في فيفو تصوير Morphogenesis وتر العضلات في المورفولوجية الخوادر

Summary

هنا، نحن نقدم وسيلة سهلة الاستخدام، وتنوعاً لإجراء التصوير مباشر للعمليات الإنمائية في morphogenesis العامة ووتر العضلات خاصة في المعيشة الخوادر المورفولوجية .

Abstract

تمكين العضلات جنبا إلى جنب مع الأوتار وهيكل عظمى الحيوانات بما فيها البشر التحرك على أجزاء الجسم. هو يحافظ morphogenesis العضلات درجة عالية من الحيوانات إلى البشر. ولذلك، يمكن استخدام النظام النموذجي المورفولوجية قوية لدراسة مفاهيم التنمية وتر العضلات التي يمكن تطبيقها أيضا على البيولوجيا البشرية العضلات. هنا، نحن تصف بالتفصيل كيف يمكن بسهولة تصويرها morphogenesis النظام وتر العضلات الكبار في المعيشة، تطوير الخوادر المورفولوجية . ومن ثم، يسمح الأسلوب التحقيق البروتينات والخلايا والأنسجة في بيئتهم الفسيولوجية. بالإضافة إلى بروتوكول خطوة بخطوة مع نصائح مفيدة، نحن نقدم استعراضاً شاملا للمعلمة فلوريسسينتلي ماركر البروتينات التي مناسبة لدراسة النظام وتر العضلات. لتسليط الضوء على تطبيقات متعددة للبروتوكول، نعرض المثال أفلام تتراوح بين التصور الأحداث morphogenetic طويلة الأجل – التي تحدث في مقياس الوقت لساعات وأيام – لتصور عمليات الدينامية قصيرة الأجل مثل ارتعاش العضلات التي تقع في نطاق مرة ثانية. أخذت معا، هذا البروتوكول ينبغي أن تمكن القارئ على تصميم وإجراء تجارب العيش-التصوير للتحقيق morphogenesis وتر العضلات في الكائن الحي سليمة.

Introduction

جهاز العضلات وتر، يسمح للحيوانات بما فيها البشر التحرك على أجزاء الجسم. الغاية هي حفظت لبنات البناء الجزيئي للنظام وتر العضلات. ولذلك، يمكن دراسة مفاهيم التنمية وتر العضلات ذات الصلة للبيولوجيا البشرية العضلات، على سبيل المثال morphogenesis عضلة ووتر عضلة مرفق ميوفيبريل التنظيم الذاتي، استخدام melanogaster المورفولوجية كالوصول إليها بسهولة النظام النموذجي. ويضم النظام الخوادر المورفولوجية العديد من المزايا التجريبية. أولاً، في مرحلة الخوادر – عندما يتم تشكيل العضلات الكبار – الكائن الحي لاطئة وبالتالي من السهل الصورة في مجهر على مدى فترة الساعات أو حتى أيام. وثانيا، بإغلاق العديد من العضلات النموذج كافية تحت السطح الخوادر ذلك لأنهم يمكن تصويرها داخل الكائن الحي، سليمة وشفافة جزئيا. وثالثاً، يمكن أن يحقق العضلات في بيئتها الطبيعية، حيث يتم توصيلها إلى تشكيل الهيكل الخارجي عبر خلايا الأربطة والأنسجة التوتر هو بناء. هذا غير ممكن في نظم الاستزراع الخلية العضلات. وأخيراً، يتوفر عدد كبير أدوات الجينية في المورفولوجية. ومن بين هذه هي العديد من علامات المعلمة فلوريسسينتلي التي تسمح لتصنيف أنواع الخلايا المحددة أو هياكل سوبسيلولار للتصوير في فيفو.

ويلخص الجدول 1 أهم العلامات المستخدمة لدراسة morphogenesis وتر العضلات. وتتضمن علامات أوفيريكسبريسيد باستخدام GAL4-UAS-النظام¹ ومعلم اندوجينوسلي البروتين علامات^2،،من³⁴. ميزة النظام GAL4 UAS هو أن العلامات عموما يعبر عن مستويات عالية، أسفر عن إشارة قوية يمكن تصويرها بسهولة في الجامعة-جبل الخوادر. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحقيق خصوصية الأنسجة عن طريق اختيار السائقين GAL4 بعناية. استفادة البروتينات الانصهار أعرب تحت الرقابة الذاتية أن القوى المحركة للبروتينات ذات الصلة يمكن أن تكون درس في فيفو، بينما يمكن استخدامها أيضا كعلامات لأنواع مختلفة من الخلايا أو هياكل سوبسيلولار محددة، على سبيل المثال، ΒPS-إنتغرين-التجارة والنقل لمواقع مرفق العضلات. معا، هذه العلامات توفر مرونة عالية في التصميم التجريبي واختيار بحث المشاكل التي يمكن حلها الآن وفي المستقبل.

الهيكل المسمى

علامة

التعبير والتعريب

الفئة

عدد الأسهم

التعليق

Ref.

العضلات

Mef2-GAL4

جميع ميوبلاستس وجميع العضلات في جميع مراحل

خط GAL4

BL 27390

5

1151-GAL4

السلائف العضلات الكبار و myotubes المبكر حتى إيتش تو فور ح APF

خط GAL4، فخ محسن

-

6

Act79B-GAL4

القفز العضلات عند المفاضلة

خط GAL4

-

7

Act88F-GAL4

عضلات الطيران غير المباشرة بدءاً إيتش وان فور ح APF

خط GAL4

-

7

Act88F-Cameleon 3.1

عضلات الطيران غير المباشرة بدءاً إيتش وان فور ح APF

محسن Act88F/المروج القيادة Cameleon 3.1

-

Ca2 + مؤشر

8

Act88F--بروتينات فلورية خضراء

عضلات الطيران غير المباشرة بدءاً إيتش وان فور ح APF

بروتينات فلورية خضراء-الانصهار (ذبابة ترانسجينيومي خط)

fTRG78 و fTRG10028

4

له-nls-بروتينات فلورية خضراء

عضلة الكبار السلائف، النووية، حتى ح إيتش تو فور الإدارة العامة الاتحادية في عضلات الطيران غير المباشر

محسن/المروج مع المراسل nls-بروتينات فلورية خضراء

-

جزء محسن 1.5 كيلو بايت

9

Mhc-تاو-بروتينات فلورية خضراء

microtubules في قوالب DLM والتفريق بين العضلات

محسن/المروج مع المراسل تاو-بروتينات فلورية خضراء

BL 53739

10

ΒTub60D--بروتينات فلورية خضراء

ميكروتوبوليس في ميوتوبيس (على سبيل المثال في عضلات الطيران غير المباشر من ح إيتش وان فور لوكالة فرانس برس بشدة في التناقص بعد إيتش فور إيت ح الاتحادية)

بروتينات فلورية خضراء-الانصهار (ذبابة ترانسجينيومي خط)

fTRG958

4

Mhc-التجارة والنقل (weeP26)

ساركوميريس (خيط سميك) في جميع عضلات الجسم (على سبيل المثال في عضلات الطيران غير المباشر بدءاً من ح إيتش ثري زيرو الاتحادية)

بروتينات فلورية خضراء-فخ

-

استخدام متخالف، تسميات مجموعة فرعية إيسوفورم

11

سلس-بروتينات فلورية خضراء

ساركوميريس (القرص Z) في جميع عضلات الجسم (على سبيل المثال في عضلات الطيران غير المباشر بدءاً من ح إيتش ثري زيرو الاتحادية)

بروتينات فلورية خضراء-فخ (صائدة الذباب خط)

-

G53، استخدام متخالف

2

Zasp66--بروتينات فلورية خضراء

ض-القرص في جميع عضلات الجسم

بروتينات فلورية خضراء-فخ (صائدة الذباب خط)

BL 6824

ZCL0663

2 , 12

Zasp52--بروتينات فلورية خضراء

ض-القرص في جميع عضلات الجسم

بروتينات فلورية خضراء-فخ (صائدة الذباب خط)

BL 6838

G00189

2 , 12

Hts-بروتينات فلورية خضراء

أكتين ملزمة؛ وأعرب في ظهارة، وميوبلاستس وميوتوبيس

بروتينات فلورية خضراء-الانصهار (ذبابة ترانسجينيومي خط)

fTRG585

4

Dlg1--بروتينات فلورية خضراء

تقاطعات الخلايا الظهارية، وميوبلاستس، والأغشية في العضلات في جميع مراحل

بروتينات فلورية خضراء-الانصهار (ذبابة ترانسجينيومي خط)

fTRG502

4

موقع مرفق العضلات

ΒPS-إنتغرين-بروتينات فلورية خضراء

مواقع مرفق العضلات (مثلاً، بدءاً إيتش وان إيت ح وكالة فرانس برس في عضلات الطيران غير المباشر)

بروتينات فلورية خضراء تدق في

-

13

تالين-التجارة والنقل ومشري

مواقع مرفق العضلات (مثلاً، بدءاً إيتش وان إيت ح وكالة فرانس برس في عضلات الطيران غير المباشر)

بروتينات فلورية خضراء-فخ (تقليد الخط)

-

3

تالين-بروتينات فلورية خضراء

مواقع مرفق العضلات (مثلاً، بدءاً إيتش وان إيت ح وكالة فرانس برس في عضلات الطيران غير المباشر)

بروتينات فلورية خضراء-الانصهار (ذبابة ترانسجينيومي خط)

fTRG587

4

أمثاله-بروتينات فلورية خضراء

مواقع مرفق العضلات (مثلاً، بدءاً إيتش وان إيت ح وكالة فرانس برس في عضلات الطيران غير المباشر)

بروتينات فلورية خضراء-فخ (صائدة الذباب خط)

كيوتو 110951 (ZCL3111)

ZCL3111، ZCL3192

2

Vinc-التجارة والنقل، وطلب تقديم العروض-

مواقع مرفق العضلات (مثلاً، بدءاً إيتش وان إيت ح وكالة فرانس برس في عضلات الطيران غير المباشر)

بروتينات فلورية خضراء-الانصهار (التحوير)

-

13

وتر

ريال-GAL4

خلايا وتر الصدر، طوال مرحلة الخوادر

خط GAL4، فخ محسن

BL 26663

متماثل المميتة

14

عضلة ووتر

Duf-GAL4

العضلات وابيثيليا، بداية مبكرة

خط GAL4

BL 66682

كيري-rP298، مؤسس علامة خلية

15

UAS-الصحفيين

UAS-التجارة والنقل--التقييم

ربط أكتين

خط UAS

BL 31776

أكتين ملزمة المجال من موسين تنصهر للتجارة والنقل

16

UAS-مشري--التقييم

ربط أكتين

خط UAS

-

Gma تنصهر فيها مشري

17

UAS- ليفيكت--بروتينات فلورية خضراء

ربط أكتين

خط UAS

BL 35544

18

UAS-ليفيكت-روبي

ربط أكتين

خط UAS

BL 35545

18

UAS-CD8-بروتينات فلورية خضراء

ربط الغشاء

خط UAS

مختلف الأرصدة، مثلاً: BL 32184

19

UAS-CD8-مشري

ربط الغشاء

خط UAS

BL 27391 و 27392

20

UAS-النخيل-متشيري

ربط الغشاء عن طريق بالميتويليشن

خط UAS

BL 34514

UAS-برينبوو

21

الجدول 1: معلم فلوريسسينتلي علامات البروتين مناسبة لدراسة العضلات وتر morphogenesis في فيفو.

هنا، نحن تصف بالتفصيل كيف يمكن إجراء تصوير morphogenesis وتر العضلات في الخوادر للمعيشة بسهولة ونجاح (الشكل 1). وبدلاً من ذلك، يمكن أن تكون ثابتة الخوادر، تشريح وهي إيمونوستينيد، الذي يسمح باستخدام الأجسام المضادة أيضا تسمية البروتينات التي لا يعيش علامات المتاحة²². في هذه الحالة، نوعية التصوير أعلى بصفة عامة لأن هناك أي تحرك ويمكن وضع الهيكل للاهتمام بالقرب من ساترة. ومع ذلك، تشريح والتثبيت يمكن أن يؤدي إلى أضرار والجزيئية أو يمكن فقط دراسة ديناميات النسيج، على سبيل المثال، العضلات الوخز، في الحي.

Protocol

1-مرحلة الخوادر

1. إعداد صليب مع 20-40 عذراء الإناث والذكور حوالي 20 زجاجة الواحدة ذبابة الأغذية (الشكل 1A). وبدلاً من ذلك، إذا كان سيتم استخدام الأرصدة، فليب كل الأسهم في زجاجات جديدة. للحصول على ما يكفي الخوادر، النظر في إنشاء زجاجتين كل النمط الوراثي.
2. احتضان الزجاجات في 25 درجة مئوية (أو 27 درجة مئوية وفقا للتصميم التجريبي) لمدة خمسة إلى ستة أيام (الشكل 1B).
   ملاحظة: الاحتفاظ بالتقليب الذباب كل يومين أو ثلاثة أيام لتجنب الازدحام وضمان إمدادات مستمرة من الخوادر.
3. استخدام فرشاة مبللة لجمع بريبوباي الأبيض من جدران الزجاجات وتحويلها إلى الشرائح الزجاجية (الشكل 1). الوقت التدريج أن الخوادر الوصول إلى المطلوب في السن عند بدء العيش التصوير تحت المجهر.
   ملاحظة: هذه بريبوباي تبدو وكأنها الخوادر كبار السن من حيث شكلها، إلا أنها لا تزال بيضاء مثل اليرقات. ويعرف بداية مرحلة بريبوبال ح 0 بعد تشكيل بوباريوم (ح 0 الاتحادية).
4. إزالة كتل من الأغذية يطير التمسك الخوادر بفرشاة مبللة وتوجيه الجانب البطني الخوادر اتجاه الشريحة الزجاجية باستخدام ستيريوميكروسكوبي (الشكل 1). تجاهل الخوادر التي لا تزال تتحرك (صغيرة جداً) أو التي بدأت بتشغيل البنى (القديم جداً). وهذا يضمن أن جميع الخوادر في نفس الفئة العمرية (0-1 ح الاتحادية).
5. قم بتسمية الشرائح مع النمط الوراثي، وتاريخ ووقت جمع. نقل الشرائح الزجاجية لكل واحد صحن بيتري وإضافة نسيج رطب للحيلولة دون الخوادر من الجفاف (الشكل 1E).
6. تخزين في الخوادر في حاضنة في 25 درجة مئوية أو 27 درجة مئوية حتى بلوغهم السن المطلوب. تابع مع الخطوات التالية ح 1 قبل التصوير، حيث يكون المطلوب الخوادر السن عند بدء التصوير الحي (الخطوة 3)، على سبيل المثال في 13 ح الإدارة العامة الاتحادية للفيلم هو مبين في الشكل 2 أ-د.
   ملاحظة: أقرب عمليا الوقت ونقطة البدء بعد الرأس-eversion الخوادر التي تحدث في 8-10 ح الإدارة العامة الاتحادية في 27 درجة مئوية.

2-إعداد الخوادر للتصوير

1. ضمان أن الخوادر عصا الآن على الشريحة الزجاجية مثلما أنهم يتمسكون بطبيعة الحال على الجدران من الزجاجات بسبب بقايا الطعام يطير. لا الغراء إضافي مطلوب. إذا الخوادر العصا ليس جيدا بما يكفي بسبب ارتفاع نسبة الرطوبة، افتح طبق بتري لمدة دقائق قليلة السماح لهم الجافة. وبدلاً من ذلك، نقلها إلى الوجهين الشريط على شريحة زجاج، ولكن عادة، هذا ليس ضروريا.
2. فتح نافذة في حالة الخوادر لتصوير عضلات الطيران غير المباشر (الشكل 1 واو؛ انتقل إلى المقطع 2.3 لتصوير عضلات البطن).
   1. توجيه الخوادر إصرارها على الشريحة الزجاجية مع المواجه الأمامي بعيداً عن الباحث تحت ستيريوميكروسكوبي. ضبط التكبير/التصغير إلى 2 X.
   2. باستخدام واحدة من نهاية علم الأحياء الصف #5 الملقط، بلطف كزة ثقب في القضية الخوادر الظهرية إلى الجناح حيث ينتهي البطن والصدر يبدأ.
   3. إلى شريحة مفتوحة في حالة الخوادر، بلطف الانتقال الملقط إلى نهاية الأمامي من القفص الصدري على طول الجناح ولكن تجنب إتلاف الأنسجة الضعيفة الجناح.
      ملاحظة: إذا تسرب السائل من الخادرة، أنه معطوب؛ تخلص منه والبدء من جديد مع عذراء مختلفة.
   4. أرفع المقطع القضية الخوادر فوق الصدر مع الملقط وثم قطعت هذا المقطع مع مقص حاد، وغرامة على الجانب الآخر من خط الوسط الظهرية.
3. فتح نافذة في حالة الخوادر للتصوير لعضلات البطن (الشكل 1)
   1. توجيه الخوادر إصرارها على الشريحة الزجاجية مع المواجه الأمامي نحو الباحث تحت ستيريوميكروسكوبي. ضبط التكبير/التصغير إلى 2 X.
   2. باستخدام واحدة من نهاية علم الأحياء الصف #5 الملقط، بلطف كزة ثقب في القضية الخوادر الظهرية إلى الجناح حيث ينتهي الصدر والبطن يبدأ.
   3. إلى شريحة مفتوحة في حالة الخوادر، تحرك بلطف الملقط نهاية الخلفي من البطن.
      ملاحظة: إذا تسرب السائل من الخادرة، أنه معطوب؛ تخلص منه والبدء من جديد مع عذراء مختلفة.
   4. أرفع المقطع القضية الخوادر أعلى البطن بالملقط وثم قطعت هذا المقطع مع مقص حاد، وغرامة على الجانب الآخر من خط الوسط الظهرية.
4. جبل الخوادر (الشكل 1 ح)
   1. استخدام فرشاة مبللة لنقل الخوادر ليصل إلى خمسة إلى شريحة بلاستيكية مع أخدود (المناقشة انظر المواصفات، القابل لإعادة الاستخدام، وقائمة بالمواد). إضافة كوفيرسليبس فاصل واحد أو اثنين لكل جانب اعتماداً على عمق الاخدود وسمك الخوادر. وضع قطره صغيرة من الماء تحت كل ساترة مباعدة لجعله عصا للشريحة، وترك بعض المساحة بين الاخدود وكوفيرسليبس فاصل على كل جانب.
      ملاحظة: كوفيرسليبس فاصل يمكن أيضا تكون مربوطة إلى الشريحة مع سوبر الغراء، مقدما.
   2. توجيه الخوادر في أن يواجه فتح في القضية الخوادر صعودا باستخدام الفرشاة. ضمان الموضع الدقيق الخوادر في الزاوية الصحيحة لجودة التصوير جيدة. تحسين الزاوية لكل الأنسجة والوقت الإنمائية نقطة.
      ملاحظة: كمية صغيرة من المياه في الاخدود يجعل الموضع الخوادر أسهل. استنزاف المياه الزائدة مع الفرشاة بعد ذلك لتجنب الغرق.
   3. اضغط ساترة (18 × 18 ملم) أعلاه الخوادر دون لمسها. ضع قطرات صغيرة (حوالي 0.5 ميليلتر) الحل والغليسيرول 50% أعلاه كل حالة الخوادر تفتح على ساترة استخدام ماصة 20 ميليلتر.
      ملاحظة: هذا الإجراء يضمن القطرات نفس المسافات الخوادر.
   4. اقلب ساترة ووضعه فوق الخوادر باليد أو باستخدام الملقط (القياسية #5) بينما يستريح جانب واحد من ساترة على كوفيرسليبس مباعدة جوار الخوادر. المقبل، بلطف إسقاط ساترة على الخوادر. ضمان أن الفتحات القضية الخوادر مغطاة بشكل صحيح والغليسيرول 50% لجودة تصوير جيدة ومنع الخوادر من جفاف.
   5. إضعاف أكثر من واحدة من نهاية قطعة من شريط لاصق والاستيلاء عليها بالملقط (القياسية #5) في تحقيق هذه الغاية. بلطف ضع الشريط أن يغطي حافة واحدة ساترة العلوي، coverslip(s) فاصل والشريحة البلاستيكية على جانب واحد. لا تضغط أسفل الشريط، حتى الآن. أولاً، يستدير الشريحة وكرر للجانب الآخر.
   6. استخدام كلا الأصابع مؤشر إلى اضغط أسفل الشريط في نفس الوقت على كلا الجانبين. يضمن هذا الإجراء الخوادر مشردون لا.
   7. تحقق ما إذا كان الخوادر أيضا على اتصال ساترة. لجودة التصوير الأمثل ينبغي أن تقلص الخوادر بلطف تحت ساترة. ضبط عدد كوفيرسليبس فاصل إذا لزم الأمر.
   8. تسمية الشريحة بالكتابة على الشريط لزجة.

3-يعيش التصوير الخوادر

1. يسمح أسلوب تركيب تصوير الخوادر المجهر المقلوب (الرقم 1I) والمجاهر تستقيم (الرقم 1J). خاصة مناسبة لتصوير حية تقوم بمسح مجاهر [كنفوكل]، والمجاهر اثنين-فوتون، والغزل القرص مجاهر [كنفوكل] بغض النظر عما إذا كانت هي مقلوب أو تستقيم. للأفلام الطويلة الأجل، واستخدام مرحلة التحكم في درجة الحرارة إذا كانت متوفرة.
2. باستخدام العين ومصباح الأشعة فوق البنفسجية أو انتقال الضوء، حدد عذراء والتركيز داخل الخادرة.
3. باستخدام الكاميرا، إيجاد هيكل المرجوة، وضبط مستوى التكبير/التصغير.
4. للأفلام الطويلة الأجل، تعريف كدسة z يشمل هيكل مصلحة جيدا (على سبيل المثال، عضلات الطيران غير المباشر أو مواقعهم مرفق، وخلايا الأربطة أو مزيج المذكورة آنفا) واختر فاصل زمني. النظر في القيام بحساب متوسط لتحسين جودة الصورة. للأفلام القصيرة الأجل وعالية السرعة، اختر z-طائرة واحدة لتحقيق معدل إطارات عالية.
5. ضبط السلطة الليزر لإعطاء أفضل إشارة ممكنة ولكن القليل من التشبع. ومع ذلك، يمكن أن تلحق الضرر السلطة ليزر عالية جداً الخادرة على مر الزمن.
6. بدء التصوير والعودة من وقت لآخر للتحقق من الفيلم وإعادة ضبط موضع z-المكدس إذا لزم الأمر.

رقم 1: سير العمل لتصوير مباشر من morphogenesis وتر العضلات في الخوادر المورفولوجية . انظر البروتوكول للحصول على التفاصيل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

النتائج

يمكن أن تكون مختلف الأنسجة المصورة في فيفو في تطوير الخوادر يطير، يجعلها نظام نموذج مثالي لدراسة morphogenesis الأجهزة الكبار. ومن بين هذه هي عضلات الطيران غير المباشر وظهاره الجناح، وعضلات البطن وظهاره الصدر بما في ذلك الخلايا وتر القلب^22،،من^2324،،من^{2526 , 27}-وهنا، علينا أن نركز على تصوير مباشر من morphogenesis عضلة ووتر. للاطلاع على وصف تفصيلي للرحلات غير المباشرة العضلات والعضلات البطن morphogenesis وأساليب إضافية لدراسة البيولوجيا العضلات في المورفولوجية، نشير للقارئ إلى ويتكونات و Schnorrer 2014²².

يعيش التصوير عضلات الطيران غير المباشر

وأعرب لدراسة التنمية الطويلة الأجل في عضلات الطيران غير المباشرة تتكون من العضلات دورسولونجيتودينال (دلمس) والعضلات دورسوفينترال (دفمس)، مويسين كروي معلم المجال أكتين-الربط مع التجارة والنقل (UAS--التجارة والنقل-التقييم) في جميع العضلات باستخدام عامل محسن ميوسيتي 2 (Mef2)--GAL4 برنامج التشغيل (الشكل 2 أ-د، فيلم S1). قبل التصوير، وفتح نافذة في قضية الخوادر أعلاه الصدر كما هو مبين في الشكل 1 واو. في مجهر اثنين-فوتون، اقتنى z-مكدسات كل 20 دقيقة ح 21 بدءاً إيتش وان وان ح بعد تشكيل بوباريوم (11 ح الاتحادية). في هذا الإطار الزمني، دلمس (الأخضر التراكبات في الشكل 2 ألف'-D') الشروع أولاً في مرفق بوتر الخلايا (الشكل 2A) وثم تقسيم حين تنضج المرفقات العضلات (الشكل 2). بعد ذلك، ميوتوبيس تقصير (الشكل 2) حتى تصل أخيرا إلى مرحلة ضغط الحد الأقصى في 30 ح APF (الشكل 2D). أخذت معا، هذا الفيلم يسلط الضوء على التغيرات الهائلة في مورفولوجيا العضلات التي تحدث على مقياس الوقت لساعات.

رقم 2: يعيش تصوير للرحلات غير المباشرة morphogenesis عضلة ووتر. (أ-د) الوقت النقاط من فيلم اثنين-فوتون (فيلم S1) باستخدام Mef2-GAL4، UAS-التجارة والنقل--التقييم كعلامة أكتين في عضلات الطيران غير المباشرة تتكون من العضلات دورسولونجيتودينال (دلمس، أبرزت باللون الأخضر في أ '-د') و (العضلات دورسوفينترال دفمس، وأبرزت باللون الأزرق في ألف '-د'). هي أشرطة مقياس 100 ميكرومتر. (ه-ح) النقاط الزمنية من فيلم اثنين-فوتون (فيلم S2) باستخدام Duf-GAL4، UAS-CD8-بروتينات فلورية خضراء كعلامة لعضلات الطيران غير المباشر وظهاره الصدر بما في ذلك الخلايا وتر. ألواح ه '--ح' إظهار تراكب مع نموذج النظام وتر العضلات في كل نقطة من الزمن، تسليط الضوء على امتدادات طويلة الخلوية التي شكلتها ظهارة وتر (أرجواني) على اتصال بالعضلات (أخضر). أشرطة مقياس من 100 ميكرومتر (يقدر حجم هياكل المصورة). (أنا-L) الوقت النقاط من غزل، اللونين [كنفوكل] فيلم قرص (فيلم S3) مع التركيز على استهلال مرفق وتر العضلات. تتم تسمية الخلايا وتر مع ريال-GAL4، UAS-النخيل-مشري (أرجواني) ودورسولونجيتودينال غير المباشرة طيران العضلات مع Mhc-تاو-التجارة والنقل (أخضر). أشرطة مقياس من 10 ميكرون. الوقت يرد ك hh: mm بعد تشكيل بوباريوم (الاتحادية). علما بأن ليس كل الأفلام تم الحصول عليها في مرحلة التحكم في درجة الحرارة، لذلك، قد تختلف توقيت التنموية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

لدراسة morphogenesis الأربطة والعضلات وفي الوقت نفسه، أعرب زمنياً غشاء بروتينات فلورية خضراء (UAS-CD8-التجارة والنقل) باستخدام دومبفونديد (Duf)-GAL4 كسائق، التي يعبر عنها كل من خلايا الأربطة والعضلات الرحلات غير المباشرة (الشكل 2E -ح، فيلم S2). ض-كومة اتخذت في مجهر اثنين-فوتون كل 20 دقيقة ابتداء من الساعة 16 ح الإدارة العامة الاتحادية ح 20. في حين ضغط ميوتوبيس (تراكب الخضراء في الشكل 2E'-ح')، الوتر الخلايا نموذج ملحقات الخلوية منذ وقت طويل أن تمديد مع الوقت (تراكب الأرجواني في الشكل 2E'-ح'). أخذت معا، هذا الفيلم يسلط الضوء على التفاعل الوثيق بين وتر والعضلات الخلايا في الجسم الحي.

للتحقيق في عضلة وتر التفاعل بمزيد من التفصيل، أنجز التصوير باللونين، عالية التكبير. الخوادر مع سلسلة ثقيلة الميوسين (Mhc)-تاو-التجارة والنقل في دلمس و UAS-بالميتويلاتيد-مشري (UAS-النخيل-مشري) يقودها الشريطية (sr)-GAL4 في الأوتار تم تصويرها كل 5 دقائق ابتداء من الساعة h 12 الإدارة العامة الاتحادية ح 4.5 على قرص غزل مجهر [كنفوكل] (الشكل 2 طاء-L، فيلم S3). في h 12 الإدارة العامة الاتحادية، ترحيل myotubes نحو تلك الخلايا الهدف وتر مع تشكيل فيلوبوديا طويلة في هذه النصائح (الشكل 2 طاء). وفي وقت لاحق، عضلة ووتر الأنسجة إينتيرديجيتاتي (الرقم 2J، ك) شكل ملحق مستقرة. نضوج المرفق، أقل فيلوبوديا شكل وواجهة وتر عضلة سموثينس (الشكل 2 لتر). وهكذا، يمكن استخدام التصوير باللونين، عالية التكبير للكشف عن ديناميات الخلوية بالتفصيل في الحي.

يعيش التصوير لعضلات البطن

لتصوير حية في عضلات البطن (الشكل 3، فيلم S4)، Mef2-GAL4> UAS-CD8-استخدمت بروتينات فلورية خضراء كعلامة وتم فتح نافذة أعلى البطن في حالة الخوادر ك المبين في الشكل 1. مماثلة للفيلم العضلات الرحلات غير المباشرة ممثلة في الشكل 2 أ-د، تشكيل ونمو عضلات البطن يمكن اتباعها على مدى ساعات عديدة من التنمية (ح 55 في فيلم S4). وخلال هذا الوقت، الصمامات ميوبلاستس بشكل متزايد myotubes (الشكل 3A). نصائح ميوتوبي تهاجر إلى أهدافها بوتر، وبعد إرفاق إلى الخلايا وتر، يتم تشكيل وحدات تقلص العضلات، ساركوميريس، (الشكل 3B-د).

الشكل 3: يعيش تصوير للعضلات البطن morphogenesis. (أ-د) الوقت النقاط من فيلم (فيلم S4) باستخدام Mef2-GAL4، UAS-CD8-بروتينات فلورية خضراء كعلامة على اتباع morphogenesis عضلة البطن. ألواح A '-ه' إظهار تراكبات مع نماذج مجموعة العضلات البطن (الأخضر) التي تشكل حيثياته خلال مرحلة الخوادر. أشرطة مقياس من 100 ميكرومتر. الوقت يرد وصفها hh: الإدارة العامة الاتحادية. حصل الفيلم في درجة حرارة الغرفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

يعيش التصوير من ارتعاش العضلات

على النقيض من الشكل 2 و الشكل 3، يبين الشكل 4 الديناميات العضلات التي تقع في نطاق مرة ثانية: تسجيل مباشر من تقلصات العضلات. الخوادر للإعراب عن βPS-إنتغرين-بروتينات فلورية خضراء تحت الرقابة الذاتية تم تصويرها بدقة وقت 0.65 s في طائرة z واحدة في مجهر [كنفوكل] (S5 الفيلم). في المثال المعروض في الشكل 4، تم تصويرها مواقع ثلاثة دفمس (الشكل 4 أ) المرفق لمدة 10 دقيقة ابتداء من الساعة 42 ح الإدارة العامة الاتحادية. وخلال هذا الوقت، لوحظت أحداث نشل الخمسة (الشكل 4 باء-F)، تبين أن ساركوميريس الفعل تجميع جيدا بما يكفي لدعم المنسقة تقلصات في هذه النقطة الزمنية في التنمية. ومن ثم، يمكن استخدام التصوير من ارتعاش العضلات كقراءة وظيفية ساركوميروجينيسيس الفعل أثناء الرحلة غير المباشرة العضلات التنمية²⁸، بدلاً من اختبارات الطيران على سبيل المثال، التي يمكن أن يؤديها إلا بعد اكلوسيون.

الشكل 4: يعيش التصوير من ارتعاش العضلات. (أ) أول مرة-نقطة من فيلم (فيلم S5) عرض رفة العضلات دورسوفينترال الرحلات غير المباشرة في استخدام APF ح 42 βPS-إنتغرين-بروتينات فلورية خضراء كعلامة. في مجال الرؤية العضلات مواقع المرفق 2 ثانيا طبيب بيطري, طبيب بيطري الثالث 1 و 2 ثالثا طبيب بيطري. (إف ب) لون تراكبات من خمسة أحداث نشل الفردية، كل عرض الإطار قبل نشل (أرجواني) والإطار الأول من الحدث نشل (أخضر). ملاحظة أن نشل ألياف العضلات الفردية بشكل مستقل عن بعضها البعض. سهام إبراز الاقتراح الوخز. حل وقت الفيلم 0.65 أشرطة مقياس س. هي 25 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

يعيش التصوير من البروتينات اندوجينوسلي المعلمة

مماثلة إلى βPS-إنتغرين-التجارة والنقل، ومجموعة كبيرة من البروتينات الانصهار المعرب عنها في المورفولوجية تحت الرقابة الذاتية قد ولدت^2،،من³⁴. يمكن استخدام هذه الخطوط الطيران للدراسة على سبيل المثال التعريب سوبسيلولار أو ملامح تعبير البروتينات ذات الاهتمام. جمع مفيد بشكل خاص إذا كانت الأجسام المضادة المحددة غير متوفرة أو ديناميات البروتين بحاجة إلى أن يكون التحقيق في فيفو دون التثبيت. يبين الشكل 5 ثلاثة أمثلة للبروتينات الانصهار أعرب اندوجينوسلي من المكتبة يطير ترانسجينيومي (فترج)، وهو جين تاو لي تاي شاو (Hts)-التجارة والنقل (الشكل 5 ألف، باء)، تالين-التجارة والنقل (الشكل 5، د) و βTubulin60D--التجارة والنقل ( الشكل 5E، و). التعبير عن هذه البروتينات يمكن دراستها في جميع الأنسجة بالتعبير عنها بطبيعة الحال. هنا، نعرض ظهارة الصدر (الشكل 5 أ، ج، ه) وعضلات الطيران غير المباشر أو مواقعهم مرفق (الشكل 5، د، و) كأمثلة.

الرقم 5: تصوير مباشر من اندوجينوسلي معلم البروتينات. (أ، ب) الحد الأقصى من الإسقاطات z-مكدسات المتخذة الخوادر للإعراب عن Hts-التجارة والنقل. (ج، د) الحد الأقصى من الإسقاطات z-مكدسات المتخذة الخوادر للإعراب عن تالين-التجارة والنقل. (ه، و) الحد الأقصى من الإسقاطات z-مكدسات المتخذة الخوادر للإعراب عن βTubulin60D-التجارة والنقل. لوحات ألف وجيم وهاء إظهار ظهارة الصدر في ح 18 و 24 و 18 الاتحادية، على التوالي، وألواح ب د وو إظهار عضلات الطيران غير المباشر أو مواقعهم مرفق في 30 ح الإدارة العامة الاتحادية. أشرطة مقياس هي 25 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

البروتوكول قدم وصف كيفية صورة morphogenesis وتر العضلات في المعيشة الخوادر المورفولوجية لاستخدام مجموعة متنوعة من البروتينات المعلمة فلوريسسينتلي. يمكن استخدام هذا في فيفو التصوير استراتيجية لدراسة العمليات الإنمائية في بيئتها الطبيعية للكائن الحي كامل.

من الأهمية بمكان لتجربة ناجحة للعثور على نقطة الوقت التنموية الصحيحة لتحليل. على سبيل المثال، بدء عضلات الطيران غير المباشر دورسولونجيتودينال التمسك بأهدافها وتر في إيتش وان سيكس ح APF²³ بينما عضلات البطن وضع في وقت لاحق ونعلق على طرفي فقط بين 30 و 40 ح APF²⁶. ونتيجة لذلك، ينبغي أن تستخدم الكتابات المنشورة سابقا إيجاد نقاط الوقت المناسب للتنمية لتحليل، أو إذا لم تدرس الأنسجة أو هيكل للاهتمام بالتفصيل قبل، التنمية الشاملة وقد تتسم أولاً.

لتصاعد الخوادر بنجاح على شرائح بلاستيكية مبنية خصيصا، من المهم أن الأخاديد أبعادا مناسبة: الأخاديد الحاجة إلى 1.0-1.5 مم على نطاق واسع و 0.3-0.4 ملم العميق. ويسمح هذا العمق ضبط المسافة الدقيقة إلى ساترة العلوي مع فاصل كوفيرسليبس حسب الحاجة. ومع ذلك، ساترة فاصل واحد على الأقل ينبغي أن تستخدمها لتجنب استنزاف والغليسيرول 50% بعيداً عن العينة القوى الشعرية. الموضع الصحيح من الخوادر في groove يتطلب بعض الخبرة، وينبغي أن يكون الأمثل أن هيكل للاهتمام أقرب ما يمكن إلى ساترة.

إذا كان عدد كبير من الخوادر المفترض أن يتم تصويرها في الدورة مجهر واحد، ويمكن جميع مثبتة مسبقاً وثم تخزينها في حاضنة حتى التصوير لضمان التوقيت التنموي السليم. ينبغي الخوادر البقاء على قيد الحياة الإجراء بأكمله وأيضا على الأقل محاولة اكلس إذا أبقى على الشريحة بعد تصوير. يمكن استخدام معدل البقاء على قيد الحياة كقراءات للتحقق ما إذا كانت ظروف التصوير تضر الخوادر.

وينبغي اختيار إعدادات التصوير بعناية وفقا لمتطلبات التجريبية. للأفلام القصيرة الأجل، يحتاج معدل إطارات عال مقابل نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية أن تكون متوازنة، بينما يمكن استخدام طاقة الليزر العالية نسبيا دون الأضرار الخوادر كثيرا. ومع ذلك، للأفلام الطويلة الأجل، قوة الليزر إبقاؤها عند مستوى معتدل وينبغي أن لا تصويرها الخوادر باستمرار بل في بعض النقاط الزمنية، على سبيل المثال، كل 20 دقيقة. للتأكد من أن هيكل المصلحة عدم الخروج من مجال الرؤية، قد يكون من الضروري إعادة ضبط الموضع من z-المكدس بين النقاط الزمنية. على حد علمنا، فتح القضية الخوادر في حد ذاتها لا تؤثر على توقيت التنموية. ومع ذلك، ينبغي استخدام مرحلة التحكم في درجة الحرارة لأفلام طويلة الأجل لضمان التوقيت التنموي السليم. مراعاة هذه الاعتبارات، يمكن الحصول على أفلام الزاخر.

يمكن استخدام البروتوكول المقدم لتصور morphogenesis وتر العضلات ليس فقط ولكن أيضا الأنسجة النامية الأخرى، على سبيل المثال، الجناح ظهارة²⁹. فقط ثلاثة تعديلات على هذا البروتوكول المطلوبة: (1) فتح القضية الخوادر أعلاه الجناح بدلاً من الصدر أو البطن، (2) تحديد المواقع الخوادر مع الجناح نحو ساترة الأعلى، و (3) استخدام علامة نيون مختلف البروتينات. مع النهوض كريسبر/Cas9-التكنولوجيا، البروتينات الفلورية كلمات أكثر وأكثر اندوجينوسلي تكون متاحة، وأنها أصبحت أكثر وضوحاً لاستهداف المكاني الذاتية في المورفولوجية^{30،31 , 32}-في المستقبل، وهذا سيتيح توضيح ديناميات العديدة البروتينات، والخلايا والأنسجة كاملة في بيئتهم الفسيولوجية بالتفصيل.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope	Leica	MZ6	product has been replaced by Leica M60
fly food in bottles (or vials)	-	-	standard culture medium
paint brush	da Vinci	1526Y	size 1
microscope slides	Thermo Scientific	VWR: 631-1303	76 x 26 mm
double-sided tape (optional)	Scotch	6651263	12 mm x 6.3 m
petri dishes	Greiner Bio-One	632102	94 x 16 mm
paper tissues	Th.Geyer	7695251
forceps #5 (Dumont, inox, standard)	Fine Science Tools	11251-20	0.1 mm x 0.06 mm tip
forceps #5 (Dumont, inox, biology grade)	Fine Science Tools	11252-20	0.05 mm x 0.02 mm tip
Cohan-Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-02	straight tip
plastic slides with a groove (reusable)	custom-built	-	75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove
coverslips	Marienfeld	107032	18 x 18 mm, No. 1.5H
glycerol	Sigma-Aldrich	49781	dilute to 50 % in water
adhesive tape	Tesa	57370-02	1.5 mm x 10 m