Vivo에서 근육-힘 줄 Morphogenesis 초파리 번데기에의 이미징

요약

여기, 우리 라이브 이미징 일반 및 근육-힘 줄 morphogenesis 개발 프로세스의 특히 생활에서 수행 하는 쉬운--사용 하 고 다양 한 방법 제시 초파리 번데기.

초록

힘 줄 및 골격 근육 그들의 본체 부품을 이동 하는 인간을 포함 한 동물을 사용 합니다. 근육 morphogenesis이 매우 인 간에 게 동물에서 보존 됩니다. 따라서, 강력한 초파리 모델 시스템 공부 또한 인간의 근육 생물학에 적용 될 수 있는 근육-힘 줄 개발의 개념을 사용할 수 있습니다. 여기, 우리가 자세히 설명 생활, 성인 근육-힘 줄 시스템의 morphogenesis 수 쉽게 몇 군데 하는 어떻게 초파리 번데기를 개발. 따라서, 방법 단백질, 세포와 조직 그들의 생리 적인 환경에서 조사 하 고 있습니다. 유용한 팁과 단계별 프로토콜, 뿐만 아니라 우리는 근육-힘 줄 시스템을 공부에 대 한 적합 한 붙일 태그가 마커 단백질의 포괄적인 개요를 제공 합니다. 프로토콜의 다양 한 응용 프로그램을 강조 하기 위해 우리 예 영화 장기 전체적 이벤트의 시각화에서 배열-시간과 일-근육 경련 같은 단기 동적 프로세스의 시각화의 시간 규모에 표시 초의 시간에 발생합니다. 함께 찍은,이 프로토콜 설계 하 고 그대로 유기 체에서 근육-힘 줄 morphogenesis 조사에 대 한 라이브 이미징 실험을 수행할 리더를 사용 해야 합니다.

서문

근육-힘 줄 장치 그들의 본체 부품을 이동 하는 인간을 포함 한 동물을 수 있습니다. 근육-힘 줄 시스템의 분자 빌딩 블록은 매우 보존. 따라서, 인간의 근육 생물학, 예를 들면 근육 morphogenesis, 근육-힘 줄 부착 및 myofibril 자기 조직에 대 한 관련 된 근육-힘 줄 개발의 개념 공부 될 수 있다 초파리 melanogaster 를 사용 하 여 쉽게 접근할 수로 모델 시스템입니다. 초파리 번데기 시스템 실험 장점이 몇 가지 있습니다. 첫째, 번데기 단계-성인 근육 형성 된다-때 유기 체는 착 하 고 몇 시간 또는 일 기간 동안에 현미경 이미지를 따라서 쉽게. 둘째, 많은 근육 양식 가까운 번데기 표면 아래에 그들은 그대로, 부분적으로 반투명 유기 체 안에 군데 될 수 있도록. 셋째, 근육 힘 줄 세포를 통해 형성 외 골격에 연결 된 및 조직 긴장은 쌓아 그들의 자연 환경에서 조사 될 수 있습니다. 이 근육 세포 배양 시스템에서 불가능합니다. 그리고 마지막으로, 유전 도구의 과다 초파리에서 사용할 수 있습니다. 이러한 가운데 많은 붙일 태그가 마커 특정 세포 유형 또는 vivo에서화상 진 찰에 대 한 subcellular 구조의 라벨을 허용 하는 있다.

표 1 에 요약 근육-힘 줄 morphogenesis 공부에 사용 하는 가장 중요 한 마커 합니다. 그것은 overexpressed GAL4 UAS 시스템¹ 을 사용 하 여 마커를 포함 하 고 endogenously 태그 단백질 마커^2,,34. GAL4 UAS 시스템의 장점은 마커 쉽게 전체 산 번데기에는 몇 군데 수 강한 신호에 따른 높은 수준에서 일반적으로 표현 됩니다. 또한, 조직 특이성 GAL4 드라이버를 신중 하 게 선택 하 여 얻을 수 있습니다. 생 제어에서 표현 하는 융합 단백질의 장점은 각각 단백질의 역학 공부 수 비보에, 그들은 다른 세포 유형 또는 특정 subcellular 구조에 대 한 표식으로 사용 될 또한 수 있지만 예를 들어 ΒPS-Integrin-GFP 근육 첨부 파일 사이트. 함께, 이러한 마커 실험 설계 및 선택의 현재와 미래에 해결 될 수 있는 연구 문제에 높은 유연성을 제공 합니다.

분류 구조

표식

식 및 지역화

클래스

재고 번호

댓글

참고

근육

Mef2-GAL4

모든 myoblasts와 모든 단계에서 모든 근육

GAL4 선

BL 27390

5

1151-GAL4

성인 근육 선구자와 이른 myotubes ≈24 h APF까지

GAL4 라인, 증강 트랩

-

6

Act79B-GAL4

차별화에 따라 근육을 점프

GAL4 선

-

7

Act88F-GAL4

간접적인 비행 근육 ≈14 h APF 시작

GAL4 선

-

7

Act88F-Cameleon 3.1

간접적인 비행 근육 ≈14 h APF 시작

Act88F 증강 발기인 운전 Cameleon 3.1 /

-

캘리포니아2 + 표시기

8

Act88F-GFP

간접적인 비행 근육 ≈14 h APF 시작

GFP 융합 (플라이 TransgeneOme 선)

fTRG78 및 fTRG10028

4

그-nls-GFP

성인 근육 선구자, 핵, ≈24 h APF 간접 비행 근육에까지

nls-GFP 기자와 증강/발기인

-

1.5 kb 증강 조각

9

Mhc-타우-GFP

microtubules DLM 템플릿 및 근육 분화

타우-GFP 기자와 증강/발기인

BL 53739

10

ΒTub60D-GFP

microtubules (예: ≈14 h AFP, 강하게 ≈48 h APF 후 감소에서 간접 비행 근육)에 myotubes에서

GFP 융합 (플라이 TransgeneOme 선)

fTRG958

4

Mhc-GFP (weeP26)

(예: 간접 비행 근육 ≈30 h APF에서에서 시작)에 있는 모든 신체 근육에 sarcomeres (두꺼운 필 라 멘 트)

GFP-트랩

-

사용 heterozygous, isoform 하위 집합 레이블

11

Sls-GFP

(예: 간접 비행 근육 ≈30 h APF에서에서 시작)에 있는 모든 신체 근육에 sarcomeres (Z-디스크)

GFP-트랩 (파리 통 선)

-

G53 heterozygous 사용

2

Zasp66-GFP

모든 신체 근육에 Z-디스크

GFP-트랩 (파리 통 선)

BL 6824

ZCL0663

2 , 12

Zasp52-GFP

모든 신체 근육에 Z-디스크

GFP-트랩 (파리 통 선)

BL 6838

G00189

2 , 12

Hts GFP

말라 바인딩; 상피, myoblasts와 myotubes로 표현

GFP 융합 (플라이 TransgeneOme 선)

fTRG585

4

Dlg1 GFP

상피 세포 접합부, myoblasts와 모든 단계에서 근육 세포 막

GFP 융합 (플라이 TransgeneOme 선)

fTRG502

4

근육 첨부 파일 사이트

ΒPS Integrin GFP

근육 첨부 파일 사이트 (예를 들어, 시작 ≈18 h AFP 간접 비행 근육)

GFP 노크에

-

13

탈린-GFP와-mCherry

근육 첨부 파일 사이트 (예를 들어, 시작 ≈18 h AFP 간접 비행 근육)

GFP-트랩 (모방 선)

-

3

탈린-GFP

근육 첨부 파일 사이트 (예를 들어, 시작 ≈18 h AFP 간접 비행 근육)

GFP 융합 (플라이 TransgeneOme 선)

fTRG587

4

Ilk GFP

근육 첨부 파일 사이트 (예를 들어, 시작 ≈18 h AFP 간접 비행 근육)

GFP-트랩 (파리 통 선)

교토 110951 (ZCL3111)

ZCL3111, ZCL3192

2

-RFP와 Vinc GFP

근육 첨부 파일 사이트 (예를 들어, 시작 ≈18 h AFP 간접 비행 근육)

GFP 융합 (transgene)

-

13

힘 줄

sr-GAL4

번데기 단계에 걸쳐 흉부 힘 줄 세포

GAL4 라인, 증강 트랩

BL 26663

homozygous 치명적인

14

근육과 힘 줄

Duf-GAL4

근육과 epithelia, 초기 증상

GAL4 선

BL 66682

kirre-rP298, 설립자 셀 표식

15

UAS-기자

UAS-GFP-Gma

말라 바인딩

UAS 선

BL 31776

GFP를 융합 하는 Moesin의 말라 바인딩 도메인

16

UAS-mCherry-Gma

말라 바인딩

UAS 선

-

Gma는 mCherry를 융합

17

UAS- Lifeact-GFP

말라 바인딩

UAS 선

BL 35544

18

UAS-Lifeact-루비

말라 바인딩

UAS 선

BL 35545

18

UAS-CD8-GFP

막 바인딩

UAS 선

다양 한 주식, 예를 들면: BL 32184

19

UAS-CD8-mCherry

막 바인딩

UAS 선

27391 및 27392 BL

20

UAS-팜-mCherry

palmitoylation 통해 막 바인딩

UAS 선

BL 34514

UAS-brainbow

21

표 1: 붙일 근육-힘 줄 morphogenesis에서 vivo에서공부를 위해 적당 한 단백질 마커 태그.

여기, 설명 자세히 어떻게 생활 pupae에서 근육-힘 줄 morphogenesis의 이미징 쉽게 그리고 성공적으로 수행할 수 있습니다 (그림 1). 또는, pupae 고쳐질 수 있다, 해 부와 immunostained 항 체 단백질을 아니 살고 마커 라벨을 사용 하 여 허용 하는 사용 가능한²². 이 경우에, 영상 품질이 일반적으로 더 높은 있기 때문에 운동 관심의 구조는 coverslip에 가까운 근접에 놓일 수 있습니다 합니다. 그러나, 해 부 및 고정 손상 하 고 분자를 발생할 수 있습니다 또는 조직 역학, 예를 들어 꿈 틀, 근육은 살아있는 유기 체에서 서만 공부 될 수 있다.

프로토콜

1. 단계 번데기

1. 20-40 처녀 암컷과 비행 음식 (그림 1A)의 병 당 약 20 남성 크로스를 설정 합니다. 또는 주식을 사용 하는 경우에 각 주식 새로운 병으로 플립. 충분 한 번데기를 얻으려면 유전자 당 2 병을 설정을 하십시오.
2. 5 ~ 6 일 (그림 1B)에 대 한 25 ° C (또는 실험적인 디자인에 따라 27 ° C)에서 병을 품 어.
   참고:과 밀을 방지 하 고 번데기의 지속적인 공급을 보장 하기 위해 파리에 2 ~ 3 일 마다 내리고 계속.
3. 젖은 브러시를 사용 하 여 병의 벽에서 백색 prepupae를 수집 하 고 유리 슬라이드 (그림 1C)에 그들을 전송. 번데기는 원하는 도달 되도록 준비 시간 라이브 현미경 이미징 시작 나이.
   참고: 이러한 prepupae 그들의 모양에서 오래 된 번데기 처럼 보이지만 그들은 여전히 애벌레 같은 흰색. Prepupal 무대의 puparium 형성 (0 h APF) 후 0 h로 정의 됩니다.
4. 젖은 브러시로 번데기에 집착 하는 비행 음식 덩어리를 제거 하 고 stereomicroscope (그림 1D)를 사용 하 여 유리 슬라이드 향해 pupae의 복 부 측 방향. 번데기는 아직도 (너무 젊은) 이동 하는 또는 그 갈색 차례 시작 했습니다 삭제 (너무 오래 된). 이렇게 하면 모든 pupae는 같은 나이 (0-1 h APF).
5. 유전자 형, 날짜와 시간 컬렉션의 슬라이드를 레이블을 지정 합니다. 한 페 트리 접시를 유리 슬라이드를 전송 하 고 (그림 1E) 밖으로 건조에서 번데기를 방지 하기 위해 젖은 조직 추가.
6. 원하는 나이 도달할 때까지 25 ° C에서 27 ° C 인큐베이터에 번데기를 저장 합니다. 번데기가 원하는 다음 단계 이미징, 전에 1 시간을 계속 예 그림 2A-D에 표시 된 영화에 대 한 13 h APF에서 라이브 영상 (3 단계)를 시작할 때 나이.
   참고: 가장 이른 가능한 시간 출발점은 27 ° c.에 8-10 h APF에서 발생 하는 번데기의 머리 eversion 후

2. 이미징 Pupae 준비

1. 그는 pupae 지금에 충실 유리 슬라이드 처럼 그들은 자연스럽 게 잔여 비행 음식 때문에 병의 벽에 붙어 확인 하십시오. 여분의 접착제는 필요 합니다. 번데기 높은 습도 때문에 충분히 충실 하지 않습니다, 그들이 말리 면 몇 분 페 트리 접시를 엽니다. 또는, 유리 슬라이드에 이중 면 테이프에 그들을 전송 하지만 일반적으로,이 필요 하지 않습니다.
2. 간접적인 비행 근육의 이미징 번데기 케이스에서 창 열기 (1 층 그림; 2.3 복 부 근육의 이미징에 대 한 섹션을 건너뜁니다.)
   1. stereomicroscope에서 연구원에서 앞쪽 방향으로 유리 슬라이드에 집착 하는 번데기를 방향을 정하십시오. 2 X 확대/축소를 조정 합니다.
   2. #5 집게를 부드럽게 학년 생물학의 한쪽 끝을 사용 하 여 복 부 끝나는 날개 등 번데기 케이스에 구멍을 찌를 하 고 흉부 시작.
   3. 번데기의 경우 오픈 슬라이스, 부드럽게 날개 따라 흉부의 앞쪽 끝에는 집게를 이동 하지만 취약 한 날개 조직 손상 방지.
      참고: 액체 누수 번데기에서 그것은 손상; 그것을 삭제 하 고 다른 번데기와 다시 시작.
   4. 집게와 흉부 위에 번데기 케이스의 섹션을 들어올린 다음이 섹션 등 쪽 midline의 반대 측에 정밀한, 날카로운가 위로 잘라.
3. 복 부 근육의 이미징 번데기 케이스에서 창 열기 (그림 1G)
   1. stereomicroscope에서 연구원으로 앞쪽 방향으로 유리 슬라이드에 집착 하는 번데기를 방향을 정하십시오. 2 X 확대/축소를 조정 합니다.
   2. #5 집게를 부드럽게 학년 생물학의 한쪽 끝을 사용 하 여 흉부 끝나는 날개 등 번데기 케이스에 구멍 그리고 복 부 시작.
   3. 번데기의 경우 오픈 슬라이스, 부드럽게 복 부의 후부 끝 집게가 이동 합니다.
      참고: 액체 누수 번데기에서 그것은 손상; 그것을 삭제 하 고 다른 번데기와 다시 시작.
   4. 집게와 복 부 위에 번데기 케이스의 섹션을 들어올린 다음이 섹션 등 쪽 midline의 반대 측에 정밀한, 날카로운가 위로 잘라.
4. 산 번데기 (그림 1 H)
   1. 젖은 브러시를 사용 하 여 플라스틱 슬라이드 그루브 (사용자, 재사용, 참조 토론과 자료의 목록)을 최대 5 개의 pupae를 전송. 홈의 깊이 번데기의 두께 따라 각 측면에 하나 또는 두 개의 스페이서 coverslips를 추가 합니다. 슬라이드에 충실 하 고 양쪽에 홈 사이의 스페이서 coverslips 일부 공간을 떠날 수 있도록 각 공백 coverslip 아래 물 작은 방울을 넣어.
      참고: 공백 coverslips 수 있습니다 또한 영구적으로 연결할 슈퍼 접착제, 슬라이드 미리.
   2. 동양 번데기는 번데기의 경우에서 오프닝 얼굴 위쪽으로 브러시를 사용 하 여. 좋은 이미지 품질에 대 한 올바른 각도로 pupae 주의 위치를 확인 합니다. 각 조직 및 발달 시간 포인트에 대 한 각도 최적화 합니다.
      참고: 작은 양의 물 홈에 게 쉽게 번데기의 위치. 브러시 나중 익사 방지를 가진 과잉의 물을 배수.
   3. 그들을 건드리지 않고 번데기 위에 coverslip (18 x 18 m m)를 개최. 위의 각 번데기 경우에 coverslip 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 50% 글리세롤 솔루션의 (약 0.5 µ L) 작은 방울을 배치 합니다.
      참고:이 절차 방식 방울 번데기로 동일한 간격 있습니다.
   4. coverslip 뒤집어 놓고 손 또는 번데기 옆 공백 coverslips에는 coverslip의 한쪽을 휴식 하는 동안 집게 (표준 #5)를 사용 하 여 번데기 위에 위치 합니다. 다음, 부드럽게 번데기에 coverslip 드롭. 번데기 케이스 구멍은 제대로 좋은 이미지 품질 및 번데기 건조 하지 않도록 50% 글리세롤 덮여 있는지 확인 합니다.
   5. 접착 테이프의 한 끝을 접어 하 고 그 끝에 집게 (표준 #5)와 그것을 잡아. 그것은 커버 최고 coverslip, 스페이서 coverslip(s) 그리고 1 개의 측에 플라스틱 슬라이드의 한 가장자리를 부드럽게 테이프를 배치 합니다. 누르지 마십시오 테이프, 아래로 아직. 먼저, 슬라이드를 돌아서 하 고 다른 측면에 대 한 반복 합니다.
   6. 두 집게 손가락을 사용 하 여 양쪽에 동시에 테이프를 눌러. 이 절차는 pupae 전치 하지는 보장 합니다.
   7. 번데기는 coverslip 연락 잘 인지 확인 하십시오. 최적의 영상 품질을 위해 번데기 한다는 coverslip 아래 부드럽게 압착 됩니다. 필요한 경우 스페이서 coverslips의 수를 조정 합니다.
   8. 스티커 테이프에 작성 하 여 슬라이드를 레이블을 지정 합니다.

3. 라이브 Pupae의 Imaging

1. 장착 방법 (그림 1I) 거꾸로 현미경에 및 수직 현미경 (그림 1J)에 번데기의 영상 수 있습니다. 특히 라이브 이미징 confocal 현미경, 2 광자 현미경 및 반전 여부에 관계 없이 회전 디스크 confocal 현미경 검사는 적합 또는 직 립. 장기적인 영화에 대 한 가능한 경우 온도 제어 단계를 사용 합니다.
2. Using은 안구 및 UV 램프 또는 빛 전송, 번데기와 번데기 안에 초점을 찾습니다.
3. 카메라를 사용 하 여 원하는 구조를 찾을 하 고 확대/축소 수준을 조정.
4. 장기적인 영화에 대 한 관심 잘 (예를 들어 간접 비행 근육, 그들의 첨부 파일 사이트, 힘 줄 세포 또는 상기 조합)의 구조를 포함 하는 z 스택을 정의 하 고 시간 간격을 선택 합니다. 더 나은 이미지 품질에 대 한 평균을 하는 것이 좋습니다. 고속, 짧은 영화에 대 한 높은 프레임 속도 달성 하기 위해 하나의 z 평면을 선택 합니다.
5. 레이저 파워 가장 좋은 가능성 신호 하지만 약간 채도를 조정 합니다. 그러나, 너무 높은 레이저 전원 시간이 지남에 번데기를 손상 수 있습니다.
6. 이미징 시작 하 고 때때로 영화를 확인 하 고 필요한 경우 z-스택 위치 재조정을 반환 합니다.

그림 1: 근육-힘 줄 morphogenesis 초파리 번데기에서의 라이브 영상에 대 한 워크플로. 자세한 내용은 프로토콜을 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

결과

다양 한 조직 이미지 vivo에서 비행 pupae, 그들에 게 성인 기관의 morphogenesis 공부 하는 이상적인 모델 시스템을 만드는 개발 될 수 있습니다. 이러한 가운데는 간접 비행 근육, 힘 줄 세포를 포함 한 흉부 상피, 날개 상피, 복 부 근육과 심장^{22,23,,2425,26 , 27}. 여기, 우리는 근육과 힘 줄 morphogenesis의 라이브 이미징에 초점. 간접적인 비행 근육 및 복 부 근육 morphogenesis 초파리에서 근육 생물학 공부에 대 한 추가 방법의 자세한 설명에 대 한 우리 Weitkunat과 겉 2014 년²²에 독자를 참조 하십시오.

간접적인 비행 근육의 이미징 라이브

공부에 대 한 dorsolongitudinal 근육 (DLMs)와 dorsoventral 근육 (DVMs), 구형 Moesin 걸 바인딩 도메인 태그 GFP (UAS-GFP-Gma)로 구성 된 간접 비행 근육의 장기적인 발전을 모두 표현 했다 Myocyte 증강 인자 요인 2 (Mef2)를사용 하 여 근육-GAL4 드라이버 (그림 2A-D, 영화 S1). 이미징, 전에 번데기의 경우에서 창 그림 1 층에서처럼 흉부 위에 오픈 했습니다. 두 광자 현미경에 z-스택 21 h h ≈11 puparium 형성 (11 h APF) 후부터 매 20 분을 인수 했다. DLMs는이 기간에서 ( 그림 2A에서 오버레이 그린'-D') 먼저 힘 줄 세포 (그림 2A)에 첨부 파일을 시작 하 고 다음 첨부 파일을 근육 성숙 (그림 2B) 동안 분할. 그들은 마침내 30 h APF (그림 2D)에서 극대로 압축된 단계를 도달할 때까지 다음에 myotubes (그림 2C) 단축. 함께 찍은이 영화는 시간 시간 규모에서 발생 하는 근육 형태에 극적인 변화를 강조 표시 합니다.

그림 2: 간접 비행 근육과 힘 줄 morphogenesis의 영상 라이브. (A-D) Mef2를 사용 하 여 두 광자 동영상 (영화 S1)에서 시간-GAL4, UAS-GFP-Gma 걸 dorsolongitudinal 근육의 구성 된 간접 비행 근육에 대 한 표식으로 (DLMs, A에서 녹색으로 강조 표시 '-D')와 dorsoventral 근육 ( DVMs, A에서 파란색으로 강조 표시 '-D'). 스케일 바는 100 µ m. (E-H) 시간 포인트 Duf를 사용 하 여 두 광자 동영상 (영화 S2)에서-GAL4UAS-CD8-GFP 간접 비행 근육과 힘 줄 세포를 포함 한 흉부 상피에 대 한 표식으로. 패널 E'-H' 각 시간 지점에서 근육-힘 줄 시스템의 모델과 오버레이 표시 하 여 근육 (녹색) 접촉 힘 줄 상피 (마젠타)에 의해 형성 된 긴 세포 확장을 강조. 스케일 바는 100 µ m (이미지 구조체의 크기에서 추정). (나-L) 포인트 2-색상, 회전 디스크 confocal 영화 (영화 S3)에서 근육-힘 줄 부착 개시에 초점을 시간. 힘 줄 세포 sr표시 됩니다-GAL4UAS-팜-mCherry (마젠타색) 및 dorsolongitudinal 간접 비행 근육 Mhc-타우-GFP (녹색). 눈금 막대는 10 µ m. 시간으로 표시 됩니다 hh: mm puparium 형성 (APF) 후. 모든 영화는 온도 제어 단계에 인수 했다, 따라서, 발달 타이밍 갈리는 수 있습니다 note. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

동시에 힘 줄과 근육 morphogenesis 공부, 막 도약 GFP (UAS-CD8-GFP)를 사용 하 여 표현 되었다 Dumbfounded (Duf)-힘 줄 세포와 간접 비행 근육 (그림 2E에서 표현 되는 드라이버로 GAL4 -H, 영화 S2). Z-스택 마다 20 분 16 h 20 h APF에서 시작 2 광자 현미경에서 촬영 됐다. myotubes을 압축 하는 동안 ( 그림 2E녹색 오버레이'-H'), 힘 줄 세포 시간 연장 양식 긴 세포질 확장 ( 그림 2E마젠타 오버레이'-H'). 함께 찍은이 영화는 힘 줄과 근육 세포에서 vivo에서사이 가까운 상호 작용을 강조 표시 합니다.

근육-힘 줄 상호 작용을 좀 더 자세하게에서 조사, 2-색상, 높은 확대 이미징 수행 되었다. Myosin 무 겁 사슬 (Mhc)와 번데기-타우-GFP DLMs 및 UAS-palmitoylated-mCherry (UAS-팜-mCherry)에 의해 구동 스트라이프 (sr)-힘 줄에 GAL4 회전 디스크에 4.5 h 12 h APF에서 시작 하는 모든 5 분 촬영 했다 confocal 현미경 (그림 2I-L, 영화 S3). 12 h APF에 myotubes 그들의 끝 (그림 2I) 긴 filopodia를 형성 하는 동안 그들의 힘 줄 대상 셀으로 마이그레이션합니다. 그 후, 근육과 힘 줄 조직 interdigitate (그림 2J, K) 안정적인 첨부 파일을 형성. 첨부 파일 성숙, 적은 filopodia 형태와 근육-힘 줄 인터페이스 (그림 2 L) 부드러운. 따라서, 2-색상, 높은 확대 영상 살아있는 유기 체에서 세포 역학을 사용할 수 있습니다.

복 부 근육의 이미징 라이브

(그림 3영화 S4), 복 부 근육의 라이브 이미징에 대 한 Mef2-GAL4> UAS-CD8-GFP를 마커로 사용 하 고 창에 자세한 그림 1G으로 번데기 경우 복 부 위에 열렸다. 그림 2A-D에서 간접 비행 근육 영화와 마찬가지로, 형성 및 복 부 근육의 성장 개발 (영화 S4 55 h)의 많은 시간 동안 다음 수 있습니다. 이 시간 동안에 myoblasts 형태로 성장 하는 myotubes (그림 3A) 퓨즈. Myotube 팁 그들의 힘 줄 대상 마이그레이션 및 힘 줄 세포에 연결 후, sarcomeres 근육의 수축 단위 형성 된다 (그림 3B-D).

그림 3: 복 부 근육 morphogenesis의 영상 라이브. (A-D) Mef2를 사용 하 여 동영상 (영화 S4)에서 시간-GAL4UAS-CD8-GFP를 마커로 morphogenesis 복 부 근육을 따라. A 패널 '-E' 번데기 단계 드 노 보 를 형성 하는 복 부 근육 세트 (녹색)의 모델 오버레이 표시. 스케일 바는 100 µ m. 시간 hh: mm APF로 표시. 영화는 실 온에 인수 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

근육 경련의 이미징 라이브

달리 그림 2 와 그림 3, 그림 4 는 초의 시간 규모에서 발생 하는 근육 역학: 근육 수축의 라이브 녹음. Pupae 생 제어에서 βPS Integrin GFP를 표현 했다 0.65의 시간 분해능으로 몇 군데 confocal 현미경 (영화 S5)에 단일 z-평면에서 s. 그림 4에 표시 된 예제에서 세 DVMs (그림 4A)의 첨부 파일 사이트 했다 42 h APF에서 시작 하는 10 분 동안 몇 군데. 이 시간 동안, 5 트 이벤트 (그림 4B-F), 관찰 되었다 그는 sarcomeres 이미 조립 충분히 개발에서이 시간 시점 조정된 수축을 지원 하기 위해 보여주는. 따라서, 근육 경련의 이미징 간접 비행 근육 개발²⁸, 예를 들어 비행 시험, 일수로 후 실행 될 수 있는 반대 동안에 이미 sarcomerogenesis에 대 한 기능 읽기로에 사용할 수 있습니다.

그림 4: 근육 경련의 영상 라이브. (A) βPS-Integrin-GFP를 마커로 42 h APF를 사용 하 여 dorsoventral 간접 비행 근육의 꿈 틀 보여주는 영화 (영화 S5)에서 처음으로 포인트. 보기의 필드에는 근육의 II 2 DVM, DVM III 1, DVM III 2 첨부 파일 사이트입니다. (B-F) 5 개별 트 위치 이벤트의 오버레이 (마젠타) 경련 전에 프레임 트 이벤트 (녹색)의 첫 번째 프레임을 보여주는 각 색. Note는 개별 근육 섬유 트 위치 하지 독립적으로 서로에서. 화살표는 꿈 틀 동작을 강조 표시합니다. 동영상의 시간 해상도 0.65 s. 스케일 바는 25 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Endogenously 태그 단백질의 이미징 라이브

ΒPS와 유사한-Integrin-GFP, 생 통제 초파리 에서 표현 하는 융합 단백질의 큰 컬렉션 생성 된^2,,34되었습니다. 이러한 플라이 라인 subcellular 지 방화 또는 관심사의 단백질의 식 프로필 예를 들어 공부를 사용할 수 있습니다. 컬렉션은 특정 항 체는 사용할 수 없습니다 또는 단백질 역학 조사 vivo에서 고정 없이 해야 하는 경우에 특히 유용. 그림 5 는 비행 TransgeneOme (fTRG) 도서관, Hu li tai shao (Hts)에서 endogenously 표현된 융해 단백질의 세 가지 예제-GFP (그림 5A, B), 중부-GFP (그림 5C, D)와 βTubulin60D-GFP ( 그림 5E, F). 이 단백질의 표현은 자연스럽 게 그들을 표현 하는 모든 조직에서 공부 될 수 있다. 여기, 우리가 보여줍니다 흉부 상피 (그림 5AC, E) 및 간접 비행 근육 또는 그들의 첨부 파일 사이트 (그림 5BD, F) 예제로.

그림 5: 단백질 태그 endogenously의 라이브 영상. (A, B) Z-스택 pupae 표현 Hts GFP의 촬영의 최대 계획. (C, D) Z-스택 pupae 표현 중부 GFP의 촬영의 최대 계획. (E, F) Z-스택 βTubulin60D GFP를 표현 하는 번데기의 촬영의 최대 계획. 패널 A, C와 E 각각, 18, 24와 18 h APF, 흉부 상피를 표시 하 고 패널 B, D 및 F 간접 비행 근육 또는 그들의 첨부 파일 사이트 30 h APF에서 표시. 스케일 바는 25 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

제시 프로토콜 설명 하는 방법을 생활에 근육-힘 줄 morphogenesis 이미지 초파리 번데기 붙일 태그가 단백질의 다양 한을 사용 하 여. 이 비보에 이미징 전략 연구 개발 프로세스 전체 유기 체의 그들의 자연 환경에서 사용할 수 있습니다.

그것은 분석을 올바른 발달 시간 지점을 찾는 성공적인 실험에 대 한 중요 합니다. 예를 들어 dorsolongitudinal 간접 비행 근육 복 부 근육 나중 개발 30 및 40 h APF²⁶사이 에서만 양쪽 끝에 연결 하는 동안 ≈16 h APF²³ 에서 그들의 힘 줄 대상에 첨부 파일을 시작 합니다. 따라서, 이전에 게시 문학 분석 개발의 적절 한 시기 포인트를 찾는 데 사용 해야 합니다 또는 조직 또는 관심의 구조 전에 자세히 공부 하지는 전체 개발 먼저 특징 있다.

맞춤식 플라스틱 슬라이드에 성공적으로 장착 pupae, 홈 적당 한 크기는 중요 하다: 홈 필요가 1.0-1.5 m m 넓고 0.3-0.4 m m 깊은. 이 깊이 필요에 따라 스페이서 coverslips와 최고 coverslip 정확한 거리를 조정 수 있습니다. 그러나, 적어도 하나의 공백 coverslip 모 세관 힘에 의해 배출 샘플에서 50% 글리세롤을 피하기 위해 사용 되어야 한다. 홈에 번데기의 정확한 위치 및 약간 경험의 구조는 coverslip에 가능한 한 가까이 되도록 최적화 되어야 합니다 필요 합니다.

Pupae의 많은 수는 한 현미경 세션에서 이미지를 경우, 그들은 수 모두 미리 탑재 되며 적절 한 발달 타이밍을 보장 하기 위해 이미징까지 인큐베이터에 저장 됩니다. 번데기 전체 절차 생존과 또한 적어도 영상 후 슬라이드에 보관 하는 경우 eclose를 하려고 한다. 생존 율 이미징 조건 번데기 손상 여부를 확인 하는 판독으로 사용할 수 있습니다.

영상 설정 실험 요구 사항에 따라 신중 하 게 선택 되어야 한다. 단기 영화에 대 한 높은 신호 대 잡음 비율에 대 한 높은 프레임 속도 상대적으로 높은 레이저 전원 번데기를 너무 많이 손상 없이 사용할 수 있습니다 하는 동안 균형 필요 합니다. 그러나, 장기 영화, 레이저 파워는 적당 한 수준에서 유지 되는 및 번데기 하지 오히려 점에서 특정 시간 마다 20 분 예를 들어 지속적으로 촬영 한다. 관심의 구조 보기의 필드 밖으로 이동 하지 않습니다 있도록 시간 점 사이 z 스택 위치를 재조정 하는 데 필요한 수 있습니다. 우리의 지식, 번데기 케이스의 오프닝 라기보다 미치지 않습니다 개발 타이밍. 그러나, 온도 제어 단계 장기 영화에 대 한 적절 한 발달 타이밍을 보장 하기 위해 사용 되어야 한다. 마음에 이러한 고려를 유지, 매우 유익한 영화 취득 될 수 있다.

근육-힘 줄 morphogenesis 뿐만 아니라 다른 개발 조직, 예를 들어 날개 상피²⁹를 시각화 하 여 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에 대 한만 세 수정이 필요: (1) 흉부 또는 복 부 대신 날개 위에 번데기 케이스의 열기, (2) 위치 최고 coverslip 및 (3) 날개와 번데기의 다른 형광 마커 단백질의 사용. CRISPR/Cas9-기술의 진보와 함께 더 많은 endogenously 태그 형광 단백질 가능할 것 이다, 그것은 되었다 초파리^30,31 생 loci를 대상으로 더 간단 하기 때문에 ^{, 32}. 미래,이 수많은 단백질, 세포 조직과 전체 세부 사항에 그들의 생리 적인 환경에서의 역학 elucidating 있게 됩니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope	Leica	MZ6	product has been replaced by Leica M60
fly food in bottles (or vials)	-	-	standard culture medium
paint brush	da Vinci	1526Y	size 1
microscope slides	Thermo Scientific	VWR: 631-1303	76 x 26 mm
double-sided tape (optional)	Scotch	6651263	12 mm x 6.3 m
petri dishes	Greiner Bio-One	632102	94 x 16 mm
paper tissues	Th.Geyer	7695251
forceps #5 (Dumont, inox, standard)	Fine Science Tools	11251-20	0.1 mm x 0.06 mm tip
forceps #5 (Dumont, inox, biology grade)	Fine Science Tools	11252-20	0.05 mm x 0.02 mm tip
Cohan-Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-02	straight tip
plastic slides with a groove (reusable)	custom-built	-	75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove
coverslips	Marienfeld	107032	18 x 18 mm, No. 1.5H
glycerol	Sigma-Aldrich	49781	dilute to 50 % in water
adhesive tape	Tesa	57370-02	1.5 mm x 10 m