Micromanipolazione dei cromosomi in insetto spermatociti

Riepilogo

In questo protocollo, descriviamo la selezione e la preparazione delle celle appropriate per micromanipolazione e l'uso di un micromanipolatore piezoelettrico per riposizionare i cromosomi all'interno di quelle cellule.

Abstract

La micromanipolazione dei cromosomi è stato un metodo essenziale per illuminare il meccanismo per cromosoma congression, il punto di arresto mandrino e anafase cromosoma movimenti ed è stata la chiave per comprendere ciò che controlla i movimenti del cromosoma durante la divisione cellulare. Un biologo esperto può utilizzare un micromanipolatore per scollegare i cromosomi dal mandrino, per riposizionare i cromosomi all'interno della cellula e di applicare forze ai cromosomi utilizzando un ago di vetro piccolo con una punta molto fine. Mentre perturbazioni possono avvenire ai cromosomi utilizzando altri metodi quali l'intrappolamento ottico e altri usi di un laser, fin qui, nessun altro metodo consente il riposizionamento delle componenti cellulari sulla scala di decine o centinaia di micron con poco o nessun danno alla cella .

La selezione e la preparazione delle celle appropriate per la micromanipolazione dei cromosomi, in particolare descrivendo la preparazione di colture primarie di spermatocita cavalletta e Grillo per l'uso in cellule vive imaging e micromanipolazione, sono descritto qui. Inoltre, ci mostra la costruzione di un ago per essere utilizzato per spostare i cromosomi all'interno della cella e l'uso di un micromanipolatore piezoelettrico controllato joystick con un ago di vetro collegato ad esso per riposizionare i cromosomi all'interno della divisione delle cellule. Un risultato di esempio viene illustrato l'utilizzo di un micromanipolatore per staccare un cromosoma da un mandrino in un spermatocita primario e per riposizionare quel cromosoma all'interno della cellula.

Introduzione

Micromanipolazione ha rivelato parti del meccanismo per un congression di cromosoma, il mandrino checkpoint e movimenti cromosoma anafase. La prima pubblicazione che descrive i risultati degli esperimenti di micromanipolazione era di Robert Chambers¹. Chambers utilizzato un micromanipolatore meccanico con un ago di vetro allegata per sondare il citoplasma di un certo numero di diversi tipi di cellule. Purtroppo, i metodi di contrasto che ha permesso la visualizzazione dei cromosomi e molti altri componenti cellulari in cellule viventi non erano disponibili al momento, quindi esperimenti Chambers' non potevano mostrare gli effetti di tali componenti cellulari di riposizionamento. Micromanipulations precoce che ha alterato la posizione di cromosoma utilizzato apparato Chambers a spazzare la fosforila mandrino in cellule anafase, mostrando che tali manipolazioni potrebbero alterare la posizione dei bracci cromosomici in neuroblasti di cavalletta anafase² . Nicklas e i suoi collaboratori furono i primi a eseguire bene micromanipulations dei cromosomi, stretching i cromosomi³, staccandole dal mandrino e inducendo un riorientamento^3,4, stabilizzando una malorientation applicando tensione al cromosomi^5,6,7, e misurando le forze prodotte da mandrini in anafase^8,9. Altri lavori di laboratorio Nicklas ha mostrato che i granelli citoplasmici potrebbero anche essere manipolato¹⁰ e che centrosomi potrebbero essere riposizionati di micromanipolazione¹¹. Micromanipolazione non è solo utile per lo spostamento di cromosomi e altri componenti cellulari. Un ago di micromanipolazione in modo pulito può tagliare attraverso un fuso mitotico in demembranated cellule¹² o può essere utilizzato per sciogliere la busta nucleare¹³. Inoltre, le celle adiacenti possono essere fusi da micromanipolazione^14,15.

Con una vasta gamma di interessanti esperimenti che può essere fatto utilizzando micromanipolazione, è a prima vista sorprendente che micromanipolazione esperimenti sono stati condotti dai biologi del cromosoma molto pochi. Una ragione per questa carenza è che divide mitotically cellule coltivate derivate dai tessuti dei vertebrati e sono comunemente usate per studiare i movimenti del cromosoma sono estremamente difficili da micromanipulate. Queste cellule hanno generalmente un citoscheletro corticale che "si mette di mezzo" della micromanipolazione dell'ago e cromosomi o non raggiungibili con l'ago o l'ago macina attraverso la cella, portando a una rottura delle cellule e la morte. Abbiamo e altri sperimentatori che usano micromanipolazione, abbiamo trovato degli artropodi cellule per essere suscettibili di micromanipolazione. Spermatociti artropodi sono facilmente diffondersi sotto uno strato di olio halocarbone e sembrano avere un molto meno robusto citoscheletro corticale sottostante la membrana delle cellule durante la divisione cellulare. Così, testicoli dell'artropodo forniscono una buona fonte di cellule di divisione meiotically (spermatociti) e mitotically per dividere le celle (spermatogoni) con cromosomi facilmente accessibili per micromanipolazione. Una divisione di serie di un spermatocita cavalletta fissata durante una manipolazione ha rivelato che l'ago non penetri mai la membrana delle cellule; la membrana cellulare si deforma intorno all'ago (Nicklas R.B., comunicazione personale). Spermatociti da un certo numero di taxa insetto e ragno sono state micromanipulated con successo, tra cui cavallette, mantidi, mosche della frutta, gru mosche, grilli, spittlebugs, falene, ragni vedova nera, ragni di cantina e orb-tessitura ragni ^{3,7,17,18,19,20,21,22}. Le cellule coltivate, dividendo mitotically dagli insetti possono essere micromanipulated. Ad esempio, i cromosomi in neuroblasti cavalletta in una coltura primaria hanno cromosomi che possono essere prontamente micromanipulated^2,23. Abbiamo il sospetto che il disponibile coltivate linee derivate da Drosophila e altri insetti sarà anche micromanipulatable, anche se non abbiamo testato la tecnica con queste cellule. Vi mostreremo come la divisione delle cellule da cavallette e grilli possono essere preparati per una micromanipolazione. Grilli sono facili da ottenere da maggior parte dei negozi di animali in qualsiasi momento dell'anno. Cavallette sono facilmente ottenibili in estate solo a meno che il ricercatore ha accesso ad una colonia di laboratorio, ma le specie utilizzate (spretus moorei) facilmente ha appiattito le cellule e i cromosomi lunghi, facile da manipolare.

Un altro motivo perché micromanipolazione esperimenti sono stati condotti da una piccola manciata di biologi è che micromanipolatori che i cromosomi si muovono bene sono raramente disponibili sul mercato. Abbiamo trovato che un micromanipolatore piezoelettrico controllato joystick controlla il movimento dell'ago senza vibrazioni, drift, o il ritardo tra il movimento del joystick e il movimento dell'ago, ma altri tipi di manipolatori anche con successo possono spingere i cromosomi intorno nella cella. Micromanipolatori progettati da Ellis e Begg^25,26 sono ideali per la micromanipolazione dei cromosomi, anche se usano tecnologia precedente. Micromanipolatori piezoelettrici sono attualmente disponibili e comunemente utilizzati in elettrofisiologia; Tuttavia, questi micromanipolatori non sono in genere controllata mediante joystick. Joystick di controllo è la chiave per i lisci movimenti necessari per un successo micromanipolazione, e così un joystick personalizzato deve essere costruito per rendere i micromanipolatori piezoelettrici attualmente disponibili di lavoro per micromanipolazione un cromosoma. I micromanipolatori piezoelettrici controllato joystick che funzionano meglio sono controllo di posizione diretta, in cui il movimento del joystick si traduce direttamente in un movimento dell'ago.

Un micromanipolatore piezoelettrico di nuova concezione può essere costruito da parti disponibili in commercio che possono essere facilmente sostituiti e da alcuni piccoli componenti 3D stampati, e funziona bene per cromosoma micromanipolazione²⁴. Il micromanipolatore non ha sensibilità regolabile, posizionamento manuale grossolana e nessuna vibrazione, deriva o ritardo nel movimento dell'ago e controllo diretto della posizione dell'ago. Gli scienziati possono costruire il micromanipolatore utilizzando istruzioni disponibili online²⁴. Di seguito sono i metodi per la preparazione di una coltura cellulare spermatocita primario e per micromanipulating i cromosomi all'interno delle cellule in quella cultura.

Protocollo

1. preparazione di colture cellulari primarie spermatocita insetto per micromanipolazione

1. Preparazione del vetrino
   1. Ottenere una lastra di vetro di 75 x 25 mm con un foro circolare di diametro 20 mm tagliato al centro della diapositiva.
      Nota: Questi sono stati tagliati da un unico foglio di vetro della finestra per essere la dimensione di un vetrino con un foro al centro.
   2. Eseguire un vetrino coprioggetti 25 mm x 25 mm #1.5 attraverso una fiamma di bruciatore di Bunsen per 2 s.
   3. Applicare grasso per vuoto intorno al bordo del foro nel vetrino
   4. Posto il coprioggetto sul foro come in Figura 1. Premilo e assicurarsi che formare una guarnizione a tenuta.
   5. Capovolgere il vetrino e riempire la dissezione bene con olio halocarbone.
2. Preparazione di cultura spermatocita per la visualizzazione su microscopio
   Nota: Qui, descriviamo il metodo di preparazione di cultura usando cellule cavalletta o cricket. Contenuto di testicoli di altri artropodi possa essere coltivate utilizzando un metodo simile.
   1. Ottenere grilli maschi subadulti (o cavallette). Posizionare un insetto vivente in frigorifero per circa 2 min a freddo-anestetizzare. Utilizzando le forbici per dissezione, tagliare rapidamente attraverso la superficie dorsale parallela all'asse lungo dell'addome direttamente dietro i germogli di ala. Manualmente e spremere l'addome delicatamente per spingere i testicoli attraverso il taglio nell'esoscheletro (Figura 2).
   2. Mediante pinze, inserire i testicoli isolati in una dissezione ben contenente olio halocarbone.
   3. Se necessario, Mostra i testicoli sotto un microscopio per dissezione. Dividere in pezzi più piccoli utilizzando forcipe ammenda-aguzzo, togliendo il grasso che copre i testicoli e utilizzare punte belle pinze per rompere i testicoli (Figura 3A e 3B). Diffondere il contenuto di testicoli sotto l'olio, sulla superficie del coprivetrino (Figura 3).
   4. Diffondere il contenuto di testicoli fino a quando la parte di diffusione del testicolo è appena percettibile per gli occhi (Figura 3). Se necessario, utilizzare pozzi ulteriore dissociazione olio-caricato.

2. micromanipolazione

1. Produzione del microneedle
   1. Inserire un'estremità di un tubo di vetro (0,85 mm di diametro esterno, diametro interno mm 0,65) nella fiamma di un becco Bunsen. Tirare l'estremità del tubo di vetro in modo tale che un angolo di 150° è formata, e viene creata un'area estesa di tubazione di vetro stretto. Rompere il tubo nella regione sottile in modo che la regione sottile che si estende dal punto di vista è lungo circa 10 mm (Figura 4A).
   2. Utilizzando un microforge (o su misura secondo Powell²⁷ o commercialmente disponibile-Vedi Tabella materiali), toccare la punta dell'ago di vetro per il legare di platino caldo per fondere il vetro sulla punta. Forma un angolo di circa 45° tra l'ago e il filo di platino di microforge (Figura 4B). Tirare il vetro dal filo caldo, mentre chiudendo il calore al filo, formando una sottile punta di ≤ 1.5 mm alla fine dell'ago di vetro.
      Nota: Il diametro di punta sarà difficile da misurare, ma una punta di questa lunghezza è in grado di produrre un ago duro ma flessibile che sarà opportuno per micromanipolazione. In alternativa, un estrattore micropipetta potrebbe essere utilizzato per creare la tubazione di vetro con un diametro di punta appropriata (lo sperimentatore dovrà testare diverse ricette che tirare per produrre un microneedle opportunamente duro ma flessibile per il lavoro). L'ago può essere inserito in un supporto che ha la forma allo stesso modo per l'ago di manipolazione creato secondo il metodo sopra descritto.
2. Posizionamento il micromanipolatore
   1. Posizionare il vetrino preparato sul palco di un microscopio invertito, contrasto di fase. Trovare la divisione delle cellule e loro centro nel campo visivo. Concentrarsi sulle cellule usando l'ingrandimento più basso possibile.
      Nota: Abbiamo usato un obiettivo di contrasto di fase X 16.
   2. Posizionare i microaghi nel supporto dell'ago sul micromanipolatore.
   3. Posizionare manualmente il microneedle nel percorso della luce del microscopio in modo che la punta dell'ago sia illuminata dalla luce (figura 5B).
   4. Il microscopio si concentrano diversi piani focali sopra il piano in cui si trovano le cellule.
   5. Riposizionare il microneedle usando il joystick di controllo a una bassa sensibilità diverse volte per trovare l'ombra dell'ago negli assi X e y. Continuare a regolare nuovamente la posizione fino a quando la posizione della punta è visibile. Regolare la posizione dell'ago lungo l'asse z fino a quando la punta dell'ago è a fuoco.
   6. Rimettere a fuoco sulle cellule, quindi concentrarsi il microscopio sopra l'aereo di cella in modo che le cellule sono appena fuori fuoco e invisibile. Regolare nuovamente la posizione dell'ago in modo che la punta sia a fuoco in questo piano focale.
   7. Regolare l'ingrandimento del microscopio.
      Nota: Abbiamo usato un obiettivo di contrasto di fase apertura numerica (NA) 100 X 1.4 per la micromanipolazione.
   8. Dopo aver focalizzato sulle cellule con l'obiettivo di ingrandimento maggiore, nuovamente concentrarsi il microscopio sopra l'aereo di cella in modo che le cellule sono appena fuori fuoco e invisibile. Utilizzando un'impostazione di sensibilità superiore, regolare nuovamente la posizione dell'ago, così che la sua punta è a fuoco e centrato nel piano focale sopra il piano in cui si trovano le cellule.
   9. Rimettere a fuoco sulle cellule, regolare la loro posizione quindi restano al centro del campo visivo. L'ago è ora pronto per la micromanipolazione.
3. Micromanipolazione dei cromosomi
   1. Utilizzando la stessa impostazione di sensibilità per quanto riguarda il posizionamento bene ad un alto ingrandimento, utilizzare il joystick per controllare i microaghi e spingere i cromosomi intorno all'interno della cellula. Tenere la punta dell'ago sopra il piano delle cellule.
   2. Per tirare o spostare un cromosoma, concentrarsi su un cromosoma nella parte superiore della cella.
      Nota: Questi cromosomi sono più facili da manipolare-manipolazione cromosomi vicino a che coprivetrino rende probabile che l'ago macinerà nel vetrino coprioggetto, scoppiando la cella e termina l'esperimento.
   3. Regolare l'asse z sul joystick per portare la punta dell'ago messa a fuoco e quindi spostare l'ago punta con il joystick in X e Y. Posizionare la punta dell'ago direttamente sul cromosoma ad essere manipolato e spingerlo nella direzione desiderata per consentire il manipolatore a repositi sul cromosoma.
   4. A seconda di quanto lontano il cromosoma è spinto, applicare tensione al cromosoma oppure applicare una tensione sufficiente per staccare un cromosoma dal mandrino. Una volta che un cromosoma viene rimosso da un mandrino, posizionarlo in qualsiasi punto all'interno della cellula.

Risultati

Figura 6 Mostra una micromanipolazione campione di 2 spermatociti primari adiacenti cavalletta in diversi esempi dei possibili utilizzi di micromanipolazione. Questo esperimento è stato fatto utilizzando un microscopio invertito, contrasto di fase. 0:00 (i tempi indicati sono in min:s) immagine mostra entrambe le celle prima della manipolazione. Un cromosoma nella cella inferiore viene mostrato sotto tensione applicata dall'ago micromanipolazione (0:05; nero...

Discussione

Con la pratica, muoversi cromosomi nella cellula può diventare una seconda natura. Gli aghi che sono sufficientemente rigida e sufficientemente sottile punta sono difficili da "ottenere l'abilità di" fabbricando, ma questa abilità inoltre viene con la pratica. Gli aghi che sono così belle che deformano quando spostato nell'olio halocarbone non sarà utili per spingere i cromosomi nella cella. Gli aghi che sono così ottuso che loro suggerimenti sono visibili e come grande come 1/3 della larghezza di un cromosoma (o s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR micro cover glass	VWR	48366 249	25 mm x 25 mm, no 1.5
Dow Corning High Vacuum Grease	VWR	AA44224-KT
KEL-F Oil #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
Microdissecting Scissors, Stainless Steel	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps	Fine Science Tools	11254-20
0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube	Drummond Scientific	Custom order--call to request
Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective	Any brand
microforge	either custom built or Narashige	MF-900
micromanipulator	either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick	PCS-6300