة 2.0 (الشكل 5). كما هو متوقع، مساهمة إطارين رقائق بوليميد رقيقة من رقائق الأشعة السينية الأشعة السينية الخلفية يقتصر على بوليميد البوليمر نثر خواتم في 11 Å (2θ ~ 5°) و 33 Å (2θ ~ 1.7°) لطول موجه الأشعة السينية 0.97 Å. لا تخل هذه الحلقات اثنين تجهيز البيانات. وجمعت مجموعة بيانات إجمالية مع 83 ثوماتين بلورات وسجلت 10 أنماط الحيود من كل كريستال مع تناوب 1° خلال كل إطار. تجهيز البيانات والمعلمات الصقل، فضلا عن إحصاءات dataset ثوماتين يتم سرد ومقارنة مع اثنين مجموعات البيانات الأخرى إيزوميراز الجلوكوز وثيوريدوكسين التي كانت أيضا التي تم جمعها في الموقع وترد في الجدول 3 و الجدول 4.

كان التحقيق اضمحلال كثافة الطاقة حيود تطبيع مع مرور الوقت بتقسيم dataset ثوماتين إلى خمس مجموعات فرعية (نمطين من أنماط الحيود استخدمت كل مجموعة فرعية للحفاظ على مجموعات كاملة من البيانات). كما هو موضح في الشكل 6B، سلطة حيود بدأت تنخفض بعد مجموعة البيانات الفرعية الأولى وكان أقل من 50% في مجموعة البيانات الفرعية الرابعة. كنتيجة لذلك، قيم رميس من مجموعات البيانات الفرعية تتزايد أيضا مع مرور الوقت، تشير إلى أضرار الإشعاع الأشعة السينية أثناء جمع البيانات. نحن افترض أن تتحلل الجذور الحرة المتولدة أثناء التعرض للأشعة السينية بسرعة البلورات المجاورة في حجرة رد الفعل نفسه. على سبيل المثال، كان هذا الضرر بالأشعة السينية الثانوي أقل وضوحاً في نهج تجريبية ذات صلة، حيث تم توزيع بلورات على مساحة أكبر بكثير في ساندويتش بوليميد²¹. لتقليل أضرار الأشعة السينية الشاملة، ينبغي جمع سوى عدد قليل من أنماط الحيود من كريستال خاصة في درجة حرارة الغرفة. أيضا، ينبغي أن تتعرض واحدة فقط البروتين وحيد كريستال كل حجرة رقاقة موائع جزيئية. ومع ذلك، تظهر جميع نماذج هيكل المكررة باستخدام مجموعات البيانات المجهزة الفراغية جيدة جداً وإحصاءات مناسبة (الجدول 4). وباﻹضافة إلى ذلك، كانت جميع خرائط كثافة الإلكترون النهائي من نوعية جيدة جداً.

في النهج البلورات السابقة على رقائق شفافة الأشعة السينية، توجه وترتيب البلورات إلى التلاعب بها عمدا للحصول على توزيع عشوائي لبلورة توجهات⁴⁰ أو حصلت عليه حركات كريستال داخل طبقة السائل²¹. تقييم اتجاه كريستال في رقائق موائع جزيئية شفافة الأشعة السينية المبينة في هذا البروتوكول، تم تحديد اتجاه الخلية وحدة جميع بلورات مكشوف فيما يتعلق بنظام الإحداثيات المخبرية. ولوحظ تفضيل طفيف لبلورات ثوماتين بيبيراميدال، (الشكل 7 أ)، بينما حصلنا على توزيع واسع لبلورات الجلوكوز إيزوميراز (الشكل 7). نحن مسبب أن معظم المواد بمقياس نانومتر، يحمل خشونة كبيرة. ومن ثم، بلورات يمكن تلقائياً نوكليتي على السطح بدرجة كبيرة أقل التوجهات المنحازة عفويا. قد يكون مؤمناً نواة كريستال صغيرة في توجه، بينما تواصل تنمو إلى الحجم المناسب دون إعادة توجيه بالنسبة عادية السطح. وفي الواقع، التنو كريستال وساطة السطحية منذ زمن طويل مصدر إزعاج لانقسامها تحاول حلقة كريستال مرفقة قبالة السطح دون إلحاق الضرر بالكريستال في هذه العملية. هنا، نحن يمكن الاستفادة من مباشرة هذه البلورات لجمع البيانات الحيود. ومع ذلك، توجد قيود محددة النظام، كما كشفت ثيوريدوكسين عن تفضيل قوي لبعض التوجهات في س-xz-و yz-طائرات (الشكل 7). وتبين الأمثلة تبين أن توزيع التوجه لا يتوقف فقط على بيئة النمو ولكن أيضا على شكل كريستال. وقد ممدود بلورات ثيوريدوكسين الأشكال التي تميل إلى النمو في اتجاه المفضل، بينما لا تظهر بلورات ثاوماتين بيبيراميدال تيتراجونال أو بلورات الجلوكوز أورثورهومبيك إيزوميراز هذا السلوك. ومع ذلك، في جميع الحالات، حتى مع توجهات المفضل النطاق موجوداً لتناوب الكريستال أسفرت عن تغطية جيدة بما فيه الكفاية من الفضاء متبادلة ومجموعات البيانات كاملة ومن ثم للجميع التحقيق البروتينات. هكذا، كان أي تدابير إضافية يمكن اتخاذها عند اختيار بلورات للتعرض للأشعة السينية.

الشكل 1 : مخطط لتصنيع الرقائق الأشعة السينية موائع جزيئية. (1) هو الاستغناء عن سو-8 على الركازة السليكون وتدور المغلفة للحصول على سمك الطبقة المرغوبة. (2) مقاوم الضوء يتعرضون للإشعاع فوق البنفسجي من خلال قناع. (3) ثم يوضع الواقي الضوئي لم يتعرضوا بعيداً بالتتالي الغسيل مع بجميا والكحول، نتج عنه (4) خطوات هو سيد سو-8 للإدلاء بالمزيد. (5) PDMS يسكب على، و (6) بعد علاج العفن PDMS، هو مقشر من سيد سو-8. غراء أبوكسي (7a) هو الاستغناء عن العفن PDMS و (7b) إحباط بوليميد المنشط كيميائيا المستعبدين إلى الراتنج الإيبوكسي. (8) بعد علاج، هو مقشرة إحباط بوليميد مع الفيلم منقوشة الإيبوكسي رقيقة من العفن PDMS. (9) في خطوة أخيرة، الجهاز هو غطاء مع إحباط بوليميد ثانية تؤتي مغلقة منخفضة الأشعة سينية خلفية موائع جزيئية رقاقة إلكترونية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : صورة فوتوغرافية (يسار) وصور الفحص المجهري للمقاطع العرضية من رقائق النهائي. يتم عرض جزء قناة ممثل (الأوسط) وكذلك بلورة (يمين) من رقائق منفصلة اثنين. تشير الأسهم إلى قياس المسافات. جميع الأبعاد في ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 : تصاميم الخطط لبلورة جيدا مع موازية [أ] أو [ب] تخطيط المسلسل، كما ينظر إليها من الأعلى ومن الجانب، مع أبعاد المشار إليه في ميكرومتر. كانت مرتفعات قناة نموذجية: تجاوز 50 ميكرومتر، 50-60 ميكرومتر تبلور جيدا، 5-10 ميكرون الشعرية صمام، المطابقة لوحدات التخزين من حوالي 2.5 nL (تخطيط موازية) و 8 nL (تخطيط المسلسل). ويرد الممثل أيضا تحميل السلوك استخدام الأصباغ الغذائية. الرقاقة كان معبي مع 12 و % 1 ح، 1 ح، ح 2، ح 2-perfluoro-1-الأوكتانول في نادي-43، قبل أن تم حقن صبغة الطعام في آبار تخزين. وتشير الأسهم البيضاء إلى اتجاه التدفق. نظرة عامة على الصور لعرض الأجهزة تحميل تحميل جميع الآبار عيب تحميل مجاناً، وتوضح عينة قوية. ويتضح تخطيط موازية كتصميم ثلاثة-الارتفاع، مع تبلور الآبار أعلى من التجاوز، بينما التخطيط المسلسل هو يصور كتصميم اثنين-الارتفاع مع الآبار وتجاوز بعد الارتفاع متساوية. كانت معدلات تدفق نموذجي حوالي 150 ميليلتر/ح أثناء تحميل، ولكن لوحظ عيب تحميل مجاني فلووراتيس ليصل إلى 1 مل/ساعة في ارتفاع--تصميم ثلاثة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 : في الموقع "تشتت الضوء الديناميكي" لبلورة جيدا مع مرور الوقت- [أ] سلسلة الصورة مجهرية من بلورة جيدا. ينكمش الحبرية المخزن المستمر كبخار الماء يتبخر مع مرور الوقت. ويمكن ملاحظة أول ثوماتين ميكروكريستالس بعد 4 حاء [ب] مناظرة radius هيدرودينامية توزيع الجسيمات ثوماتين تقاس DLS أثناء عملية بلورة نفس صورت في [أ]. إنقاص تشكيل كسر دائرة نصف قطرها الثانية، التي تشير إلى أحداث نويات أولية يتبين بعد حوالي 1-2 حاء [ج] حجم الممثل مجلدين الحبرية المرجعية بسبب فقدان المياه التبخر على مر الزمن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 5 : جمع البيانات في الموقع الحيود. [أ] رقائق موائع جزيئية فردية تقام واسطة 3D محول مطبوعة (أزرق) في جونيوميتير لوحة. [ب] ثوماتين البلورات في موائع جزيئية رقاقة أثناء التعرض للأشعة السينية بتصويرها بالمجهر في خط في بيمليني P14. [ج] حيود بلورات ثاوماتين تم تسجيلها بقرار 2.0، مع خلفية منخفضة التعليميين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 6 : التقييم البيانات البيانات الحيود من بلورات ثوماتين في رقاقة موائع جزيئية، سجلت في درجة حرارة الغرفة- [أ] إلكترون كثافة من الطراز ثاوماتين المكررة باستخدام الإطار 1-2 البيانات فقط (ملامح الأزرق في 1.5 σ). [ب] كثافة الانحلال من بلورات ثوماتين كدالة لجرعة الأشعة السينية. [ج] تطور قيمة رميس على جرعة الأشعة السينية. يرسم المربع في [ب] و [ج] مع quartiles (القيم العليا 75% ومتوسط القيم 50% وانخفاض القيم 25% ويعني) وشعيرات مع 95% فواصل الثقة تمثل انحلال كثافة الحيود ورميس من بلورات يتعرض جميع (ن = 83). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 7 : توزيع وحدة الخلية التوجهات في إحباط رقاقة موائع جزيئية فيما يتعلق بنظام الإحداثيات المخبرية. [أ] بيبيراميدال ثوماتين بلورات أظهر توزيع واسع للتوجهات التي تغطي ما يقرب من 180° س ص-(الأزرق)، yz-(red) و xz-طائرة (أخضر). [ب] إيزوميراز الجلوكوز كما يبين توزيع واسعة النطاق، بينما ثيوريدوكسين [ج] أظهرت تفضيل قوي لبعض التوجهات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

طبقة SU8	تدور معطف	قبل خبز	كشف	خبز بعد
		[65/95 درجة مئوية]		[65/95 درجة مئوية]
1شارع طبقة: الآبار	1000 لفة في الدقيقة	0/10 دقيقة	200 مللي جول/سم2	1/4 دقيقة
15 ميكرون SU8-3010
2nd طبقة: تجاوز	2000 دورة في الدقيقة	0/16 دقيقة	220 مللي جول/سم2	1/5 دقيقة
35 ميكرون SU8-3025
الطبقةالثالثة 3: صمامات	3000 لفة في الدقيقة	0/3 دقيقة	150 مللي جول/سم2	1/2 دقيقة
5 ميكرومتر SU8-3005

الجدول 1: مثال عملية SU8 لتصميم رقاقة الأشعة السينية موازية ثلاثة طبقة- هذا ترتيب الطبقة سوف يسمح للصب العفن PDMS لتصنيع الرقائق بالأشعة السينية. لمباشرة العفن PDMS من خلال النماذج، عكس الطبقة يأمر أثناء التصنيع الرئيسية لبدء من 3^rd إلى النهاية مع طبقة^ش 1 بدلاً من ذلك.

البروتين	تركيز البروتين	المخزن المؤقت للبروتين	مرسب	مساحة المجموعة، دخول PDB	معامل الانقراض [م-1 سم-1]
ثوماتين (دانييلي ثوماتوكوككوس)	40 مغ مل-1	50 مم مكررا-تريس، الرقم الهيدروجيني 6.5	1.1 طرطرات الصوديوم م، 50 مم تريس، الأس الهيدروجيني 6.8	I4222، 1LR2	29420
إيزوميراز الجلوكوز (روبيجينوسوس متسلسلة)	ملغ 25 مل-1	10 ملم حبيس، 1 مم مجكل2، درجة الحموضة 7.0	100 مم مكررا-تريس، كبريتات الأمونيوم 2.7 م، 5.7 درجة الحموضة	I222، 4ZB2	46410
ثيوريدوكسين (فخرية بنكروفتيه)	34 ملغ مل-1	20 مم تريس-HCl، 5 ملم يدتا، 150 مم كلوريد الصوديوم، pH 8.0	27.5 في المائة PEG1500، المخزن المؤقت SPG 100 ملم، ودرجة الحموضة 6.3	P41212، 4FYU	24075

الجدول 2: شروط تبلور والفضاء مجموعات البلورات البروتينية على استعداد، بما في ذلك التعليمات البرمجية pdb ومعامل الانقراض.

البروتين	عدد البلورات المكشوفة	عدد نمط حيود كل كريستال	نطاق التذبذب في التعرض [°]	زمن التعرض للضوء [مللي]	دخول PDB للسيد
ثوماتين (دانييلي ثوماتوكوككوس)	103	10	1	40	1LR2
إيزوميراز الجلوكوز (روبيجينوسوس متسلسلة)	69	100	0.1	80	4ZB2
ثيوريدوكسين (فخرية بنكروفتيه)	68	10	1	40	4FYU

الجدول 3: جمع بيانات المعلمة حيود الأشعة السينية.

البيانات جمع الإحصاءات	ثوماتين (الإطار 1-20)	إيزوميراز الجلوكوز (الإطار 1-100)	ثيوريدوكسين (الإطار 1-10)
بيمليني		P14
الطول الموجي [Å]		0.96863
مجموعة الفضاء	P41212	I222	P42212
وحدة خلية المعلمات: = ب، ج []	58.62، 151.48	93.91، 99.60، 103.04	58.45، 151.59
عدد البلورات	101	41	34
مجموع التذبذب [°]	10	10	10
قرار [Å]	30.1.1989 (1.95-1.89)	30.1.1975 (1.80-1.75)	30.3.2000 (3.20 – 3.00)
درجة حرارة [ك]	296	296	296
P.i.m.صب	7.5 (25.5)	8.8 (28.0)	9.1 (33.2)
تأملات المقاسة	1553200	690000	1111196
تأملات فريدة من نوعها	21850	48942	44449
I/σ(I) متوسط	6.07 (1.78)	5.85 (1.66)	4.08 (1.47)
Mn(I) نصف مجموعة الارتباط CC(1/2)	96.2 (72.2)	95.8 (68.2)	97.9 (75.3)
كمال [%]	99.8 (100.0)	100.0 (99.9)	99.9 (100.0)
التكرار	71.1	14.1	25
إحصائيات الصقل
نطاق القرار [Å]	30/01/1989	30/01/1975	30/03/2000
R/Rالحرة [%]	18.8/23.9	18.1/20.5	18.9/23.1
ذرات البروتين	1550	3045	1129
جزيئات الماء	51	111	164
يجند الجزيئات	20	0	0
الانحراف rms
السندات ذات طول [Å]	0.02	0.026	0.01
زاوية بوند [°]	2.04	2.22	1.43
معامل ب [Å2]
البروتين	22.6	20	50
المياه	25.1	27.1	29.7
[ليغند]	20.4
تحليل الأرض راماشاندران
المناطق الأكثر تفضيلاً [%]	97.67	95.32	96.13
المناطق المسموح بها [%]	2.44	4.16	3.64
يسمح بسخاء مناطق [%]	0.49	0.52	0.23
ج: القيم في أقواس لشل القرار أعلى.
باء: ()، حيث (hkl) هو متوسط كثافة hkl تأملات، Σhkl هو المجموع على جميع الأفكار و Σi هو المجموع ط أكثر قياسات hkl الانعكاس.

الجدول 4: إحصاءات جمع البيانات datasets من ثوماتين، إيزوميراز الجلوكوز وثيوريدوكسين.

سوبليمينتري-ملف 1: chip_geometry.dwg- ملف CAD للهندسات الرقائق المستخدمة. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

سوبليمينتري-ملف 2: goniometer_adapter.stl- STL-ملف تحديد المحول goniometer رقاقة الأشعة السينية. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

3 سوبليمينتري-الملف: xds.sh- باش البرنامج النصي لإنشاء ملفات الإدخال عملية الأوتاد الحيود عن XDS بيانات. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

4 سوبليمينتري-الملف: xscale.sh- باش البرنامج النصي دمج البيانات الحيود من مجموعات فرعية وإنشاء ملف HKL. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

سوبليمينتري-ملف 5: ISigma.sh- باش البرنامج النصي استخراج القيم إيسيجما من جميع المجموعات الفرعية الفردية. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

سوبليمينتري-ملف 6: Rmeas.sh- باش البرنامج النصي لاستخراج قيم رميس من جميع المجموعات الفرعية الفردية. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

7 سوبليمينتري-الملف: rotation_matrix.sh- باش البرنامج النصي لإعداد ملف الإدخال لمطلب لحساب زوايا أويلر من مصفوفة التناوب. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

نحن اختﻻق أجهزة موائع جزيئية في الموقع حيود الأشعة السينية بالزخرفة راتنج الإيبوكسي كملء إحباط المادية وبوليميد كمواد للنافذة. لدينا الإجراء الأمثل الخطوات المختلفة لعملية التصنيع عبر الأشعة السينية السابق الرقاقة التصاميم^16،21. وخفضنا سمك الإطار ومما الخلفية التشتت وأيضا تخفيف تلفيق خطوات عملية أقل مطلوبة. وقد تبلور في الموقع على استخدام بروتوكول وصف فوائد كبيرة. يتيح جمع البيانات حيود في درجة حرارة الغرفة ومما يستبعد الحاجة إلى حماية البرد، التي تحتوي على مخاطر إدخال المشغولات الحرفية في بنية البروتين في بعض الحالات. وعلاوة على ذلك، البلورات لا تخضع للإجهاد البدني، لأنه يمكن أن يكون تجنب نقل البلورات من بيئتها الأصلية. من خلال هذا الإجراء، البلورات الاحتفاظ أعلى مستوى من الجودة ولا يعانون من أي علاج.

وفي تجربتنا، الخطوات الأكثر أهمية ضمن البروتوكول تدور حول السيطرة على عملية تبلور. يجب تحديد تجريبيا المعلمات للحصول على بلورات الأشعة السينية مناسبة مع الأبعاد المناسبة ولا يمكن أن تؤخذ مباشرة من تجارب نشر بخار. استخدام تركيزات مماثلة من البروتين ومرسب لم دائماً تسفر عن البلورات في رقائق مختلفة، أو في بعض الأوقات في آبار مختلفة داخل نفس الرقاقة. وهذا يشير إلى أن جميع العوامل التي تؤثر على التنو كريستال والنمو ينبغي النظر بعناية، مثل الأم الخمور تكوين أو بلورة حركية (من خلال مسار التبخر). كما ديفراكت بلورات أكبر بدقة أعلى، من الناحية المثالية تزرع بلورات كبيرة تأهيلاً مناسباً. قد يتبع عملية التنو كريستال والنمو مع قياسات DLS. ضبط تركيز الليزر داخل ميكرومتر ~ 50 المقصورات بلورة رقيقة من الرقائق يمكن أن تكون صعبة وقد يتطلب حذراً محاذاة يدوياً. باستخدام الآبار أعمق من 100 ميكرومتر، الليزر صناعة السيارات في محاذاة مجد وموثوق بها، مثل أنه يمكن رصد الآبار متعددة من خلال مخططات اقتناء الآلي.

إنتاج رقائق الأشعة السينية بوليميد على أساس خلفية منخفضة فقط ونثبت مدى ملاءمة هذه الأجهزة لجمع البيانات حيود الأشعة السينية الروتينية بحل هياكل لثلاثة النموذجي البروتينات. القرار أفضل حصلت في رقاقة تختلف، بالمقارنة مع القرارات المحققة سابقا، من البلورات البروتينية أكبر بشكل ملحوظ، وجمع بيانات الأشعة السينية التقليدية. يمكن أن يكون هذا بسبب عدة عوامل، وتبلور الشرط الأمثل قد كذلك تحسين الحيود. كان من الممكن لجمع البيانات في الموقع حيود تصل إلى 1.8 Å قرار تطبيق كريستال مع أبعاد أصغر من 30 ميكرومتر. تحليل مفصل لبيانات الحيود ثوماتين قدمت أفكاراً حول أضرار الإشعاع. للحد من التوسيع لأضرار الإشعاع، ينبغي أن تتعرض كريستال واحدة واحدة فقط كل حجرة في الجهاز موائع جزيئية، كما يمكن أن يحدث انتشار الجذور وفي البلورات المجاورة. لتحسين سرعة جمع البيانات، هذا ينبغي أن تكون تلقائية في المستقبل.

سبب مورفولوجيا كريستال، وفي بعض الحالات يمكن أن يحدث لاتجاه مفضل. على سبيل المثال هذا هو الحال بالنسبة dataset ثيوريدوكسين، حيث كان البلورات اتجاه مفضل بشدة بالنسبة للنوافذ رقاقة. وحتى هنا، يمكن أن نقوم بجمع dataset حيود كاملة. إذا كان يحمل بلورات اتجاه مفضل في رقاقة وخاصة إذا كان أيضا مجموعة الفضاء المقابلة تماثل منخفضة، ثم مدى اكتمال البيانات ينبغي رصدها أثناء جمع مثل أن تكون كافية قصب أنماط الحيود التي تم جمعها.

دراسات حل وقت استخدام هذه الرقائق مباشرة ممكنة عند استخدام الضوء الناجم عن تفاعلات مع اتباع نهج تحقيق مضخة. إحباط بوليميد انتقال ضوء الليزر من مضخة يحتاج إلى توضيح، وبدلاً من ذلك، بصريا مسح بوليميد أو يمكن أن تستخدم في مدونة قواعد السلوك. الهندسات موائع جزيئية الحالية لا تسمح بالركيزة خلط التجارب بعد أن تزرع البلورات. ومع ذلك، نحن نتوقع رقاقة الأشعة السينية وصف تلفيق البروتوكول أن تكون أيضا مناسبة لمثل هذه خلط التصاميم لكلا حيود الأشعة السينية وقت حلها، فضلا عن تناثر النهج¹⁹.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SU-8 3000 Series	MicroChem Corp.	SU-8 3000	Photoresist
PGMEA	Sigma-Aldrich	484431	Developer
Isopropyl alcohol			Solvent
Ethanol			Solvent
Epoxy glue	UHU	Plus Schnellfest 5 min	Epoxy glue
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184	Silicone
Kapton foil	Dupont/ American Durafilm	HN grade, gauge 30 (7.5 μm)	polyimide foil
APTS	Sigma-Aldrich	440140	Chemical
GPTS	Sigma-Aldrich	440167	Chemical
Cytop CTX-109AE	Asahi Glass Co. Ltd	Cytop CTX-109AE	Cytop fluoropolymer coating
CT-Solv 100E	Asahi Glass Co. Ltd	CT-Solv 100E	Cytop fluoro-solvent
HFE-7500	3M	Novec 7500	Fluorinated oil
AutoCAD	AutoDesk Inc.	AutoCAD	CAD Software
Biopsy Punch	Harris	Uni-core 0.75 mm
Photo mask	JD Photo Data
3 inch wafer	University Wafer		Silicon wafer
Mask aligner	SÜSS MicroTec	MJB4	Mask aligner
PDMS mixer	Thinky	ARE-250
Plasma machine	Diener electronic	Zepto
Thaumatin	Sigma Aldrich	T7638	Protein
Glucose Isomerase	Hamton Research	HR7-102	Protein
Bis-Tris	Sigma Aldrich	B9754	Chemical
Sodium Tartrate	Merck	106664	Chemical
Tris-HCl	Sigma Aldrich	10812846001	Chemical
HEPES	Carl Roth	6763.2	Chemical
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	208337	Chemical
Ammonium Sulfate	Sigma Aldrich	A4418	Chemical
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Chemical
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	1064060250	Chemical
PEG1500	Molecular Dimensions	MD2-100-6	Chemical
SPG buffer	Jena Bioscience	CSS-389	Chemical
SpectroLight600	XtalConcepts		DLS Instrument
Nanodrop	Thermo Scientific		Spectrophotometer
Zentrifuge	Eppendorf
Ultimaker2	Ultimaker		3D printer
Form2	Formlabs		3D printer
Amicon Filter	Sartorius Stedim		0.2 µm filter
Tubing	Adtech Polymer Engineering Ltd	Bioblock/05	PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter
Syringes	BD	309628	1ml Luer-Lock Tip
Needle	Terumo Agani Needle	AN*2716R1	27Gx5/8"