ميكرومانيبوليشن الكروموسومات في سبيرماتوسيتيس الحشرات

Summary

يصف لنا في هذا البروتوكول، واختيار وإعداد الخلايا المناسبة ميكرومانيبوليشن واستخدام ميكرومانيبولاتور كهرضغطية لتغيير موضع الكروموسومات داخل تلك الخلايا.

Abstract

ميكرومانيبوليشن الكروموزومات كانت وسيلة أساسية لإلقاء الضوء على إليه كونجريشن كروموسوم، وحاجز المغزل، وحركات كروموسوم طور الصعود، وكان مفتاح لفهم ما هي الضوابط حركات كروموسوم خلال تقسيم الخلية. يمكن استخدام بيولوجي مهرة ميكرومانيبولاتور لفصل الكروموسومات من محور الدوران، لإعادة تعيين موضع الكروموزومات داخل الخلية، وتطبيق القوات على الكروموسومات باستخدام إبرة زجاجية صغيرة مع تلميح جيد جداً. بينما يمكن جعل اضطرابات الكروموسومات باستخدام أساليب أخرى مثل تعويض بصري واستخدامات أخرى لليزر، حتى الآن، لا توجد طريقة أخرى يسمح إعادة تنظيم المكونات الخلوية بمقياس من عشرات إلى مئات ميكرون مع قليل من أي ضرر للخلية .

يتم اختيار وإعداد الخلايا المناسبة ميكرومانيبوليشن الكروموسومات، تصف على وجه التحديد إعداد جندب والكريكيت spermatocyte الثقافات الأولية لاستخدامها في تصوير خلية يعيش وميكرومانيبوليشن، ووصف هنا. وباﻹضافة إلى ذلك، نعرض بناء إبرة لاستخدامها لنقل الصبغيات داخل الخلية، واستخدام ميكرومانيبولاتور كهرضغطية تسيطر جويستيك بإبرة زجاجية الملحقة بها لتغيير موضع الكروموسومات داخل تقسيم الخلايا. ويظهر عينة نتيجة استخدام ميكرومانيبولاتور لفصل كروموسوم من مغزل في سبيرماتوسيتي الأولية وتغيير موضع هذا الكروموسوم داخل الخلية.

Introduction

وكشفت ميكرومانيبوليشن أجزاء إليه كونجريشن كروموسوم، وحاجز المغزل، وحركات كروموسوم طور الصعود. وكان المنشور أقرب وصف نتائج التجارب ميكرومانيبوليشن روبرت تشامبرز¹. استخدام الدوائر ميكرومانيبولاتور ميكانيكية مع إبرة زجاج مرفقة التحقيق في السيتوبلازم لعدد من أنواع مختلفة من الخلايا. ولسوء الحظ، تباين الأساليب التي يسمح التصور من الكروموسومات والعديد من المكونات الخلوية الأخرى في الخلايا الحية لم تكن متاحة في ذلك الوقت، حيث لا تستطيع أن تثبت التجارب الدوائر آثار إعادة تموضع هذه المكونات الخلوية. ميكرومانيبوليشنز المبكر التي غيرت موقف كروموسوم يستخدم جهاز الدوائر لاكتساح ميدزوني المغزل في طور الصعود الخلايا، تبين أن مثل هذه المعالجات يمكن أن تغير موقف كروموسوم الأسلحة في طور الصعود جندب نيوروبلاستس² . نيكلاس ومعاونيه كانوا الأول من أداء غرامة ميكرومانيبوليشنز من الكروموسومات، تمتد الكروموسومات³، وفصل لهم من محور الدوران والحث إعادة توجيه^3،4، استقرار مالورينتيشن تطبيق التوتر إلى الكروموسومات^6،،من⁵⁷، وقياس القوى المنتجة بمغزل في طور الصعود^8،9. أعمال أخرى بالمعمل نيكلاس أظهرت أيضا أن حبيبات هيولى التلاعب¹⁰ وأن سينتروسوميس يمكن أن تكون إعادة ميكرومانيبوليشن¹¹. ميكرومانيبوليشن ليست مفيدة فقط لنقل الكروموسومات والمكونات الخلوية الأخرى. يمكن قطع نظيفة من خلال مغزل الانقسامية في الخلايا ديميمبراناتيد¹² إبرة ميكرومانيبوليشن أو يمكن استخدامها لحل المغلف النووية¹³. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تنصهر فيها الخلايا المتجاورة ميكرومانيبوليشن^14،15.

مع طائفة واسعة من التجارب المثيرة للاهتمام التي يمكن القيام به باستخدام ميكرومانيبوليشن، فمن المدهش للوهلة الأولى أن ميكرومانيبوليشن تجارب أجريت بعدد قليل جداً من علماء الأحياء كروموسوم. أحد أسباب هذا القصور هو أن تقسيم ميتوتيكالي الخلايا المستزرعة التي مشتقة من الأنسجة الفقاريات وتستخدم عادة لدراسة الحركات كروموسوم صعبة للغاية في ميكرومانيبولاتي. عموما لديهم هذه الخلايا زراعة الأنسجة سيتوسكيليتون القشرية أن "يحصل في الطريق" من ميكرومانيبوليشن إبرة، والكروموسومات أما لا يمكن الوصول بالإبرة أو يطحن الإبرة عن طريق الخلية، مما يؤدي إلى تمزق الخلايا والموت. ونحن، والأخرى المجربون الذين يستخدمون ميكرومانيبوليشن، وجدت الخلايا المفصلية لتكون قابلة ميكرومانيبوليشن. وتنتشر بسهولة تحت طبقة النفط الهالوكربون spermatocytes المفصلية ويبدو cytoskeleton القشرية أقل بكثير من قوي الكامنة وراء غشاء الخلية أثناء تقسيم الخلية. وهكذا، الخصيتين المفصلية توفر مصدرا جيدا لخلايا تقسيم ميوتيكالي (سبيرماتوسيتيس) وميتوتيكالي تقسيم الخلايا (سبيرماتوجونيا) مع الكروموزومات يمكن الوصول بسهولة ميكرومانيبوليشن. تقطيع المسلسل من spermatocyte جندب ثابت خلال تلاعب كشفت أن الإبرة ابدأ تخترق غشاء الخلية؛ تبعثر غشاء الخلية حول الإبرة (نيكلاس سنغ، اتصال شخصي). سبيرماتوسيتيس من عدد من الأصناف العنكبوت والحشرات، وقد تم ميكرومانيبولاتيد بنجاح، بما في ذلك الجنادب، mantids الصلاة وذباب الفاكهة، رافعة الذباب، الصراصير، سبيتليبوجس، العث، العناكب الأرملة السوداء، عناكب القبو والجرم السماوي نسج العناكب ^37،،،من^{1719،18،20،،}من²¹²². يمكن أن تكون الخلايا المستزرعة، وتقسيم ميتوتيكالي من الحشرات ميكرومانيبولاتيد. على سبيل المثال، قد الكروموسومات في neuroblasts جندب في ثقافة الابتدائي الكروموسومات التي يمكن بسهولة ميكرومانيبولاتيد^2،23. أننا نشتبه في أنه مثقف تتوفر خطوط المستمدة من المورفولوجية والحشرات الأخرى سوف تكون أيضا ميكرومانيبولاتابل، على الرغم من أننا لم تختبر هذه التقنية مع هذه الخلايا. ونحن سوف تظهر كيف يمكن إعداد تقسيم الخلايا من الجنادب والصراصير ميكرومانيبوليشن. الصراصير سهلة للحصول على معظم محلات الحيوانات الأليفة في أي وقت من السنة. الجنادب فقط التي يمكن الحصول عليها بسهولة في الصيف إلا إذا كان الباحث الوصول إلى مستعمرة مختبر، ولكن الأنواع المستخدمة (سانجوينيبيس ميلانوبلوس) وقد سويت بالأرض بسهولة الخلايا والكروموسومات طويلة، وسهلة للتعامل.

وهناك سبب آخر لماذا فعلت التجارب ميكرومانيبوليشن حفنة صغيرة من علماء الأحياء هو أن ميكرومانيبولاتورس أن تتحرك الكروموسومات نادراً ما تتوفر في السوق. وقد وجدنا أن يتحكم ميكرومانيبولاتور كهرضغطية جويستيك تسيطر حركة إبرة مع لا اهتزاز أو الانجراف الفاصلة بين الإبرة وحركة المقود، ولكن يمكن دفع أنواع أخرى من المتلاعبين بنجاح أيضا الكروموسومات حولها في الخلية. ميكرومانيبولاتورس صممه إيليس وبيج^25،26 تعتبر مثالية ميكرومانيبوليشن الكروموسومات، على الرغم من أنها تستخدم تكنولوجيا قديمة. ميكرومانيبولاتورس كهرضغطية المتوفرة حاليا والمستخدمة عادة في الكهربية؛ ومع ذلك، ليست هذه ميكرومانيبولاتورس عادة ما تسيطر عليها جويستيك. عصا التحكم هو المفتاح لحركات سلسة المطلوبة من أجل ميكرومانيبوليشن نجاح، وحتى ينبغي تشييد جويستيك مخصصة لجعل ميكرومانيبولاتورس كهرضغطية متاحة في الوقت الراهن العمل من أجل ميكرومانيبوليشن كروموسوم. وقد ميكرومانيبولاتورس كهرضغطية تسيطر على عصا التحكم التي تعمل بشكل أفضل مراقبة الموقف المباشر، الذي يترجم حركة الجويستيك مباشرة إلى حركة إبرة.

يمكن بناؤها ميكرومانيبولاتور كهرضغطية المصممة حديثا من أجزاء المتاحة تجارياً التي يمكن استبدالها بسهولة، ومن بعض المكونات المطبوعة ثلاثي الأبعاد الصغيرة، وأنه يعمل بشكل جيد كروموسوم ميكرومانيبوليشن²⁴. وقد ميكرومانيبولاتور حساسية قابلة للضبط أو دليل المواقع الخشنة، ولا الاهتزاز، والانجراف أو متخلفة في حركة الإبرة، ومراقبة الموقف المباشر من الإبرة. يمكن للعلماء بناء ميكرومانيبولاتور استخدام الإرشادات المتوفرة على الإنترنت²⁴. وفيما يلي الطرق لإعداد ثقافة خلية الأولية سبيرماتوسيتي وميكرومانيبولاتينج الكروموسومات داخل الخلايا في تلك الثقافة.

Protocol

1-إعداد ثقافة الخلية الأولية Spermatocyte الحشرات ميكرومانيبوليشن

1. إعداد الشرائح
   1. الحصول على شريحة زجاجية 75 مم × 25 مم مع فتحه دائرية قطرها 20 ملم قطع في وسط الشريحة.
      ملاحظة: هذه قطعت من ورقة واحدة من زجاج النوافذ ليكون بحجم شريحة زجاجية مع وجود ثقب في الوسط.
   2. تشغيل ساترة 25 مم × 25 مم #1.5 عن طريق لهب موقد بنسن 2 s.
   3. تطبيق فراغ الشحوم حول حافة الثقب في الشريحة الزجاجية
   4. مكان ساترة في حفرة كما في الشكل 1. اضغط عليه وتأكد من أن تشكل ختم ضيق.
   5. الوجه الشريحة الزجاجية وملء التشريح جيدا مع زيت الهالوكربون.
2. إعداد الثقافة سبيرماتوسيتي للعرض على المجهر
   ملاحظة: هنا، نحن تصف طريقة إعداد ثقافة استخدام الخلايا جندب أو لعبة الكريكيت. يمكن مثقف محتويات الخصيتين المفصليات الأخرى باستخدام أسلوب مماثل.
   1. الحصول على سوبادولت الصراصير الذكور (أو الجنادب). مكان الحشرات حية في ثلاجة لحوالي 2 دقيقة تخدير من البرد. استخدام مقص تشريح، بسرعة قطع من خلال سطح الظهرية موازيا للمحور الطويل للبطن مباشرة خلف براعم الجناح. يدوياً ضغط البطن برفق لدفع الخصيتين من خلال خفض الهيكل الخارجي (الشكل 2).
   2. استخدام الملقط، مكان الخصيتين معزولة في تشريح جيدا المحتوية على زيت الهالوكربون.
   3. إذا لزم الأمر، عرض الخصيتين تحت مجهر تشريح. تقسيمها إلى أجزاء أصغر باستخدام الملقط أشار الجميلة، إزالة الدهون أي يغطي الخصيتين، واستخدام الملقط غرامة-وأشار إلى تفريق الخصيتين (الشكل 3 ألف و 3 باء). نشر محتويات الخصيتين تحت النفط، على سطح ساترة (الشكل 3).
   4. نشر محتويات الخصيتين حتى يتم انتشار جزء من الخصية الكاد للعيون (الشكل 3). استخدام الآبار تفارق تحميل النفط الإضافية إذا لزم الأمر.

2-ميكرومانيبوليشن

1. الإنتاج ميكرونيدلي
   1. ضع واحدة من نهاية أنبوب الزجاج (0.85 مم في القطر الخارجي، 0.65 مم في القطر الداخلي) في شعلة الموقد بنسن. سحب نهاية الأنابيب الزجاجية بطريقة أن يتم تشكيل زاوية 150 درجة، وهو إنشاء منطقة واسعة من أنابيب زجاجية ضيقة. كسر الأنابيب في منطقة رقيقة حيث يكون منطقة رقيقة تمتد من الزاوية حوالي 10 مم طويلة (الشكل 4 أ).
   2. استخدام ميكروفورجي (مصنوعة خصيصا وفقا لأول²⁷ أو تجارياً المتاحة انظر الجدول للمواد)، لمس غيض الإبرة الزجاجية لسلك البلاتين الساخن لإذابة الزجاج في التلميح. النموذج حوالي 45 درجة زاوية بين الإبرة وسلك البلاتين من ميكروفورجي (الشكل 4 باء). سحب الزجاج بعيداً عن الأسلاك الساخنة، بينما قطع الحرارة إلى السلك، تشكيل تلميح رقيقة من ≤1.5 مم في نهاية الإبرة الزجاج.
      ملاحظة: سيكون من الصعب قياس القطر نصيحة، لكن تلميح لهذا الطول من المحتمل أن تنتج إبرة ثابتة ولكنها مرنة وسوف تكون مناسبة ميكرومانيبوليشن. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام ساحبة ميكروبيبيتي لإنشاء أنابيب زجاجية مع قطر تلميح مناسبة (المجرب سيتعين اختبار وصفات شد مختلفة لإنتاج microneedle ثابتة لكن مرنة على نحو ملائم للوظيفة). يمكن أن توضع الإبرة في حامل أن يتشكل على نحو مماثل للتلاعب بالإبرة التي تم إنشاؤها وفقا للطريقة الموضحة أعلاه.
2. تحديد المواقع ميكرومانيبولاتور
   1. مكان الشريحة المعدة في مرحلة المجهر المقلوب، المرحلة-على النقيض. العثور على تقسيم الخلايا ومركز لهم في مجال الرؤية. وتركز على الخلايا باستخدام التكبير أقل ممكن.
      ملاحظة: كنا هدفا مرحلة-تباين X 16.
   2. مكان ميكرونيدلي في حامل الإبرة على ميكرومانيبولاتور.
   3. يدوياً ضع في ميكرونيدلي في مسار الضوء المجهر حيث غيض الإبرة مضاءة بالضوء (الشكل 5 (ب)).
   4. وتركز المجهر عدة طائرات التنسيق أعلاه أن الطائرة التي تكمن الخلايا.
   5. تغيير موضع ميكرونيدلي استخدام وحدة تحكم المقود في حساسية منخفضة عدة مرات للبحث عن ظل الإبرة في العاشر--وياكسيس. الاستمرار في تعديل الموقف حتى موقف التلميح مرئياً. ضبط موضع الإبرة على طول محور ع حتى تلميح إبرة في التركيز.
   6. تركيز على الخلايا، ثم تركز المجهر أعلاه الطائرة الخلية حيث تكون الخلايا فقط للخروج من التركيز وغير مرئية. إعادة ضبط موضع الإبرة حتى لا يكون طرفها في التركيز في هذا المستوى البؤري.
   7. ضبط تكبير المجهر حسب الحاجة.
      ملاحظة: كنا هدفا تباين مرحلة فتحه عددية (غ) 100 × 1.4 ميكرومانيبوليشن.
   8. بعد التركيز على الخلايا باستخدام هدف أعلى التكبير، مرة أخرى تركز المجهر أعلاه الطائرة الخلية حيث تكون الخلايا فقط للخروج من التركيز وغير مرئية. استخدام إعداد حساسية أعلى، إعادة ضبط موضع الإبرة حيث يكون طرفها هو في التركيز وتركزت في المستوى البؤري أعلاه أن الطائرة التي تكمن الخلايا.
   9. تركيز على الخلايا، وتعديل موقفها حتى يمكنهم البقاء في مركز مجال الرؤية. الإبرة جاهز الآن ميكرومانيبوليشن.
3. ميكرومانيبوليشن الكروموسومات
   1. استخدام نفس الإعداد حساسية فيما يتعلق بتحديد المواقع الجميلة في تكبير عالية، استخدام الجويستيك للسيطرة ميكرونيدلي، ودفع الكروموزومات داخل الخلية. الحفاظ على طرف إبرة فوق طائرة الخلايا.
   2. لسحب أو نقل كروموسوم، التركيز على كروموسوم القرب من الجزء العلوي من الخلية.
      ملاحظة: هذه الكروموسومات أسهل للتلاعب التلاعب بالكروموسومات قريبة من ساترة يجعل من المرجح أن الإبرة سوف طحن في ساترة، تتضاعف الخلية وتنتهي التجربة.
   3. ضبط محور ع على الجويستيك لإحضار تلميح إبرة إلى التركيز، وثم نقل تلميح الإبرة مع عصا التحكم في العاشر ويوسف مكان غيض الإبرة مباشرة على الكروموسوم التلاعب بها ودفعها في الاتجاه المطلوب للسماح المناور إلى ريبوسيتي على الصبغي.
   4. اعتماداً على مدى يتم الضغط الكروموسوم، أما تطبيق التوتر على الكروموسوم أو تطبيق التوتر كافية لفصل كروموسوم من محور الدوران. بمجرد إزالة كروموسوم من مغزل، وضعه في أي مكان داخل الخلية.

النتائج

ويبين الشكل 6 ميكرومانيبوليشن عينة من 2 جندب المتاخمة سبيرماتوسيتيس الأولية في عدة أمثلة للاستخدامات الممكنة ميكرومانيبوليشن. هذه التجربة تم استخدام مجهر تباين مرحلة مقلوب،. 0:00 (أوقات سيظهر في min:s) تظهر الصورة كلا الخليتين قبل التلاعب. ويرد كروموسوم واحد ...

Discussion

مع الممارسة، تتحرك الكروموسومات في الخلية يمكن أن تصبح طبيعة ثانية. الإبر التي تكون شديدة بما فيه الكفاية ورقيقة ذات الرؤوس بما فيه الكفاية من الصعب على "الحصول على براعة من" اختﻻق، ولكن هذه القدرة كما يأتي مع الممارسة. الإبر التي على ما يرام حتى أنها تشوه عند نقل النفط الهالوكربون لن يكون ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR micro cover glass	VWR	48366 249	25 mm x 25 mm, no 1.5
Dow Corning High Vacuum Grease	VWR	AA44224-KT
KEL-F Oil #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
Microdissecting Scissors, Stainless Steel	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps	Fine Science Tools	11254-20
0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube	Drummond Scientific	Custom order--call to request
Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective	Any brand
microforge	either custom built or Narashige	MF-900
micromanipulator	either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick	PCS-6300