חוץ-גופית של הכרומוזומים Spermatocytes חרקים

Summary

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את הבחירה ואת הכנת תאים המתאימים עבור המיקרומניפולציה ושימוש micromanipulator פיזואלקטריים כדי למקם מחדש כרומוזומים בתוך התאים האלה.

Abstract

חוץ-גופית של כרומוזומים היה שיטה חיונית עבור מאירה את המנגנון על כרומוזום congression, פלך מחסום ו "אנאפאזה" כרומוזום תנועות, ואני כבר מפתח להבנת מה ששולט כרומוזום תנועות במהלך חלוקת התא. ביולוג מיומן ניתן להשתמש micromanipulator כדי לנתק את הכרומוזומים מ בכישור, מיקום מחדש של הכרומוזומים שבתא, וכדי להחיל כוחות על כרומוזומים באמצעות מחט זכוכית קטנים עם טיפ מצוין. בעוד לפליטת יכולים להתבצע כרומוזומים באמצעות שיטות אחרות כגון השמנה אופטי ושימושים אחרים של לייזר, נכון להיום, אין שיטה אחרת מאפשר את מיקום מחדש של רכיבי הסלולר בהיקף של עשרות למאות מיקרון עד אין נזק לתא .

את הבחירה ואת הכנה של תאים המתאימים חוץ-גופית של כרומוזומים, במיוחד המתארת את הכנת חגב קריקט spermatocyte הראשית תרבויות לשימוש הדמיה לחיות תאים, חוץ-גופית המתוארים כאן. בנוסף, אנו מראים הבנייה של מחט כדי לשמש להעברת כרומוזומים בתוך התא, השימוש micromanipulator פיזואלקטריים שבשליטת ג'ויסטיק עם מחט זכוכית מצורף, מיקום מחדש של הכרומוזומים בתאים החלוקה. תוצאה הדגימה מראה את השימוש micromanipulator לנתק כרומוזום מ זה פלך ב spermatocyte העיקרי וכדי למקם מחדש הכרומוזום בתוך התא.

Introduction

המיקרומניפולציה חשף חלקי המנגנון של כרומוזום congression, פלך מחסום ו "אנאפאזה" כרומוזום תנועות. הפרסום המוקדם ביותר המתאר את תוצאות המיקרומניפולציה ניסויים היה על ידי רוברט צ'יימברס¹. צ'יימברס להשתמש micromanipulator מכני עם מחט זכוכית המצורף כדי לחקור את הציטופלסמה של מספר סוגי תאים שונים. למרבה הצער, שיטות ניגוד שמותר הפריט החזותי של כרומוזומים ורכיבים רבים אחרים התאית בתאים חיים לא היו זמינים בזמן, אז הניסויים של צ'יימברס לא יכולתי להראות את ההשפעות של שינוי מיקום כזה מרכיבי התא. Micromanipulations מוקדם ששינו את המיקום כרומוזום משמש את המנגנון צ'יימברס לטאטא את midzone פלך בתאים "אנאפאזה", מראה כי מניפולציות כאלה יכול לשנות את המיקום של הזרועות כרומוזום ב "אנאפאזה" חרגול neuroblasts² . Nicklas ושותפיו שלו היו הראשונים לבצע בסדר micromanipulations של כרומוזומים, מתיחה של כרומוזומים³, ניתוק אותם מן בכישור וגרימת ולהתפכחות^3,4, ייצוב malorientation על-ידי החלת מתח הכרומוזומים^5,6,7ולאחר מדידה. לכוחות המיוצר על ידי הצירים "אנאפאזה"^8,9. עבודה אחרת על ידי המעבדה Nicklas הראה כי בגרגרים cytoplasmic יכול גם להיות מרומה¹⁰ כי centrosomes יכול למקם על ידי המיקרומניפולציה¹¹. המיקרומניפולציה שימושי לא רק להעברת כרומוזומים ורכיבים אחרים התאית. מחט המיקרומניפולציה נקיה יכול לחתוך דרך זה mitotic פלך בתאים demembranated¹² או יכול לשמש כדי להעלים את מעטפת הגרעין¹³. בנוסף, תאים סמוכים יכולים נכרכים על ידי המיקרומניפולציה^14,15.

עם מגוון רחב של ניסויים מעניינים שאפשר לעשות שימוש חוץ-גופית, זה במבט ראשון מפתיע כי המיקרומניפולציה ניסויים נעשו על ידי ביולוגים כרומוזום מעט מאוד. סיבה אחת על מחסור זה הוא התאים בתרבית חלוקת mitotically נגזרות רקמות חוליות, משמשים בדרך כלל לימוד תנועות כרומוזום הן קשה מאוד micromanipulate. תאים אלה תרביות רקמה בדרך כלל יש שלד התא קורטיקלית כי "מפריע" של המיקרומניפולציה המחט, ואת כרומוזומים או לא נגיש באמצעות המחט או המחט חורק דרך התא, המוביל אל המוות ולמסמנים התא. אנחנו, ניסויים אחרים המשתמשים המיקרומניפולציה, מצאו תאים arthropod להיות מקובל המיקרומניפולציה. Arthropod spermatocytes מתפשטים בקלות תחת שכבה של שמן halocarbon, נראה כי שלד התא קורטיקלית הרבה פחות חזקים שבבסיס קרום התא במהלך חלוקת התא. לפיכך, האשכים arthropod לספק מקור טוב של meiotically, חלוקת תאים (spermatocytes), mitotically, חלוקת תאים (spermatogonia) עם כרומוזומים נגיש עבור המיקרומניפולציה. טורי חלוקתה של spermatocyte חגב קבוע במהלך מניפולציה חשף כי המחט לא חודר את קרום התא; קרום התא מתעוות סביב המחט (R.B. Nicklas, תקשורת אישית). Spermatocytes ממספר taxa חרק, עכביש היה micromanipulated בהצלחה, כולל חגבים, גמלי שלמה התפילה, זבובי פירות, קריין, צרצרים, spittlebugs, עש, אלמנה שחורה עכבישים, עכבישים מרתף, אריגה orb העכבישים והזבובים ^{3,7,17,18,19,20,21,22}. התאים בתרבית, חלוקת mitotically מפני חרקים יכולים להיות micromanipulated. לדוגמה, הכרומוזומים. חגב neuroblasts בתרבות הראשי יש כרומוזום שניתן בקלות micromanipulated^2,23. אנו חושדים כי קווי נגזר דרוזופילה תרבותי זמינים, חרקים אחרים יהיה גם micromanipulatable, למרות שלא בדקנו את הטכניקה עם תאים אלה. אנחנו נראה איך חלוקת תאים חגבים, צרצרים יכול להיות מוכנים חוץ-גופית. צרצרים בקרבת להשיג ברוב החנויות לחיות מחמד בכל עת של השנה. חגבים הן פתוח בעונת הקיץ בלבד אלא אם החוקר חייב גישה מושבה מעבדה, אבל המין בשימוש (Melanoplus sanguinipes) יש משוטחים בקלות תאים ולאחר זמן, קל לתפעל כרומוזומים.

סיבה נוספת למה המיקרומניפולציה ניסויים נעשו על ידי קומץ קטן של ביולוגים היא כי micromanipulators להזיז כרומוזומים טוב זמינים רק לעתים נדירות בשוק. מצאנו כי micromanipulator פיזואלקטריים שבשליטת ג'ויסטיק שולטת התנועה מחט ללא רטט, הסחף או השהיה בין התנועה ג'ויסטיק התנועה מחט, אך סוגים אחרים של סימולטורי יכול לדחוף גם בהצלחה כרומוזומים סביב בתא. Micromanipulators שעוצב על ידי^25,אליס, ייסד²⁶ הינם אידיאליים עבור חוץ-גופית של כרומוזומים, אף הם להשתמש בטכנולוגיה בוגרים. Micromanipulators פיזואלקטריים הם זמין כעת, בדרך כלל בשימוש אלקטרופיזיולוגיה; עם זאת, micromanipulators האלה אינם בדרך כלל מבוקר ג'ויסטיק. ג'ויסטיק הבקרה היא המפתח חלקה התנועות הדרושות המיקרומניפולציה מוצלחת, אז יש אפשרות לבנות ג'ויסטיק מותאם אישית כדי להפוך את micromanipulators פיזואלקטריים זמין כרגע עובד חוץ-גופית הכרומוזום. שבשליטת ג'ויסטיק פיזואלקטריים micromanipulators עובד בצורה הטובה ביותר יש שליטה עמדה ישירה, שבה תנועת מוט ההיגוי מתורגם ישירות תנועה מחט.

ניתן לבנות micromanipulator פיזואלקטריים החדש תוכנן מן החלקים הזמינים בשוק כי ניתן להחליף בקלות ומן כמה רכיבים קטנים המודפס תלת-ממדי, וזה עובד היטב עבור המיקרומניפולציה כרומוזום²⁴. Micromanipulator יש רגישות מתכווננת, מיקום גס ידנית, ו אין רטט, הסחף או השהיה המחט התנועה, ואת תפקיד ישיר הבקרה של המחט. מדענים יכולים לבנות את micromanipulator באמצעות הוראות באינטרנט זמין²⁴. להלן השיטות להכנת תרבות תא spermatocyte הראשי ועבור micromanipulating הכרומוזומים בתוך התאים בתרבות הזו.

Protocol

1. הכנה של תרבית תאים ראשיות חרקים Spermatocyte חוץ-גופית

1. הכנת שקופית
   1. להשיג שקופית 75 מ"מ x 25 מ"מ זכוכית עם חור עגול של קוטר 20 מ מ לגזור במרכז השקופית.
      הערה: הם נקטפו מתוך גיליון אחד של חלון זכוכית לגודל של שקופית מזכוכית עם חור במרכז.
   2. לעבור coverslip 25 מ"מ x 25 מ"מ #1.5 של להבה מבער בונזן 2 s.
   3. למרוח משחה ואקום סביב קצה החור בשקופית זכוכית
   4. מניחים את coverslip על החור כמו באיור 1. תלחץ על זה וודא כי ליצור חותם צר.
   5. הפוך את השקופית זכוכית ולמלא את הקרע עם שמן halocarbon.
2. Spermatocyte תרבות הכנה לצפייה במיקרוסקופ
   הערה: כאן, אנו מתארים את שיטת הכנה תרבות באמצעות תאים חגב או קריקט. יכול להיות תרבותי האשכים התוכן של פרוקי רגליים אחרים באמצעות שיטה דומה.
   1. להשיג צרצרים זכר subadult (או חגבים). מקום חרק חי במקרר למשך כ- 2 דקות קר-עזים ומתנגד זה. באמצעות מספריים ויבתר, במהירות לחתוך דרך המשטח הגבי מקביל לציר הארוך של הבטן מאחורי ניצנים כנף. באופן ידני מחצי הבטן בעדינות כדי לדחוף את האשכים דרך החתך של שלד חיצוני (איור 2).
   2. באמצעות מלקחיים, מקם את האשכים מבודד. הקרע טוב המכיל שמן halocarbon.
   3. אם יש צורך, להציג את האשכים מתחת למיקרוסקופ ויבתר. לחלק אותם לחתיכות קטנות יותר באמצעות מלקחיים הארכית פיין, הסרת כל השומן המכסה את האשכים, ולהשתמש מלקחיים הארכית בסדר כדי לשבור את האשכים (איור 3A ו- 3B). להפיץ את התוכן האשכים תחת השמן, על-פני coverslip (איור 3C).
   4. להפיץ את התוכן האשכים עד החלק התפשטות של בזרמה בקושי מורגש בעיני (איור 3C). השתמש בארות דיסוציאציה שנטענו שמן נוספים במידת הצורך.

2. חוץ-גופית

1. ייצור microneedle
   1. מקם קצה אחד של שפופרת זכוכית (0.85 מ מ בקוטר חיצוני 0.65 מ"מ בקוטר פנימי) להבת מבער בונזן. למשוך את קצה לאורך צינור זכוכית באופן כזה כי זווית 150° נוצר, נוצר שטח מורחבת של צינורות זכוכית צר. לשבור את הצנרור באזור דק כך באזור דק הזווית היא כ 10 מ"מ (איור 4A).
   2. באמצעות microforge של (או בהזמנה אישית על פי פאול²⁷ או זמינים מסחרית-ראה טבלה של חומרים), לגעת בקצה של המחט זכוכית לכבל פלטינה חם כדי להמיס את הכוס בקצה. טופס כ 45° זווית בין המחט החוט פלטינה של microforge (איור 4B). משוך את הזכוכית מהכבל חם, תוך כדי לכבות את החום על חוט התיל, ויוצרים טיפ דק של ≤1.5 מ מ בקצה המחט זכוכית.
      הערה: הקוטר עצה יהיה קשה למדוד, אבל טיפ זה באורך סביר לייצר מחט תקיף אך גמיש זה יהיה מתאים המיקרומניפולציה. לחלופין, ניתן להשתמש של פולר micropipette כדי ליצור זכוכית צינורות בקוטר עצה המתאימה (הנסיין יהיה לבחון מתכונים מושך שונים כדי לייצר microneedle כראוי תקיף אך גמיש לעבודה). המחט יכול להציב אותם בעל זה מעוצב באופן דומה כדי שהמחט מניפולציה שנוצרו על פי השיטה המתוארת לעיל.
2. מיצוב של micromanipulator
   1. במקום השקופית מוכן על השלב של מיקרוסקופ ניגוד שלב הפוכה. למצוא את התאים החלוקה ובמרכז להם שדה הראיה. מתמקדים התאים בעזרת ההגדלה הנמוך ביותר האפשרי.
      הערה: השתמשנו מטרה ניגודיות שלב 16 X.
   2. מקם את microneedle למחזיק המחט על micromanipulator.
   3. מקם באופן ידני את microneedle בנתיב האור של המיקרוסקופ, כך קצה המחט הוא מואר על ידי האור (איור 5B).
   4. פוקוס המיקרוסקופ בכמה מישורים מוקד מעל המטוס שבו התאים לשקר.
   5. למקם מחדש את microneedle באמצעות הבקר ג'ויסטיק-רגישות נמוכה מספר פעמים כדי למצוא את הצל של המחט ב X - ו Y-axes. להמשיך לעדכן את המיקום עד המיקום של הקצה יהיה גלוי. להתאים את מיקום המחט לאורך ציר z עד קצה המחט יהיה בפוקוס.
   6. להתמקד. על התאים, ואז להתמקד המיקרוסקופ מעל המטוס תא כך התאים הם רק מחוץ לפוקוס, בלתי נראה. להתאים מחדש את המיקום של המחט כך את קצהו הוא בפוקוס במישור המוקד הזה.
   7. התאם את רמת ההגדלה של המיקרוסקופ כנדרש.
      הערה: השתמשנו מטרה ניגודיות שלב מפתח נומרי (NA) 100 X 1.4 עבור המיקרומניפולציה.
   8. לאחר התמקדות התאים באמצעות המטרה גבוה ההגדלה, שוב להתמקד המיקרוסקופ מעל המטוס תא כך התאים הם רק מחוץ לפוקוס, בלתי נראה. באמצעות הגדרת רגישות גבוהה יותר, להתאים מחדש את המיקום של המחט כך את קצהו נמצא בפוקוס וממורכז ב מישור מוקד מעל המטוס שבו התאים לשקר.
   9. להתמקד. על תאי, התאמת המיקום שלהם, כך שהן נותרות במרכז שדה הראייה. המחט מוכן כעת המיקרומניפולציה.
3. חוץ-גופית של כרומוזומים
   1. שימוש באותה הגדרה רגישות לגבי מיקום בסדר בהגדלה, להשתמש מוט ההיגוי כדי לשלוט על microneedle ולדחוף את הכרומוזומים בתוך התא. שמור על קצה המחט מעל המטוס של התאים.
   2. כדי למשוך או להעביר כרומוזום, מתמקדים כרומוזום בסמוך לחלקו העליון של התא.
      הערה: כרומוזומים אלה קלים יותר לתמרן-מניפולציה כרומוזומים קרוב ש-coverslip עושה את זה סביר כי יטחנו את המחט לתוך coverslip, מתפרצת לתא וכלה הניסוי.
   3. התאם ציר z על מוט ההיגוי להביא את מחט אל המוקד, אז לעבור המחט עצה עם הג'ויסטיק ב- X וי' המקום קצה המחט ישירות על כרומוזום ה-כדי להשפיע ולדחוף אותו בכיוון הרצוי כדי לאפשר manipulator כדי repositi בכרומוזום.
   4. תלוי כמה רחוק הוא דחף את הכרומוזום, או להחיל את המתח על הכרומוזום או להחיל מתח מספיק כדי לנתק כרומוזום מ בכישור. ברגע כרומוזום יוסר מה זה פלך, למקם אותו בכל מקום בתוך התא.

תוצאות

איור 6 מראה של המיקרומניפולציה מדגם של 2 חגב סמוכים spermatocytes ראשי מספר דוגמאות של השימושים האפשריים של חוץ-גופית. ניסוי זה נעשה שימוש במיקרוסקופ ניגוד שלב הפוכה,. 0:00 (ערב לזמנים הנקובים הם ב- min:s) תמונת מראה שני התאים לפני המניפולציה. כרומוזום אחד בתא התחתון מ?...

Discussion

עם התרגול, זז הכרומוזומים בתא יכול להפוך לטבע שני. כי הן מספיק נוקשה מספיק דק שקצהו שהמחטים קשה להשיג "הכישרון של" בדיית, אבל היכולת הזו מגיע גם עם תרגול. מחטים כי הם כל כך טוב כי הם לעוות בעת העברת הנפט halocarbon לא יהיה שימושי עבור דוחפים הכרומוזומים בתא. מחטים. זה כל-כך קהה כי הטיפים גלויים, גדול...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR micro cover glass	VWR	48366 249	25 mm x 25 mm, no 1.5
Dow Corning High Vacuum Grease	VWR	AA44224-KT
KEL-F Oil #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
Microdissecting Scissors, Stainless Steel	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps	Fine Science Tools	11254-20
0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube	Drummond Scientific	Custom order--call to request
Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective	Any brand
microforge	either custom built or Narashige	MF-900
micromanipulator	either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick	PCS-6300