Embriyolardan kromozomların böcek Spermatocytes

Özet

Bu protokol için seçim ve uygun hücreler embriyolardan için hazırlanması ve piezoelektrik micromanipulator kullanımı bu hücrelerde kromozom yeniden konumlandırmak için açıklar.

Özet

Kromozomların embriyolardan kromozom congression, iğ denetim noktası ve anafaz kromozom taşımalar için mekanizma aydınlatıcı için gerekli bir yöntem olmuştur ve ne kromozom hareketlerini kontrol anlamanın anahtarı olmuştur hücre bölünmesi sırasında. Yetenekli bir biyolog bir micromanipulator kromozomlar iğ, kromozomlar hücrenin içinde yeniden konumlandırmak için ve kuvvetler küçük cam iğne ile çok iyi bir ipucu kullanarak kromozomlar uygulamak için gelen ayırmak için kullanabilirsiniz. Süre tedirginlikler kromozomlar optik yakalama gibi diğer yöntemleri ve diğer kullanımlar bir lazer kullanılarak yapılmış, bugüne kadar başka bir yöntem onlarca yüzlerce mikron az hücre hasar yok olan ölçekte hücresel bileşenleri yeniden konumlandırma sağlar .

Seçim ve özellikle canlı hücre görüntüleme ve embriyolardan, kullanımda çekirge ve kriket spermatocyte birincil kültürlerinin hazırlanması açıklayan kromozomların embriyolardan için uygun hücre hazırlık Burada açıklanan. Buna ek olarak, biz ona bağlı bir cam iğne ile kromozomlar hücrenin ve bir joystick kontrol edilen piezoelektrik micromanipulator kullanımı içinde hareket etmek için kromozomlar sayesinde bunun bölünen hücreler içinde yeniden konumlandırmak için kullanılmak üzere bir iğne inşaatı gösteriyor. Bir örnek sonuç bir kromozom bir mil içinde bir birincil spermatocyte dan ayırmak için ve bu kromozom hücre içinde yeniden konumlandırmak için bir micromanipulator kullanımını göstermektedir.

Giriş

Embriyolardan bir kromozom congression, iğ denetim noktası ve anafaz kromozom taşımalar için mekanizma parçaları ortaya koymuştur. Embriyolardan deneylerin sonuçlarını açıklayan ilk yayın Robert Chambers¹tarafından yapıldı. Chambers mekanik bir micromanipulator bir ekli cam iğneyle sitoplazma, farklı hücre tipleri birkaç soruşturma eskiden. Kromozomlar ve birçok diğer hücresel bileşenleri canlı hücrelerdeki görselleştirme izin kontrast yöntemleri ne yazık ki, o zaman mevcut değildi, bu yüzden Chambers deneyler gibi hücresel bileşenleri yeniden konumlandırma etkileri göstermiyor. Kromozom konumu değişmiş erken micromanipulations Chambers aparatı böyle manipülasyonlar anafaz çekirge neuroblasts^{2 kromozom silah konumunu değiştirmek gösterilen iğ midzone anafaz hücrelerdeki süpürme eskiden} . Nicklas ve işbirlikçileri kromozom³germe, onları iğ ayırma ve sabitleme bir hale gelmesini^3,4, inducing kromozom, iyi micromanipulations gerçekleştirmek için ilk idi bir gerginlik kromozom^5,6,7uygulama ve anafaz^8,9mil sayısı tarafından üretilen kuvvetleri ölçerek malorientation. Diğer iş Nicklas laboratuvar tarafından sitoplazmik granüller işlenmiş¹⁰ de olabileceğini ve centrosomes embriyolardan¹¹tarafından yeniden konumlandırılmış gösterdi. Embriyolardan sadece kromozomlar ve diğer hücresel bileşenleri taşımak için kullanışlı değildir. Embriyolardan iğne temiz bir şekilde mitotik iğ demembranated hücreler¹² yoluyla kesebilir veya nükleer zarf¹³dağıtılması için kullanılabilir. Buna ek olarak, bitişik hücreleri embriyolardan^14,15tarafından erimiş.

Böyle bir yelpazede yapılabilir ilginç deneyler ile embriyolardan kullanarak, ilk bakışta şaşırtıcı embriyolardan deneyler çok az kromozom biyologlar tarafından yapılmıştır. Bu eksikliği için bir nedeni omurgalı dokulardan türetilir ve kromozom hareketleri eğitimi için yaygın olarak kullanılan mitotically bölme kültürlü hücreleri micromanipulate için son derece zor olmasıdır. Bu doku kültürü hücreler genellikle bir kortikal sitoiskeleti "embriyolardan engel" iğne ve kromozomlar da iğne tarafından erişilemiyor veya bir hücre rüptürü ve ölüm önde gelen hücreye iğne biler var. Biz ve embriyolardan, kullanan diğer Denemecileri embriyolardan için mükellef olması için eklem bacaklılar hücreleri bulduk. Eklem bacaklılar spermatocytes kolayca halocarbon yağ tabakası altında yayılır ve daha az güçlü bir kortikal sitoiskeleti hücre membran hücre bölünmesi sırasında temel gibi görünüyor. Böylece, eklem bacaklılar testis meiotically bölünmesi hücre (spermatocytes) iyi bir kaynağı sağlamak ve mitotically bölme (spermatogonia) embriyolardan için kolayca erişilebilir kromozom ile hücreleri. Düzenleme sırasında sabit bir çekirge spermatocyte bir seri kesit iğneyi asla hücre zarı nüfuz ortaya; hücre zarının iğne (Nicklas R.B., kişisel iletişim) deforms. Spermatocytes böcek ve örümcek özellikleri bir dizi micromanipulated başarıyla, çekirge, dua eden mantids, meyve sinekleri, Vinç sinekler, cırcır, spittlebugs, pervane, kara dul örümcekler, Bodrum örümcekler ve küre-dokuma örümcekler ^{edilmiştir 3,7,17,18,19,20,21,22}. Böcekler kültürlü, mitotically bölme hücrelerden micromanipulated olabilir. Örneğin, birincil bir kültür çekirge neuroblasts kromozomlar kolayca-ebilmek var olmak micromanipulated^2,23kromozom var. Biz bu hücreler ile teknik test etmedim ama mevcut Drosophila elde edilen satırları kültürlü ve diğer böcekler-ecek da var olmak micromanipulatable, şüpheli. Biz nasıl çekirge ve cırcır böcekleri hücre bölünmesi için embriyolardan hazırlanabilir gösterir. Cırcır böcekleri en evde beslenen hayvan stok--dan yılın herhangi bir zamanda elde etmek kolaydır. Çekirge, sadece sürece araştırmacı bir laboratuvar koloni erişebilir, ama kullanılan türler (Melanoplus sanguinipes) kolayca hücreleri ve uzun, kolay manipüle kromozomlar basık yaz aylarında kolayca elde edilebilecek.

Başka bir nedeni neden embriyolardan deneyler biyologlar küçük bir avuç tarafından yapılmıştır kromozomlar iyi hareket micromanipulators pazarda nadiren kullanılabilir olmasıdır. Biz bir joystick kontrol edilen piezoelektrik micromanipulator hiçbir titreşim, drift veya gecikme arasında joystick hareketi ve iğne hareketi ile iğne hareketi kontrol eder ama manipülatörler diğer türleri de başarıyla kromozomlar zorlayabilir bulduk çevresinde hücre. Eski teknolojiyi kullandıkları rağmen Ellis ve Begg^25,26 tarafından tasarlanmış micromanipulators kromozomlar, embriyolardan için idealdir. Piezoelektrik micromanipulators mevcut ve yaygın olarak kullanılan Elektrofizyoloji içinde. Ancak, bu micromanipulators genellikle joystick kontrol edilen değildir. Joystick kontrolü için başarılı bir embriyolardan gerekli düzgün hareketleri anahtarıdır ve çok özel bir joystick için kromozom embriyolardan işe Şu anda mevcut piezoelektrik micromanipulators yapmak için inşa edilmelidir. En iyisi joystick kontrol edilen piezoelektrik micromanipulators joystick hareketi doğrudan bir iğne hareket çevirir doğrudan pozisyon kontrol var.

Yeni tasarlanmış piezoelektrik micromanipulator piyasada bulunan yerlerinden kolayca değiştirilebilir ve bazı küçük 3-b yazdırılan bileşenleri inşa ve de kromozom embriyolardan²⁴için çalışıyor. Micromanipulator ayarlanabilir duyarlılık, el ile kaba konumlandırma ve hiçbir titreşim, drift veya doğrudan pozisyon kontrol iğne ve iğne hareket gecikme vardır. Bilim adamları talimatları mevcut online²⁴kullanarak micromanipulator gerçekleştirebilmesi. Aşağıda bir birincil spermatocyte hücre kültür hazırlama ve micromanipulating yöntemler vardır o kültür hücreleri içinde kromozomlar.

Protokol

1. embriyolardan için birincil böcek Spermatocyte hücre kültürü hazırlanması

1. Slayt hazırlama
   1. 75 x 25 mm cam slayt slayt Merkezi Kes şunu 20 mm çapında dairesel delik olan elde edilir.
      Not: Bu pencere cam merkezi bir deliği olan bir cam slayt boyutu kadar tek bir sayfaya gelen kesilmiş.
   2. 25 x 25 mm #1.5 coverslip koşmak-den geçerek Bunsen burner alev 2 s.
   3. Cam slayt delik kenarındaki vakum gres uygulayın
   4. Coverslip olduğu gibi resim 1delik yerleştirin. O tuşuna basın ve sıkı bir mühür oluşturmak emin olun.
   5. Cam slayt flip ve diseksiyon de halocarbon petrol ile doldurmak.
2. Spermatocyte kültür hazırlama için görüş üstünde mikroskop
   Not: Burada, çekirge veya kriket hücre kullanarak kültür hazırlama yöntemi açıklanmaktadır. Diğer eklembacaklılar içeriğini testis benzer bir yöntem kullanarak kültürlü.
   1. Subadult erkek cırcır (veya çekirge) elde edilir. Soğuk-anestezi için yaklaşık 2 dakika için bir buzdolabında yaşayan böcek yer. Diseksiyon makası kullanarak, hızlı bir şekilde dorsal yüzey karın kanat tomurcukları doğrudan arkasında uzun eksenine paralel kesti. El ile yavaşça itin testis exoskeleton (Şekil 2) kesim ile karın sık.
   2. Forseps kullanarak, izole testis de halocarbon yağ içeren bir diseksiyon yerleştirin.
   3. Gerekirse, testis diseksiyon mikroskop altında görüntüleyin. Onları testis kapsayan herhangi bir yağ kaldırma, ince sivri uçlu forseps kullanarak daha küçük parçalara bölün ve ince sivri uçlu forseps (Şekil 3A ve 3B) testisler eritmek için kullanıyorum. Testis içeriği petrol, coverslip (Şekil 3 c) yüzeyi altında yayılır.
   4. Testis yayılmış kısmı gözler (Şekil 3 c) zorlukla fark kadar testisler içeriği yaymak. Ek petrol yüklü ayrılma wells gerekirse kullanın.

2. embriyolardan

1. Microneedle imalatı
   1. (Dış çapı, 0,65 mm iç çapı 0,85 mm) cam tüp bir ucunu Bunsen burner alev içinde yerleştirin. Cam boru sonuna 150 ° açı oluşur ve bir genişletilmiş alan dar cam boru oluşturulur böyle bir şekilde çekin. Tüp ince bölgede break açıdan uzanan ince yaklaşık 10 mm uzun (Şekil 4A) bölgedir.
   2. Bir microforge kullanarak (Powell²⁷ göre özel ya da ticari olarak kullanılabilir-bkz: Malzemeler tablo), cam ucundaki eritmek için sıcak platin tel için cam iğne ucu dokunma. Formu bir iğne ve microforge (Şekil 4B) platin tel arasında yaklaşık 45° açı. Cam parçalarından uzak sıcak tel tel ≤1.5 mm cam iğne ucundaki ince ucu şekillendirme, kaloriferi kapatma sırasında çek.
      Not: Uç çapı ölçmek zor olacak ama bu uzunluğu ucu embriyolardan için de uygun bir firma ama esnek iğne üretmek olasıdır. Alternatif olarak, bir micropipette çektirmenin cam boru (deneyci bir uygun şekilde sert ama esnek microneedle iş için üretmek için farklı çekerek yemek tarifleri test etmek için vardır) bir uygun uç çapı ile oluşturmak için kullanılabilir. İğne benzer şekilde için yukarıda açıklanan yöntemine göre oluşturulan manipülasyon iğne şeklinde bir tutucu yerleştirilmiş olabilir.
2. Micromanipulator konumlandırma
   1. Hazırlanmış slayt bir ters, faz kontrast mikroskobu sahnesinde yerini. Sayesinde bunun bölünen hücreler bulmak ve onları görüş alanı içinde merkezi. Olası en düşük büyütme kullanarak hücreleri üzerinde odaklanın.
      Not: Biz bir 16 X faz kontrast objektif kullandık.
   2. Microneedle iğne bağı micromanipulator üzerine yerleştirin.
   3. İğne ucu (Şekil 5B) ışıkla aydınlatılmış el ile microneedle mikroskop ışık yolunu gösterecek şekilde konumlayın.
   4. Mikroskop hangi hücreleri yalan uçak yukarıda birkaç odak uçaklar odaklan.
   5. Oyun çubuğu denetleyicisi düşük duyarlılık X - ve y-axes içinde iğne gölgesi bulmak için birkaç kez kullanma microneedle yeniden konumlandırın. İpucu konumunu görünene kadar konumunu yeniden ayarlamak devam edin. İğne ucu odakta olana z ekseni boyunca iğne konumunu ayarlamak.
   6. Hücrelerin yönlendirmesi, sonra hücreleri sadece odağını ve görünmez olması hücre uçak üstünde mikroskop odak. Böylece ucu odak bu odak düzlemi içinde iğne konumunu yeniden düzenlemek.
   7. Mikroskop büyütme gerektiği gibi ayarlayın.
      Not: Biz embriyolardan için 100 X 1.4 sayısal diyafram (NA) faz kontrast objektif kullandık.
   8. Hücreleri sadece odağını ve görünmez olması daha yüksek büyütme objektif kullanarak hücreleri üzerinde odaklanarak sonra hücre uçak üstünde mikroskop tekrar odaklan. Böylece ucu odakta ve hangi hücreleri yalan uçak üzerinde odak düzlemi merkezli bir daha yüksek hassasiyet ayarı kullanarak, iğne konumunu yeniden düzenlemek.
   9. Görüş alanı ortasında kalırlar bu yüzden konumlarını ayarlayarak hücreleri üzerinde yönlendirmesi. İğne şimdi embriyolardan için hazırdır.
3. Embriyolardan kromozom
   1. Yüksek büyütme oranında iyi konumlandırma gelince aynı hassasiyet ayarı kullanarak, microneedle kontrol ve hücre içinde kromozomlar itip için joystick'i kullanýn. İğne ucu hücreleri uçak yukarıda tut.
   2. Çekin veya bir kromozom taşımak için hücrenin üstündeki bir kromozom odaklanmak.
      Not: Bu kromozomlar yakın coverslip iğne ve hücre patlama deneyi sona coverslip eziyet olası kılan işlemek manipüle kromozomlar için daha kolaydır.
   3. Z-ekseni üzerinde joystick odak ve o zaman hareket iğne ucu x joystick ile iğne ucunu getirmek için ayarlamak ve Y. manipüle edilebilir ve manipülatör repositi için izin vermek için istenilen yönde itmek için doğrudan kromozom üzerinde iğne ucu yerleştirin kromozom üzerinde.
   4. Bağlı olarak ne kadar kromozom itilir, gerginlik kromozom için uygulama veya bir kromozom mil üzerinden ayırmak için yeterli gerilim uygulanır. Bir kez bir kromozom bir mil kaldırılır, hücre içinde herhangi bir yere yerleştirebilirsiniz.

Sonuçlar

Şekil 6 2 bitişik çekirge birincil spermatocytes bir örnek embriyolardan embriyolardan olası kullanımlar çeşitli örnekler gösterir. Bu deney yapıldı bir ters, faz kontrast mikroskop kullanarak. 0:00 (gösterilen çırpınış içinde min:s) görüntü manipülasyon önce her iki hücreleri gösterir. Alt hücredeki bir kromozom embriyolardan iğne tarafından uygulanan gerilim altında gösterilir (0:05; siyah ok) ve o zaman tamamen müstakil iğ ...

Tartışmalar

Uygulama ile kromozomlar hücre içinde hareket etme ikinci doğa olabilir. Yeterince sert ve yeterince ince uçlu iğneler "püf noktası," zor imalatı, ama bu yetenek aynı zamanda uygulama ile geliyor. Halocarbon yağda taşındığında deforme ince iğneler hücrede kromozomlar itmek için yararlı olmayacaktır. Çok iğneler onların ipuçları görülebilir ve gibi büyük olarak 1/3 bir kromozom genişliğinin (ya da daha büyük) hücre öldürmek çok büyük olasılıkla künt. Kromozomlar itmek yeterince iy...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR micro cover glass	VWR	48366 249	25 mm x 25 mm, no 1.5
Dow Corning High Vacuum Grease	VWR	AA44224-KT
KEL-F Oil #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
Microdissecting Scissors, Stainless Steel	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps	Fine Science Tools	11254-20
0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube	Drummond Scientific	Custom order--call to request
Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective	Any brand
microforge	either custom built or Narashige	MF-900
micromanipulator	either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick	PCS-6300