التعبير المرتبطة بالغدة التحوير الفيروس بوساطة في المعرفة وراثيا من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي

Summary

يمكن استخدام حقن إينتراسبينال recombinase تعتمد المؤتلف المرتبطة بالغدة الفيروس (راف) التعامل مع أي نوع من الخلايا المسمى وراثيا في الحبل الشوكي. هنا ونحن تصف كيفية ترانسدوسي الخلايا العصبية في القرن الظهري للحبل الشوكي القطني. هذا الأسلوب يتيح للاستجواب الوظيفي من النوع الفرعي العصبية التلاعب بها.

Abstract

التلاعب الانتقائي للعمود الفقري العصبية الفئات السكانية الفرعية قد تحقق أساسا بطريقتين مختلفتين: 1) علم الوراثة المتعدد الجوانب، حيث يتم إنشاؤها بضعفين أو ثلاثة إضعاف من الفئران المحورة وراثيا بغية تحقيق التعبير الانتقائي لمراسل أو المستجيب الجينات (مثلاً، من محور Rosa26) في السكان العمود الفقري المرجوة. 2) حقن إينتراسبينال المرتبطة بالغدد العرقية-تعتمد على فيروس المؤتلف (راف)؛ هنا يتم حقن ناقلات إف Cre-تعتمد على الترميز للجينات مراسل أو المستجيب للاختيار في الحبل الشوكي من الفئران معربا عن ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية في يتدنى العصبية المطلوبة. هذا البروتوكول ويصف كيفية توليد نواقل راف تعتمد على لجنة المساواة العرقية وشرائح كيفية ترانسدوسي الخلايا العصبية في القرن الظهري للحبل الشوكي القطني L3-L5 مع رافس. كأجزاء العمود الفقري القطني L3-L5 هي معصب من تلك الخلايا العصبية الحسية المحيطية التي تنقل المعلومات الحسية من هيندليمبس، السلوك العفوي والاستجابات للاختبارات الحسية المطبقة على اللكتات عن إلى جانب الحقن يمكن أن تكون تحليله لاستجواب وظيفة الخلايا العصبية التلاعب في المعالجة الحسية. نحن نقدم أمثلة كيف يمكن استخدام هذه التقنية لتحليل وراثيا تعريف مجموعات فرعية من الخلايا العصبية في العمود الفقري. المزايا الرئيسية للتعبير التحوير الفيروس بوساطة لجنة المساواة العرقية الفئران المعدلة وراثيا مقارنة بالتعبير التحوير المستحثة بالماوس مراسل الكلاسيكية هي التالية: 1) يمكن أن تعتمد لجنة المساواة العرقية المختلفة رافس ترميز مختلف البروتينات مراسل أو المستجيب حقن خط المعدلة وراثيا Cre واحد، وبالتالي التغلب على الحاجة إلى إنشاء عدة الماوس المعدلة وراثيا متعددة الأسطر. 2) حقن إينتراسبينال يحد من التلاعب بالخلايا معربا عن لجنة المساواة العرقية للحقن والوقت بعد الحقن. المساوئ الرئيسية: 1) تعبير الجينات مراسل من رافس متغير أكثر. 2) مطلوب جراحة ترانسدوسي الخلايا العصبية العمود الفقري للفائدة. أي من هاتين الطريقتين هو الأنسب يعتمد على مسألة السكان وبحوث الخلايا العصبية معالجتها.

Introduction

الحبل الشوكي الظهرية ضروري لتبادل المعلومات بين أطراف الجسم والمخ. المنبهات الحسية مثل الحرارة، البرد، لمسة، أو يتم الكشف عن المنبهات الضارة بالخلايا العصبية الطرفية المتخصصة، التي تنقل هذه المعلومات إلى الخلايا العصبية للقرن الأفريقي الظهرية الحبل الشوكي. وهنا ينظم شبكة معقدة من إينتيرنيورونس المثبطة وضادات وفي نهاية المطاف مواقع مرحلات المعلومات الحسية عن طريق الإسقاط الشوكي من الخلايا العصبية إلى سوبراسبينال^1،2. العمليات الحسابية التي تقوم بها العمود الفقري في جملة-وإسقاط الخلايا العصبية من بوابة المعلومات الحسية، وبالتالي تحديد المعلومات التي قمعت أو ترحيل بكثافة التي. التغييرات في التكامل للمنبهات الحسية، مثل إلى تغيير توازن بين تثبيط والإثارة، يمكن أن يسبب اختلالات حسية مثل فرط الحساسية أو اللودينيا (الأحاسيس المؤلمة بعد التحفيز عادة غير مؤلمة). ويعتقد أن السبب الأساسي للألم المزمن مختلف الدول^3،4هذه التغييرات. وهكذا، العمود الفقري الدوائر ذات أهمية عالية في المعالجة الحسية، وبالتالي في إدراك البيئة الكائن الحي والنفس. مع ظهور الأخيرة وتركيبة الجزيئي، والوراثية، والتقنيات الجراحية التي تسمح للتلاعب بدقة للفئات السكانية الفرعية المحددة وراثيا العمود الفقري العصبية، العلماء الآن بدأنا نفهم الدوائر الأساسية العمود الفقري مسؤولة عن تجهيز طرائق حسية مميزة.

ضخ إينتراسبينال راف في الفئران البرية من نوع أو المعدلة وراثيا ساهمت إلى حد كبير إلى التلاعب، والتحليل، وفهم وظيفة من مجموعات فرعية معينة من الخلايا العصبية العمود الفقري^5،،من^{67، 8 , 9 , 10 , 11}. يسمح هذا الأسلوب تقديم البروتينات علامة (مثل التجارة والنقل/البروتينات الانصهار بروتينات فلورية خضراء)، مراسل البروتينات (مثل جكامب)، أو البروتينات المستجيب (مثل السموم البكتيرية أو تشانيلرهودوبسين أو مستقبلات فارماكوجينيتيك) في مكانياً طريقة مقيدة للخلايا العصبية في العمود الفقري. ضخ رافس تعتمد على لجنة المساواة العرقية المحلية في الفئران المعدلة وراثيا معربا عن ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية في مجموعة فرعية معينة من الخلايا العصبية العمود الفقري يسمح تحليل محددة من السكان الخلايا العصبية الخاصة بكل منها. وقد استخدمنا هذا الأسلوب في تسمية أو يجتذ أو تمنع أو تنشيط العمود الفقري جليسينيرجيك الخلايا العصبية مما يدل على أن تشكل جزءا أساسيا من العمود الفقري بوابة التحكم بالألم وحكة انتقال⁷. في هذه التجارب، مكن ضخ إينتراسبينال راف تعتمد على لجنة المساواة العرقية في الفئران GlyT2::Cre التلاعب جليسينيرجيك الخلايا العصبية في الحبل الشوكي القطني الانتقائي. وبالتالي يمكن تفادي التلاعب المتزامن للدوائر سوبراسبينال التي تحتوي على جليسينيرجيك الخلايا العصبية ذات أهمية حاسمة لبقاء الحيوان.

بينما حقن إينتراسبينال رافس يحد من العدوى إلى الموقع الحقن، يمكن أن يحدث توصيل الفيروسي ليس فقط في الخلايا العصبية المحلية ولكن أيضا في الخلايا العصبية التي تتصل بالحقن عن طريق الإسقاطات محواري. هذا الأخير غالباً ما يستخدم لتتبع مناطق الجهاز العصبي المركزي توفير مدخلات العصبية لنواة معينة في الدماغ. عدوى الإسقاطات محواري، ومع ذلك، يمكن أيضا عامل التباس عندما يقوم درس عدد محدد من الخلايا العصبية في موقع معين. لمعالجة هذه القضايا، وقد أجرينا مؤخرا تحليلاً شاملا للقاح إف وكاسيتات التعبير تحديد الأنماط والمروجين التي يمكن استخدامها إلى أما تصغير أو تكبير توصيل إلى الوراء. في سياق هذا البحث المحددة في العمود الفقري الدوائر، قمنا بتحليل قدرة اللقاح مختلفة والمروجين على ريتروجراديلي ترانسدوسي الخلايا العصبية في العقد الجذرية الظهرية (DRG)، ولب فينتروميديال روسترال (RVM)، وقشرة سوماتوسينسوري ¹². ولذلك التقنية المبينة في هذا البروتوكول يمكن استخدامها لتحليل الخلايا العصبية العمود الفقري في موقع الحقن أو لتحليل الخلايا العصبية الإسقاط التي توفر مدخلاً إلى موقع حقن الحبل الشوكي. في البروتوكول هو موضح هنا، تجري ثلاث حقن راف في الجانب الأيسر من الحبل الشوكي القطني لتمكين توصيل الخلايا العصبية في ثلاثة أجزاء القطني (L3-L5). شرائح L3-L5 تلقي معظم المدخلات الحسية من اللكتات عن الحقن. ونحن تبين أن التلاعب الوظيفية للخلايا العصبية المسماة وراثيا في L3-L5 كافية لتثير التغيرات السلوكية قوية، وبالتالي توفير الأدلة الفنية للدالة حلبة لهذه الخلايا العصبية وراثيا المسمى نوع فرعي.

Protocol

جميع التجارب على الحيوانات وقد أقر مكتب الطب البيطري الكانتون السويسري (زيورخ) ووفقا والامتثال لجميع المبادئ التوجيهية التنظيمية والمؤسسية ذات الصلة.

ملاحظة: يتم سرد جميع المواد جنبا إلى جنب مع الشركات المصنعة لكل منها و/أو البائعين في الجدول للمواد.

1-جيل ناقلات إف تعتمد على لجنة المساواة العرقية

ملاحظة: يمكن شراء مجموعة متنوعة من ناقلات تعتمد على لجنة المساواة العرقية مع المروجين مختلفة (انظر الجدول للمواد)، أو إذا لم يتوفر بناء التعبير المطلوب، فإنه يمكن إنشاؤها بواسطة تعديل القائمة بنيات إف. ملاحظة، المروج والنمط المصلي المسيطر يمكن أن يكون لها تأثير على انتشار توصيل الفيروسية (انظر ¹²). الجزء الأول من هذا البروتوكول بإيجاز وصف توليد اثنين من ناقلات إف تعتمد على لجنة المساواة العرقية مختلفة مناسبة لتحقيق مكاسب وخسائر التجارب الدالة، على التوالي.

1. تنشيط فارماكوجينيتيك (كسب وظيفة)
   1. تأمر pAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq)-مشري (انظر الجدول للمواد) لمستقبلات مصمم حصرا تنشيطه بواسطة العقاقير المحورة (دريد)-بوساطة التنشيط.
   2. عند تلقي ثقافة طعنه البكتيرية، تستكمل متواصلة من البكتيريا في لوحات رطل (البكتريولوجية الصف أجار المذاب في لوريا بيرتاني السائلة المتوسطة) مع المضادات الحيوية المناسبة. احتضانها طوال الليل في 37 درجة مئوية، واختيار مستعمرة واحدة في اليوم التالي.
      ملاحظة: يمكن أن تحدث البلازميدات المحتوية على إف جينومات ناقلات يمكن أن تكون غير مستقرة ويكرر جزئ الجينوم الفيروسي، لا سيما في إطار المحطة الطرفية المقلوب الفيروسية (ساحة)، وخلال التضخيم في كولاي. أننا نقترح استخدام recA-تفتقر إلى قمعها/سلالات مثل MDS42 أو Stbl3 لتجنب جزئ داخل بلازميد يحتوي على جينوم إف.
   3. تضخيم البكتيريا اتباع الإرشادات التي يقدمها المورد المختار الحمض النووي--ماكسي-كيت وإعداد جودة عالية بلازميد الحمض النووي مع مجموعة الحمض النووي-ماكسي-مواد متاحة تجارياً (مثلاً، انظر الجدول للمواد). تنفيذ مراقبة الجودة لإعداد الحمض النووي بلازميد بالتحقق من سلامة وهوية بلازميد الحمض النووي من خلال تقييد خلاصة قاسمة بلازميد الحمض النووي.
      ملاحظة: هناك مواقع الاعتراف لتقييد endonuclease سماي داخل الإسناد. تتضمن خلاصة سماي في مراقبة الجودة التحقق من سلامة الإسناد.
   4. إرسال الحمض النووي لمنشأة النواقل فيروسية أساسية بغية إنتاج راف ذات جودة عالية.
      ملاحظة: عيار عالية، محضرات الفيروسية ذات جودة عالية حاسمة لتفادي الخلط الناجم عن التلوث في الإعدادية الفيروسية تعمل. ولذلك نوصي بوجود راف الاختيار المنتجة في منشأة أساسية متجهة ثابتة، ما لم يتم إنتاج إف راسخة في المختبر.
2. التذرية (فقدان الوظيفة)
   ملاحظة: السموم البكتيرية أو مستقبلات السمية يمكن للتوسط في خلية التذرية أو إسكات الخلايا العصبية. ونحن قد ولدت pAAV.EF1α.flex.DTA للدفتيريا صريح السمية جزء A (DTA) بطريقة تعتمد على لجنة المساواة العرقية.
   1. لإنشاء ناقل فيروسي تعتمد على لجنة المساواة العرقية، اختر ناقل تعتمد على لجنة المساواة العرقية مع أحد المروجين مناسبة (مثلاً، pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP). تضخيم تسلسل الترميز المفضل (مثلاً، DTA) بتفاعل البوليميراز المتسلسل مع الإشعال التي تشمل الإداريين ونهيي أو متوافق مع تقييد endonuclease الاعتراف بالمواقع في يتدلى بهم (انظر الحاضنة et al. ⁷)
   2. نفذ باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية النبذ تقييد ناقل الحمض النووي (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) ومن تضخيم PCR إدراج (ني-DTA-الإداريين) مع قيود اندونوكليسيس ني والإداريين. اضطر الشظايا المنقي.
   3. تحويل رد فعل ربط إلى البكتيريا مناسبة، وفقا للبروتوكول نظراً للمورد للبكتيريا المختصة للاختيار، ولوحة البكتيريا على لوحات رطل. استخدام recA-تفتقر إلى قمعها/السلالات، مثل MDS42 أو Stbl3، للاستنساخ والتضخيم اللاحقة من بلازميد الحمض النووي.
   4. اليوم بعد التحول، انتقاء الحيوانات المستنسخة وتطعيم منهم في المتوسط رطل وتستكمل مع المبيت المضادات الحيوية المناسبة في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، استخراج الحمض النووي بلازميد من البكتيريا المستزرعة. التحقق من نجاح الاستنساخ بتقييد النبذ وتسلسلها بلازميد استخراج الحمض النووي.
   5. تضخيم ذات جودة عالية، البكتيريا بلازميد الحمض النووي (راجع الخطوة 1-1-3). إرسال تضخيم الحمض النووي إلى مرفق النواقل فيروسية أساسية لإنتاج الفيروس.

2. توصيل خلايا العمود الفقري

1. إعداد الفيروسات الحل
   تنبيه: الفيروسات المعدية الكواشف وينبغي التعامل معها وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة. وفي معظم الحالات، يمكن أن تعالج رافس على مستوى السلامة الأحيائية 1 (BSL1).
   1. في يوم الحقن، تذويب قاسمة مخزون فيروس المنقي المرجوة على الجليد وإبقائه على الجليد حتى مباشرة قبل الحقن. تجنب المتكررة في تجميد-ذوبان الجليد-دورات، هذه سوف يقلل من عيار فعال لهذا الفيروس.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، الفيروس ديفروستيد الكوة يمكن الاحتفاظ عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام.
   2. تمييع جزيئات الفيروس في العقيمة 0.9% كلوريد الصوديوم أو الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
      ملاحظة: عيار مناسب يعتمد على أهداف تجريبية، وينبغي أن يحدد تجريبيا. لتبدأ هو مجموع جيدة الفيروسي 3 × 10⁹ الجينوم نسخ (GC/مل، 3 × 300 nL حقنه من 3.33x10¹² ). أخذ الزائد وفقدان بعض أثناء تحميل الشعرية في الاعتبار، سوف يلزم حوالي 2.5 ميليلتر من الفيروسات الحل لكل الماوس.
2. إعداد ميكروبيبيتيس لحقن إينتراسبينال
   1. 'سحب' الشعيرات الدموية رقيقة الجدار الزجاج (القطر الخارجي 1 مم) على ساحبة ميكروبيبيتي لإنشاء مم ~5.5 طويلة، الضحلة عرقوب. استخدام إعدادات البرنامج 00 وخيوط سخان 3.0 مم مع P(A) تكييف كما هو الحال في الجدول 1.
      ملاحظة: الانسحاب يمكن أن يتم في وقت مبكر. يجب تخزين الشعيرات الدموية سحبت في حاوية مغلقة حول نمذجة الطين لتفادي الغبار، والتي يمكن أن تسد في وقت لاحق ميكروبيبيتي. التعقيم ميكروبيبيتيس ليس ضروريا.
   2. مقطع عرقوب شعري سحبت مع الملقط الصفيحة بطول حوالي 4.5 إلى 5 مم لإنشاء تلميح فتح مع قطر داخلي ميكرو 25-35. باستخدام مجهر مع مقياس ميكرومتر، قياس القطر الداخلي لعدة ميكروبيبيتيس للحصول على شعور كبير كيف فتح ينبغي أن يكون، أو قياس لكل ميكروبيبيتي.
      ملاحظة: نصيحة صغيرة يمكن أن يؤدي إلى انسداد؛ نصيحة أكبر قد يسبب تلف الأنسجة والصعوبات لاختراق الحبل الشوكي.
3. التحضير لإعداد العمليات الجراحية وأدوات
   1. ضمان المعدات نظيفة وجاهزة للاستخدام. تطهير منطقة العمل بالمسح مع الإيثانول 70% وتعقيم أدوات التعقيم أو التطهير منها. لا تترك أي مطهر في المحاقن ميكروليتير الذي سيضر بالنواقل الفيروسية لاستخدامها.
4. إعداد الحيوان للجراحة والتخدير
   ملاحظة: المدة الإجمالية لعملية جراحية 60-90 دقيقة.
   1. اختر الفئران--6 إلى 10-الأسبوع القديمة لتسهيل العملية الجراحية.
      ملاحظة: إذا كان التصميم التجريبي يتطلب ذلك، من الممكن حقن الحيوانات الأصغر أو الأكبر سنا. أي سلالة ومن كلا الجنسين يمكن استخدامها في المبدأ، ولكن استخدام نفس السلالة الخلفية (مثلاً، C57BL/6J) لمقارنة سلوكيات بين خطوط مختلفة وراثيا الماوس. إذا كانت الاختلافات بين الجنسين من المتوقع أو تحليل للتحقيق، من الذكور والإناث في مجموعات منفصلة.
   2. حمل التخدير استخدام isoflurane ~ 5%. ضع الحيوان في إطار ستيريوتاكسيك على حصيرة حرارة والمحافظة على التخدير في إيسوفلوراني 1-2.5% (معدل تدفق الهواء 900 مل/دقيقة). رصد معدل التنفس طوال عملية جراحية.
   3. تطبيق مرهم العين زيوت التشحيم لمنع جفاف القرنية أثناء الجراحة.
   4. يحلق الخلفي للحيوان وإزالة الشعر بعناية مع الأنسجة الرطبة. تطهير الجلد حلق بمحلول اليود وتسمح للجلد الجاف.
   5. إعطاء العلاج مسكن (مثلاً، 0.1-0.2 مغ/كغ البوبرينورفين تحت الجلد).
5. التعرض للعمود الفقري على مستوى النخاع الشوكي القطني
   ملاحظة: نتيجة لتطور التفاضلية للحبل الشوكي والعمود الفقري، مستويات كل منها لا يتم محاذاة، ولكن الجزء القطني من النخاع الشوكي L4 في نفس المستوى كفقرة T13 الصدري.
   1. تحديد موقع زوج الضلع والذيلية أكثر من بالباتينج على طول العمود الفقري. استخدام مشرط، جعل قطع طولية 1.5-2.5 سم في الجلد بدءاً من مجرد روسترال على زوج الضلع الأكثر والذيلية.
   2. رفع الجلد بالملقط ويفصله من العضلات الأساسية مع المقص. طوال عملية جراحية، إبقاء الأنسجة المعرضة رطبة مع العقيمة 0.9% كلوريد الصوديوم.
   3. استخدام الملقط غرامة ومقص صغير، جعل شق في الطبقة غشائي القادم، رقيقة بجوار خط الوسط وقطع من العمليات الشائكة. أنه منفصل عن العضلات باراسبينوس الكامنة، ولكن تعلق على العمليات الشائكة.
6. تحديد فقرات على مستوى النخاع الشوكي القطني
   ملاحظة: عندما يتعرض العمود الفقري، عمليات الشائكة الظهرية والأربطة إينتيرترانسفيرسي يجب أن تكون مرئية. معالم تشريحية عدة يمكن أن تساعد في تحديد فقرة الصحيح للهدف (الشكل 1B).
   1. سحب الجلد إلى الوراء نحو الذيل لفضح الحرقفي. بنفس المستوى، ينضم الزوج الأكثر والذيلية الأربطة إينتيرترانسفيرسي تظهر العملية الشائكة L6. عد إلى الوراء في والذيلية لاتجاه روسترال لتحديد الفقرة الفائدة.
   2. جس على طول العمود الفقري. يقع زوج الضلع الأكثر والذيلية روسترال فقط إلى فقرة T13 وعظم الحوض على مستوى الفخذ على مستوى فقرة L6.
   3. قم بتحديد موقع بقعة فيها وتر بجانب العمود الفقري بياضا وآخر وسطى. ويقع فقرة T13 روسترال فقط. الجزء القطني من النخاع الشوكي L4 يقع داخل هذا الفقرة.
7. تثبيت العمود الفقري والتعرض للحبل الشوكي القطني
   1. ضع الحيوان على وسادة أنسجة الظاهرة لرفع ذلك إلى المشابك العمود الفقري للإطار ستيريوتاكسيك.
   2. تصحيح فقرة الهدف لتجنب تحركات العمود الفقري نتيجة للتنفس. لهذا الهدف، محاذاة المشابك المتاخمة لفقرة الهدف، إصلاح المشبك واحد في الموضع بالعمود الفقري مع الملقط أدزون أثناء تحديد المشبك الثاني.
      ملاحظة: العمود يجب أن يكون عمودي على الطائرة الحقن وثابتة بقوة حتى أن لم تتحرك عند الضغط من أعلى. إذا لزم الأمر، يمكن أن تكون ثابتة زوج ثاني من المشابك للعمود الفقري. وفي هذه الحالة، أنها مفيدة لإصلاح اثنين من الأزواج من المشابك لفقرات اثنين المتاخمة لفقرة الهدف.
   3. إزالة العضلات باراسبينوس أعلاه الفقرات الفائدة. استخدام مشرط، جعل شق موازية الآنسي فقط على الأوتار التي موازية للعمود الفقري، فضلا عن شقوق عمودي روسترال ووالذيليه لفقرة الهدف. أن يكون حريصا على عدم قطع عميق جداً. المسيل للدموع/قص بعيداً العضلات باستخدام رونجيورس. استخدام الملقط حسب الحاجة لإزالة الأنسجة المتبقية في الفقرة أو أعلاه دوراً في الفضاء الفقرية.
   4. في الفضاء الفقرية، وينبغي أن تكون الأوعية الدموية الظهرية مرئية مناسبة خط الوسط النخاع الشوكي. لحقن أحادية الجانب، تؤدي الاستئصال جزئي بحفر حفرة في منتصف الجهة المستهدفة من الفقرة. استخدم طب الأسنان غرامة الحفر الجهاز مع قطع كروية 0.5 مم وحفر بعناية خاصة عند الاقتراب من الحبل الشوكي. قم بإزالة أي شظايا العظام المتبقية بإبرة مشطوف الحواف ز 26 لفضح الحبل الشوكي.
   5. باستخدام إبرة مشطوف الحواف ز 26، التسلخات دوراً في حفر حفرة، وفي الفضاء الفقرية روسترال وإلى فقرة الهدف، كل شيء تقريبا 200 ميكرومتر الجانبي للأوعية الدموية الظهرية والذيلية. ينبغي الفرار النخاعي من الثقوب وينبغي أن يكون قليلاً انتفاخ الحبل الشوكي.
8. التحضير للحقن الحقن
   ملاحظة: ينبغي إعداد حقنه حقنه مباشرة قبل بداية الحقن الحد من خطر انسداد ميكروبيبيتي ذرات الغبار.
   1. جبل الشعرية الزجاج على حقنه ميكروليتير استخدام ضغط إبرة قابلة للإزالة المناسب كيت. ربط الجوز صارمة لضمان تناسب ضيق وآمنة.
   2. ملء المحاقن ميكروليتير بماء مقطر معقم والبدء في الضغط عليها بالمكبس.
      ملاحظة: إذا لم يكن هناك مقاومة كبيرة جداً حتى أن الماء لا يخرج بسهولة من الطرف، ميكروبيبيتي يرجح أن يتم حظر وينبغي تبادل.
   3. جبل حقنه على ميكرومانيبولاتور متصلاً ميكروينجيكتور التي تسيطر عليها إلكترونيا. احرص على عدم لمس أي شيء مع ميكروبيبيتي.
   4. باستخدام ميكروينجيكتور، وضع حوالي 1 ميليلتر من الجو لخلق فقاعة بين الماء والفيروس.
   5. وضع معالجة تجميعية 2.5 ميليلتر من الفيروسات الحل على قطعة من الفيلم البارافين، الانتقال بعناية غيض من ميكروبيبيتي إلى الحبرية استخدام الإطار ستيريوتاكسيك واستدراجه. ثم بعناية الصحافة الاستغناء حتى يخرج قليلاً من الفيروسات الحل في التلميح.
   6. سحب المحاقن، واستخدام قلم، مارك ميكروبيبيتي بمقياس رسم وملاحظة مستوى الحل الفيروس؛ وهذا سيسهل رصد ما إذا كان الضخ يسير حسب ما هو مبرمج.
9. حقن إينتراسبينال
   1. نقل غيض من ميكروبيبيتي أعلاه واحدة من الثقوب في دوراً، وثم إلى الأسفل حتى يلاحظ تأثير طفيف في دوراً. لاستهداف حقن هورن الظهرية العمود الفقري، تحريك لأسفل 500 ميكرومتر في 100 ميكرومتر زيادات متتالية (سرعة 1 مم/s) وثم 200 ميكرون حتى السماح للاستقرار الميكانيكية في الأنسجة.
      ملاحظة: عمق التلميح نهائي هو 300 ميكرون وفي هذه الحالة، ولكن يمكن تكييفها تبعاً للمنطقة المستهدفة.
      1. في حالة مقاومة لاختراق النسيج، قد يتم اصطياد ميكروبيبيتي في بلده دوراً. وفي هذه الحالة، سحب ونقل قليلاً إلى أوفيرلي في الحفرة، أو استخدام الإبرة مرة أخرى التسلخات في بلده دوراً بشكل صحيح قبل تكرار محاولة اختراق.
   2. برنامج للمضخة لكمية حقن المستهدف من 300 nL بسرعة حقن 50 nL/دقيقة واضغط على زر ابدأ لبدء الضخ.
   3. بعد الانتهاء من الحقن، تحقق من مقياس لمعرفة ما إذا كان قد انخفض مستوى الفيروس وتترك في ميكروبيبيتي في مكان 3 دقيقة إضافية للسماح للضغط من أجل حجته قبل تراجعه حقنه ببطء.
   4. كرر الخطوة 2.9.1.-2.9.3. لمواقع أخرى لحقن اثنين.
10. خياطة والانتعاش
    1. إزالة العمود الفقري المشابك ووسادة أسفل الماوس.
    2. إغلاق الجرح في طبقات مع غرز مقاطعته، خياطة طبقات الأنسجة سطحية بخيوط قابلة للامتصاص والجلد بخيوط غير-قابلة للامتصاص. تطبيق مطهر اليود على الجرح ستورد.
    3. إنهاء التخدير وترك الحيوان على حصيرة الحرارة حتى أنه يتعافى قبل إعادته إلى قفصة المنزل.
11. الرعاية ما بعد الجراحة
    1. مراقبة صحة الحيوان في اليوم لعملية جراحية، وفي اليوم التالي، وبعد ذلك كل 2-3 أيام. التأكد من أن الحيوان له مشيه المعتاد، مظهر صحي (الوزن والعيون والفراء والسلوك)، وأن يتم التئام الجرح.
    2. مواصلة العلاج مسكن (مثلاً، 0.1-0.2 مغ/كغ البوبرينورفين تحت الجلد) حسب الاقتضاء، ثلاث مرات في اليوم الواحد.

3-السلوكية والمورفولوجية التحليلات

1. التحليل السلوكي
   ملاحظة: السماح للحيوانات لاستيعاب الإعداد الخاصة بكل منها لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل البدء في القياسات للسماح لهم بالتكيف مع بيئة تجريبية جديدة.
   1. اختبار فون فري
      1. ضع الحيوانات فردياً في المقصورات الفردية من حوالي 10 سم × 10 سم على أرضية شبكة معدنية.
      2. تحفز على سطح هيندباو عن اللفافة للحقن مع خيوط فراي فون ديناميكية. مذكرة القوة التي تسحب الحيوان مخلب لها من الحافز.
      3. كرر خمس مرات وحساب عتبة انسحاب متوسط من القياسات ستة لكل الحيوانات.
   2. اختبار وخز دبوس
      1. ضع الحيوانات في المقصورات الفردية من حوالي 10 سم × 10 سم على أرضية شبكة معدنية.
      2. حفز سطح أخمصي هيندباو عن للحقن بإبرة 26-ز يتثلم دون اختراق للجلد. نقاط السلوك صفر (لا رد فعل) أو أحد (رد الفعل).
      3. كرر 9 مرات مع فترات زمنية من 3 دقيقة بين التحفيز وحساب النسبة المئوية واستجابة من القياسات 10 لكل الحيوانات.
   3. حقن دريد-يجند الكلوزابين-N-أكسيد (CNO)
      1. حل CNO في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) لإنشاء حل أسهم من 0.2 ملغم/ميليلتر، التي يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
      2. في يوم التجربة، تمييع الحل الأسهم في العقيمة 0.9% كلوريد الصوديوم إلى 0.2 ميكروغرام/ميليلتر وحقن 10 ميليلتر/غرام وزن الجسم إينترابيريتونيلي. حقن الحيوانات التحكم بالسيارة ([دمس] 0.2% في 0.9% كلوريد الصوديوم).
         ملاحظة: وفقا للتجربة، آثار الذروة على السلوكيات يمكن المتوقع 1-3 ح بعد الحقن، وآثار ينبغي أن تهدأ تماما بعد 24 ساعة. في حالة تنشيط الخلايا العصبية جليسينيرجيك، ولاحظ السلوكيات تشمل انخفاض الاستجابات ألم وحكة. السلوكيات التي أثارت من قبل تنشيط الخلايا العصبية بوساطة درياد سيعتمد على مجموعة فرعية مستهدفة من الخلايا العصبية في العمود الفقري.
   4. حقن بروريتوجينس لحمل حكة
      1. حل بروريتوجينس في 0.9% كلوريد الصوديوم بحلول 8 ملغ/مل (الكلوروكين) أو 10 ملغ/مل (الهستامين). ح 2 بعد الإدارة CNO، ضخ 10 ميليلتر لحل بروريتوجين أو المركبات تحت الجلد في سطح أخمصي هيندباو عن موقع حقن العمود الفقري. بدلاً من ذلك، ضخ في بروريتوجين إينتراديرمالي في العجل، الذي قد تم حلق قبل يوم واحد للحد من السلوك البرود التي تسببها الحلاقة نفسها.
   5. التصوير بالفيديو لتحليل نوسيفينسيفي عفوية أو السلوكيات التي يسببها بروريتوجين حكة
      1. ضع الحيوانات فردياً في المقصورات الشفافة (حوالي 10 سم القطر) مع قليلاً من الفراش من بها القفص المنزل كل منهما في الكلمة.
      2. شريط فيديو الحيوانات لمدة 5 دقائق لسجل عفوية ومدة 30 دقيقة لتسجيل السلوكيات الناجمة عن بروريتوجين. تحليل أشرطة الفيديو دون اتصال في سلال لمدة 5 دقائق.
   6. ألم مقابل السلوكيات حكة
      1. مراقبة وملاحظة الجفل ولعق وعض السلوكيات.
         ملاحظة: الجفل ولعق موقع المتأثرة النظر في الردود على الألم، حين قضم يرتبط مع حكة.
      2. تحليل أشرطة الفيديو في السرعة العادية، وقياس الوقت بأن الماوس قضى لعق أو قضم المواقع المتأثرة، أو قياس البطيء لتمييز أدق بين لعق وعض ردود الفعل. وبدلاً من ذلك، عد من نوبات لعق/العض/الجفل.
2. تحليل الخصائص المورفولوجية
   1. إجراء التحليلات المورفولوجية من واحد إلى ثلاثة أسابيع بعد الحقن بالفيروس أو بنهاية تجربة السلوكية.
      ملاحظة: أننا قد الكشف عن التعبير اجفب أقرب وقت ممكن 48 ساعة بعد الحقن، ولكن وجد أيضا أن التعبير تزيد بشكل كبير داخل المقبل أيام وحتى أسابيع. أسبوع واحد من الحضانة (من إينتراسبينال حقن حتى نضح) للخلايا مع مراسل قوي التعبير، قد يكون كافياً. للخلايا مع التعبير التحوير ضعيفة، والفيروسات مع المروجين ضعيفة أو fluorophores الأضعف، قد يلزم تعبير أطول لضمان مستويات لا يمكن اكتشافها.
   2. تثبيت الأنسجة
      1. نتخلل كل ترانسكارديالي الماوس، أولاً مع 20 مل من محلول النخاعي اصطناعية المثلج (قام) (كلوريد الصوديوم 125 مم، 25 مم، نة₂بو₄ 1.25 ملم، د-الجلوكوز 20 مم بوكل 2.5 ملم و CaCl2 2 MgSO4 1 مم ناكو₃ )، ثم مع 100 مل من 4% بارافورمالدهيد المثلج (في م 0.1 فوسفات الصوديوم العازلة، درجة الحموضة 7.4).
         تنبيه: بارافورمالدهيد سامة ويجب التعامل معها بحذر.
      2. فورا تشريح النخاع الشوكي القطني، وبعد إصلاح الأنسجة ح 2 مع بارافورمالدهيد 4% على الجليد. تغسل الأنسجة الثابتة بعد مع العازلة فوسفات الصوديوم 0.1 M (درجة الحموضة 7.4) بإيجاز واحتضان عليه ثم في محلول السكروز 25% (في م 0.1 فوسفات الصوديوم العازلة، درجة الحموضة 7.4) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
      3. قطع الأنسجة كريوبروتيكتيد في 30 ميكرومتر في كريوستات وتحميل المقاطع على شرائح المجهر.
   3. تلوين الفلورة
      1. بعد يغسل موجزة في برنامج تلفزيوني، تطبيق 300 ميكروليتر من عرقلة الحل (10% مصل حمار عادي في 0.3% تريتون-برنامج تلفزيوني) على الأقسام ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
      2. احتضان الشرائح مع 300 ميكروليتر تركيبات كل الأجسام الأولية في عرقلة الحل (انظر الجدول للمواد) طوال الليل في 4 درجات مئوية. تغسل الأجزاء 3 مرات لمدة كل 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
      3. احتضان الشرائح مع مجموعات كل منها من الأجسام المضادة الثانوية في عرقلة الحل ح 1 في درجة حرارة الغرفة. تغسل الأجزاء 3 مرات لمدة كل 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
      4. باختصار شطف الشرائح في ddH₂س، ثم جبل كوفيرسليبس استخدام تركيب نيون متوسطة.
      5. الحصول على الصور الفلورية استخدام مجهر [كنفوكل] مزودة بعلامة x 20 وهدف 40 س.

النتائج

من أجل توضيح مستويات التعبير التي يمكن الحصول عليها بحقن إينتراسبينال راف ترميز بروتين ماركر، نحن أولاً حقن AAV1. CAG.eGFP في الحبل الشوكي القطني من الفئران البرية من نوع. أنتجت ثلاث حقن متباعدة حوالي 1 ملم بعيداً عدوى مستمرة تقريبا من قطاعات العمود الفقري القطني L3 إلى L5 (

Discussion

حقن إينتراسبينال من آفس قد أصبحت تقنية قوية في مختبر لبحوث، مما يتيح تحليل خلايا العمود الفقري مع حل زمنية ومكانية عالية. هذا البروتوكول يمكن توصيل من ثلاثة أجزاء العمود الفقري الرئيسي معصب من الخلايا العصبية الحسية تمتد على محاور عصبية طرفية اللكتات. وتنتج ترانسدوسينج ثلاثة أجزاء البيا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller	Zeitz	NA
anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator	Weinmann	NA
anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer	Midmark	NA
Heat mat: Mio Star Thermocare 100	Migros	717614700000
Electric shaver	Philips	BT9290
surgical microscope (OPMI pico)	Zeiss	NA
Small animal stereotaxic apparatus	Kopf	NA
Neurostar StereoDrive (optional)	Neurostar	NA
Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor	Harvard Apparatus	72-4811
PHD Ultra syringe pump with nanomite	Harvard Apparatus	70-3601
Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe	Hamilton	7635-01
Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm	Hamilton	55750-01
fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40	Osada	OS-40
spherical cutter, 0.5mm	Busch	12001005B
electronic von Frey anesthesiometer	IITC	23905
flexible von Frey hairs	IITC	#7
LSM710 Pascal confocal microscope	Zeiss	NA
0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective	Zeiss	NA
1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective	Zeiss	NA
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Tools
Scalpel Handle #4, 13cm	Fine Science Tools	10004-13
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm	Fine Science Tools	11027-12
Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup	Fine Science Tools	16121-14
Dumont #2 laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20
Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length	Fine Science Tools	12002-12
Fine forceps #5	Fine Science Tools	11254-20
Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and Chemicals
Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter	World Precision Instruments	TW 100-3
Syringes (1, 5 and 20 ml)	B. Braun	(9166917V, 4606051V, 4606205V)
26G beveled needle	B. Braun	4665457
Sterile scalpel blades	B. Braun	BB523
Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable	B. Braun	C1046220
Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable	B. Braun	C0932191
Sterile PBS or saline (0.9%)		NA
Ethanol, 70% (disinfectant)		NA
Iodine solution (e.g. Braunol)	B. Braun	18380
Anaesthetics  (e.g. Attane isoflurane)	Provet	2222
Aldasorber	Provet	333526
analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic)	Indivior	GTIN: 7680419310018
Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos)	Pharma medica	GTIN: 4031626710635
Cotton swabs (e.g. from)	IVF Hartmann	1628100
Facial tissues (e.g. from)	Uehlinger AG	2015.10018
Superfrost plus microscope slides	ThermoScientific	J1800AMNZ
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
C57BL/6J mice  (wildtype)	The Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:000664
Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre)	The Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:023526
Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom)	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:007914
Name	Company	Catalog Number	Comments
Viral vectors
AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP)	Penn Vector Core	AV-1-PV1963
AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP)	Penn Vector Core	AV-1-ALL854
AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato)	Penn Vector Core	AV-1-ALL864
AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA)	Penn Vector Core	Custom production
AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi))	Penn Vector Core	Custom production
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry	Addgene	44361
pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP	Addgene	20298
Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacteria
MDS42	ScarabGenomics
Stbl3	ThermoScientific	C737303
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Quiagen	12362
NucleoBond PC 500	Machery & Nagel	740574
clozapine-N-oxide (CNO)	Enzo Life Sciences	BBL-NS105-0025
chloroquine diphosphate salt	Sigma	C6628
histamine	Sigma	H7125
Dapi	Invitrogen	D3571
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies (dilution)
Rabbit anti-GFP (1:1000)	Molecular Probes	RRID:AB_221570
Rabbit anti-NeuN (1:3000)	Abcam	RRID:AB_10711153
Goat anti-Pax2 (1 : 200)	R & D Systems	RRID:AB_10889828
Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000)	Dr Carmen Birchmeier	Muller et al. 2002
Rabbit anti-GFAP (1 : 1000)	DakoCytomation	RRID:AB_10013382
Secondary antibodies raised in donkey (1:800)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	NA