Expressão do Transgene de mediada por vírus adeno-associado em geneticamente definidos neurônios da medula espinhal

Resumo

Intraspinal injeção de recombinase dependente recombinante vírus adeno-associado (rAAV) pode ser usada para manipular qualquer tipo de célula geneticamente rotulados na medula espinhal. Aqui descrevemos como transduce neurônios no Corno dorsal da medula espinhal lombar. Esta técnica permite interrogatório funcional do subtipo neurônio manipulado.

Resumo

Manipulação seletiva de subpopulações neuronais da coluna vertebral tem sido conseguida principalmente por dois métodos diferentes: 1) interseccional genética, segundo o qual ratos transgénicos duplos ou triplos são gerados para alcançar expressão seletiva de um repórter ou efetoras Gene (por exemplo, do locus Rosa26) na população da coluna desejada. 2) intraspinal injeção de vírus de adeno-associado de Cre-dependente recombinante (rAAV); aqui vetores AAV Cre-dependente que codifica para o gene repórter ou efetor de escolha são injetados na medula espinhal de ratos que expressam a recombinase Cre na subpopulação neuronal desejada. Este protocolo descreve como gerar vetores de rAAV Cre-dependente e como transduce neurônios no Corno dorsal da medula espinhal lombar L3-L5 de segmentos com rAAVs. Como os segmentos da coluna vertebral lombares L3-L5 são inervados por estes neurônios sensoriais periféricos que transmitem informações sensoriais a partir dos membros posteriores, o comportamento espontâneo e respostas aos testes sensoriais aplicados para o membro posterior ipsilateral ao lado de injeção podem ser analisados a fim de interrogar a função dos neurônios manipulados no processamento sensorial. Podemos fornecer exemplos de como esta técnica pode ser usada para analisar geneticamente definido subconjuntos dos neurônios da coluna vertebral. As principais vantagens da expressão do transgene mediada por vírus em ratos transgénicos Cre, em comparação com a expressão do transgene induzida por rato repórter clássica são os seguintes: 1) diferentes Cre-dependente rAAVs várias proteínas repórter ou efetor de codificação pode ser injetado em uma única linha do Cre transgénica, superando assim a necessidade de criar vários rato transgénico múltiplas linhas. 2) intraspinal injeção limita a manipulação de células de Cre-expressando para o local da injeção e o tempo após a injeção. As principais desvantagens são: 1) expressão de gene repórter de rAAVs é mais variável. 2) a cirurgia é necessária para transduce os neurônios da coluna vertebral de interesse. Qual dos dois métodos é mais apropriado depende da pergunta de pesquisa e população de neurônio para ser endereçado.

Introdução

A medula espinhal dorsal é essencial para o intercâmbio de informações entre a periferia do corpo e o cérebro. Estímulos sensoriais, tais como calor, frio, toque, ou estímulos nocivos são detectados pelos neurônios periféricos especializados, que transmitem esta informação para os neurônios do Corno dorsal da medula espinhal. Aqui, uma complexa rede de interneurônios inibitórios e excitatórios modula e eventualmente relés informações sensoriais através de neurônios de projeção da coluna vertebral para supra-espinhais sites^1,2. Os cálculos efectuados por espinhal intere os neurônios de projeção portão informações sensoriais, determinando qual informação é suprimida ou retransmitida em qual intensidade. Mudanças na integração dos estímulos sensoriais, tais como um equilíbrio alterado entre inibição e excitação, podem causar disfunções sensoriais, tais como hipersensibilidade ou alodinia (sensações dolorosas após estimulação normalmente não-dolorosos). Essas alterações são pensadas para ser que a causa da dor crônica de vários Estados^3,4. Assim, os circuitos da coluna vertebral são de elevada importância no processamento sensorial e, consequentemente, na percepção do ambiente de um organismo e self. Com o advento recente combinação de molecular, genética e técnicas cirúrgicas que permitem a manipulação precisa de subpopulações de neurônio espinhal geneticamente identificados, os cientistas agora estão começando a compreender os circuitos espinhais subjacentes responsável pelo processamento de distintas modalidades sensoriais.

Intraspinal injeção de rAAV em ratos transgénicos ou de tipo selvagem contribuiu enormemente para a manipulação, análise e compreensão da função de subconjuntos específicos de neurônios na coluna^{5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11}. esta técnica permite a entrega de proteínas marcador (tais como GFP / proteínas da fusão de GFP), proteínas de repórter (como GCaMP), ou proteínas efetoras (tais como toxinas bacterianas, channelrhodopsin ou receptores farmacogenético) em um espacialmente modo restrito para os neurônios da coluna vertebral. Injeção local de rAAVs de Cre-dependente em ratos transgênicos expressando recombinase Cre em um subconjunto específico de neurônios na coluna permite a análise específica da respectiva população neuronal. Nós empregamos esta técnica para rotular, ablação, inibir ou ativar glycinergic espinhal, neurônios, demonstrando que eles são uma parte essencial do portão espinhal, controlando a dor e coceira de transmissão⁷. Nesses experimentos, intraspinal injeção de rAAV Cre-dependente em ratos GlyT2::Cre permitiu a manipulação seletiva de glycinergic neurônios na medula espinhal lombar. Desse modo, a manipulação simultânea de supra-espinhais circuitos que contêm os neurônios glycinergic fundamentais para a sobrevivência do animal pode ser evitada.

Enquanto uma injeção intraspinal de rAAVs limita a infecção para o local da injeção, transdução viral pode ocorrer não só nos neurônios locais, mas também nos neurônios que se conectam ao local da injeção via projeções axonal. Este último é frequentemente usado para áreas de CNS de rastreamento fornecendo entrada neuronal, para um determinado núcleo no cérebro. A infecção de projeções axonal pode, no entanto, também ser um fator de confusão quando uma população definida de neurônios deve ser estudada em um determinado site. Para solucionar esses problemas, recentemente conduzimos uma análise abrangente de sorotipos do vírus adeno-associados e fitas de expressão para identificar sorotipos e os factores que podem ser usados para minimizar ou maximizar a transdução retrógrada. No contexto desta pesquisa específica em circuitos da coluna vertebral, analisamos a capacidade de diferentes sorotipos e promotores de retrogradely transduce neurônios no córtex somatossensorial ^{, medula rostral ventromedial (RVM) e os gânglios da raiz dorsal (DRG) 12}. a técnica descrita no presente protocolo, portanto, pode ser usada para analisar os neurônios da coluna no local da injeção ou para analisar os neurônios de projeção que fornecem a entrada para o site injetado da medula espinhal. O protocolo descrito aqui, três injeções de rAAV no lado esquerdo da medula espinhal lombar são executadas para habilitar a transdução de neurônios em três segmentos lombares (L3-L5). Os segmentos L3-L5 que recebemos a maioria da entrada sensorial do membro posterior ipsilateral ao local da injeção. Demonstramos que a manipulação funcional de neurônios geneticamente etiquetados em L3-L5 é suficiente para evocar alterações comportamentais robustas, assim fornecendo provas funcionais para a função do circuito de tal um subtipo de neurônio geneticamente rotulada.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Instituto veterinário cantonal suíço (Zurique) e estão em conformidade e em conformidade com todas as orientações institucionais e regulamentares pertinentes.

Nota: Todos os materiais juntamente com os respectivos fabricantes e/ou fornecedores estão listados na Tabela de materiais.

1. geração de vetores AAV Cre-dependente

Nota: Uma variedade de vetores de Cre-dependente com promotores diferentes pode ser comprada (consulte Tabela de materiais) ou, se a construção da expressão desejado não estiver disponível, pode ser gerado, modificando construções existentes de AAV. Note que o promotor e o sorotipo podem ter um impacto sobre a propagação da transdução viral (ver ¹²). A primeira parte do presente protocolo descreve brevemente a geração de dois diferentes vetores AAV Cre-dependente adequados para ganho e perda de experimentos de função, respectivamente.

1. Ativação de farmacogenética (ganho de função)
   1. Ordem pAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq)-mCherry (ver Tabela de materiais) para receptores desenhador exclusivamente ativados por drogas sintéticas (DREADD)-mediada por ativação.
   2. Ao receber a cultura bacteriana facada, raia para fora as bactérias em placas LB (ágar bacteriológico da série dissolvido em meio líquido de Luria-Bertani) suplementado com o antibiótico adequado. Incubar durante a noite a 37 ° C e escolher uma única colônia no dia seguinte.
      Nota: Plasmídeos contendo AAV genomas de vetor podem ser instáveis e recombinação do genoma viral, especialmente dentro do terminal invertido viral se repete (ITR), podem ocorrer durante a amplificação em e. coli. Sugerimos que usar recA-deficiente/suprimido por cepas tais como MDS42 ou Stbl3 para evitar recombinação dentro o plasmídeo contendo o genoma do vírus adeno-associados.
   3. Amplificar as bactérias seguindo as instruções dadas pelo vendedor dos escolhidos DNA-Maxi-Kit e preparar o Plasmídeo de alta qualidade com um ADN-Maxi-Kit disponível comercialmente (por exemplo, consulte a Tabela de materiais). Realizar um controle de qualidade da preparação do plasmídeo DNA verificando a integridade e a identidade do plasmídeo de DNA através de Resumo de restrição de uma alíquota do ADN do plasmídeo.
      Nota: Existem locais de reconhecimento para a endonuclease de restrição SmaI dentro os ITRs. Incluem um digest SmaI no controle de qualidade para verificar a integridade dos ITRs.
   4. Envie o DNA para uma instalação de núcleo do vetor viral para produzir alta qualidade rAAV.
      Nota: Alta concentração, preparações viral de alta qualidade são cruciais para evitando confusão fenótipos causados por contaminações no prep viral. Recomendamos, portanto, tendo o rAAV de escolha produzida em uma instalação de núcleo de vetor estabelecida, a menos que a produção de AAV está bem estabelecida no laboratório.
2. Ablação (perda de função)
   Nota: Toxinas bacterianas ou receptores de toxina podem ser usados para mediar a ablação da célula ou silenciar neuronal. Nós têm gerado pAAV.EF1α.flex.DTA para fragmento de toxina da difteria expressa A (DTA) na forma Cre-dependente.
   1. Para gerar um vetor viral Cre-dependente, escolher um vetor de Cre-dependente com um promotor apropriado (por exemplo, pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP). Amplificar a sequência de código de escolha (por exemplo, DTA) pela reação em cadeia da polimerase com primers que incluem ascos e NheI ou sites de reconhecimento compatível endonuclease de restrição em seus balanços (ver Foster et al. ⁷.)
   2. Usando as técnicas padrão de biologia molecular, realizar resumos de restrição do DNA vetor (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) e do PCR amplificados inserir (AscI-NheI-DTA) com as endonucleases de restrição ascos e NheI. Ligar os fragmentos purificados.
   3. Transformar a reação da ligadura em bactérias adequadas, de acordo com o protocolo fornecido pelo fornecedor das bactérias competentes de escolha e as bactérias em placas LB da placa. Use recA-deficiente/suprimido por cepas, como MDS42 ou Stbl3, para a clonagem e subsequente amplificação do ADN do plasmídeo.
   4. No dia após a transformação, escolher clones e inocular-lhes em LB suplementado com antibiótica apropriada noite a 37 ° C. No dia seguinte, extrai o DNA do plasmídeo de bactérias cultivadas. Verifique se a clonagem por restrição digere bem sucedida e sequenciamento do ADN do plasmídeo extraído.
   5. Amplificar de alta qualidade, Plasmídeo bacteriano (consulte a etapa 1.1.3). Envie DNA amplificado para uma instalação de núcleo do vetor viral para a produção de vírus.

2. transdução de células da coluna vertebral

1. Preparação da solução de vírus
   Atenção: Os vírus são reagentes infecciosos e devem ser manuseados de acordo com as orientações pertinentes. Na maioria dos casos, os rAAVs podem ser manipulados no nível de biossegurança 1 (BSL1).
   1. No dia da injeção, descongelar uma alíquota das ações do vírus purificado desejado no gelo e mantê-lo no gelo até imediatamente antes da injeção. Evite o congelamento-descongelamento-ciclos repetidos, como estas irão reduzir o título eficaz do vírus.
      Nota: Se necessário, o vírus descongelado alíquota pode ser mantido a 4 ° C por até 3 dias.
   2. Diluir as partículas de vírus em estéril 0,9% NaCl ou fosfato tampão salino (PBS).
      Nota: O título apropriado depende dos objectivos experimentais e deve ser determinado experimentalmente. Uma boa carga viral total é começar com 3 x 10⁹ cópias de genoma (3.33x10¹² GC/mL, 3 x 300 nL injetado). Tomada em excesso e alguma perda durante o carregamento do capilar em conta, cerca de 2,5 µ l de solução de vírus serão necessários para cada rato.
2. Preparação de micropipetas para injeções Intraspinal
   1. 'Puxar' capilares de vidro de parede fina (diâmetro externo 1 mm) em um extrator de micropipeta para criar um ~5.5 mm de comprimento, raso da pata. Use um filamento aquecedor de 3,0 mm e configurações do programa 00 com P(A) adaptado como na tabela 1.
      Nota: Puxando pode ser feito com antecedência. Os capilares puxados devem ser armazenados em um recipiente fechado sobre modelagem de argila para evitar a poeira, que mais tarde pode entupir a micropipeta. Autoclave de micropipetas não é necessário.
   2. Clip da haste do capilar puxado com fórceps de laminectomia para um comprimento de cerca de 4,5 a 5 mm para criar uma ponta de abertura com um diâmetro interno de 25-35 μm. Usando um microscópio com uma escala de micrômetro, meça o diâmetro interno dos vários micropipetas para obter uma sensação de como grande a abertura deveria ser, ou medir para cada micropipeta.
      Nota: Uma ponta menor pode conduzir à obstrução; uma dica maior pode causar danos nos tecidos e dificuldades para penetrar a medula espinhal.
3. Preparação da instalação cirúrgica e ferramentas
   1. Garantir que o equipamento está limpo e pronto para ser usado. Desinfetar a área de trabalho limpando com 70% de etanol e esterilizar ferramentas por autoclavagem ou desinfecção-los. Não deixe qualquer desinfetante na seringa microlitro que prejudicaria o vetor viral para ser usado.
4. Preparação do Animal para a cirurgia e anestesia
   Nota: A duração total da cirurgia é de 60-90 min.
   1. Escolha de 6 a 10 - semana de idade ratos para facilitar o procedimento cirúrgico.
      Nota: Se o delineamento experimental requer, a injeção de animais mais jovens ou mais velhos é possível. Toda a tensão e ambos os sexos podem ser usados no princípio, mas usam o mesmo tipo de fundo (por exemplo, C57BL/6J) para comparação de comportamentos entre linhas diferente do rato transgénico. Se as diferenças de sexo são esperadas ou a ser investigada, analisar os machos e as fêmeas em grupos separados.
   2. Induzi a anestesia com isoflurano ~ 5%. Coloque o animal na armação estereotáxica em uma esteira de calor e manter a anestesia com isoflurano 1-2,5% (taxa de fluxo de ar 900 mL/min). Monitore a taxa de respiração durante a cirurgia.
   3. Aplica a pomada lubrificante, para evitar a secura da córnea durante a cirurgia.
   4. Raspar as costas do animal e remover cabelo cuidadosamente com tecidos húmidos. Desinfectar a pele depilada com solução de iodo e permitem que a pele seca.
   5. Dar tratamento analgésico (por exemplo, 0,1-0,2 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea).
5. Exposição da Coluna Vertebral a nível lombar da medula espinhal
   Nota: Devido ao desenvolvimento diferencial da medula espinhal e coluna vertebral, os respectivos níveis não estão alinhados, mas o segmento lombar da medula espinhal de L4 é o mesmo nível da vértebra torácica T13.
   1. Localize o par de costelas a mais caudal por palpação ao longo da coluna vertebral. Usando um bisturi, faça um corte longitudinal de 1,5 a 2,5 cm na pele a partir apenas rostral para o par de costelas a mais caudal.
   2. Levantar a pele com pinças e desconectá-lo do músculo subjacente com uma tesoura. Durante a cirurgia, manter os tecidos expostos húmida com estéril 0,9% NaCl.
   3. Usando a pinça fina e pequena tesoura, fazer uma incisão na camada membranosa fina, próxima ao lado da linha mediana e cortá-lo de que os processos espinhosos. Ele é separado da musculatura paraespinhal subjacente, mas anexado aos processos espinhosos.
6. Identificação das vértebras ao nível lombar da medula espinhal
   Nota: Uma vez que a coluna vertebral é exposta, os ligamentos intertransverse e os processos espinhosos dorsais devem ser visíveis. Vários pontos anatômicos podem auxiliar na identificação da vértebra correta para o alvo (figura 1B).
   1. Puxe a pele em direção a cauda para expor a crista ilíaca. No mesmo nível, o par mais caudal de visíveis ligamentos intertransverse junta-se o processo espinhoso L6. Conte para trás em um caudal de direção rostral para identificar a vértebra de interesse.
   2. Palpe ao longo da coluna vertebral. O par de costelas a mais caudal situa-se apenas rostral da vértebra T13 e o osso pélvico ao nível do quadril é a nível da vértebra L6.
   3. Localize o ponto onde o tendão ao longo do lado da coluna vertebral é mais branca e mais medial. A vértebra T13 situa-se apenas rostral. O segmento lombar da medula espinhal de L4 situa-se esta vértebra.
7. Fixação da Coluna Vertebral e exposição da medula espinhal lombar
   1. Coloque o animal em uma almofada de tecidos enrolados para elevá-lo para as pinças da coluna vertebral da armação estereotáxica.
   2. Fixe a vértebra alvo para evitar movimentos da coluna vertebral devido à respiração. Para este objetivo, alinhar as pinças adjacentes à vértebra alvo, corrigir um grampo em posição e mantenha a coluna vertebral com pinça Adson, enquanto o segundo grampo de fixação.
      Nota: A coluna deve ser perpendicular ao plano de injeção e firmemente fixado para que ela não se move sobre a pressão de cima. Se necessário, um segundo par de braçadeiras pode fixar-se à coluna vertebral. Neste caso, é útil corrigir os dois pares de pinças para as duas vértebras adjacentes para a vértebra alvo.
   3. Retire o músculo paraespinhal acima das vértebras de interesse. Usando um bisturi, faça uma incisão paralela só medial para os tendões que são paralelos à coluna vertebral, bem como incisões perpendiculares rostral e caudal a vértebra alvo. Tenha cuidado para não cortar muito fundo. Lágrima/cortar fora o músculo usando ruginas. Uso de fórceps quando necessário para remover o tecido remanescente na vértebra ou acima a dura-máter no espaço intervertebral.
   4. No espaço intervertebral, o vaso sanguíneo dorsal deve ser visível a marcação da linha média da medula espinhal. Para injeções unilaterais, execute uma laminectomia parcial por perfurar um buraco no meio do lado da vértebra de alvo. Use uma odontologia bem perfuração aparelhos com um cortador esférico de 0.5 mm e perfurar com especial cuidado ao aproximar-se da medula espinhal. Remova qualquer restantes fragmentos de osso com uma agulha chanfrada 26g para expor a medula espinhal.
   5. Usando uma agulha chanfrada 26g, perfure a dura-máter no buraco perfurado e no espaço intervertebral rostral e caudal à vértebra alvo, todos os cerca de 200 µm lateral para o vaso sanguíneo dorsal. Líquido cefalorraquidiano deve estar a fugir dos buracos e da medula espinhal deve ser ligeiramente abaulamento para fora.
8. Preparação da seringa de injeção
   Nota: A seringa de injeção deve ser preparada imediatamente antes do início da injeção para reduzir o risco de entupimento da micropipeta de partículas de poeira.
   1. Monte o capilar de vidro em uma seringa de microlitro usando o kit de ajuste de compressão de agulha removível. Aperte a porca firmemente para assegurar um ajuste firme e seguro.
   2. Encha a seringa de microlitro com água destilada estéril e começar a pressioná-lo para fora com o êmbolo.
      Nota: Se houver muita resistência para que a água não vem facilmente fora da ponta, a micropipeta provavelmente está bloqueada e deve ser trocada.
   3. Monte a seringa em um micromanipulador conectado a um microinjector controlado eletronicamente. Tenha cuidado para não tocar em nada com a micropipeta.
   4. Usando o microinjector, elaborar cerca de 1 µ l de ar para criar uma bolha entre a água e o vírus.
   5. Cuidadosamente coloque uma gota de 2,5 µ l de solução de vírus em um pedaço de filme de parafina, mova a ponta da micropipeta para a gota usando a armação estereotáxica e desenhá-lo. Então, cuidadosamente, imprensa dispense até um pouco de solução de vírus emerge na ponta.
   6. Retire a seringa e, usando uma caneta, marque a micropipeta com uma escala e observe o nível da solução de vírus; Isto irá facilitar o acompanhamento da se a infusão está a progredir como programado.
9. Intraspinal injeções
   1. Mova a ponta da micropipeta a acima de um dos buracos na dura-máter e então empurre-o até uma ligeira mossa é observada na dura-máter. Para almejar a injeção para o corno dorsal da coluna vertebral, mova para baixo a 500 µm em incrementos de consecutivos 100 µm (1 mm/s de velocidade) e em seguida a 200 µm até para permitir a estabilização mecânica do tecido.
      Nota: A profundidade final da ponta é 300 µm, neste caso, mas pode ser adaptada dependendo da área do alvo.
      1. Se o tecido é resistente à penetração, a micropipeta pode estar pegando a dura-máter. Neste caso, retrair e mova ligeiramente overlie o buraco, ou usar a agulha novamente para perfurar a dura-máter corretamente antes de repetir a tentativa de penetração.
   2. Programar a bomba para um volume de injeção de alvo de 300 nL a uma velocidade de injeção de 50 nL/min e pressione o botão start para iniciar a infusão.
   3. Depois de concluída a injeção, verifique a escala para ver se o nível de vírus caiu e deixar a micropipeta no lugar por um adicional 3 min permitir que a pressão equilibrar antes lentamente retraindo a seringa.
   4. Repita o passo 2.9.1.-2.9.3. para os outros sites de injeção de dois.
10. Sutura e recuperação
    1. Retire os grampos da coluna vertebral e a almofada abaixo o mouse.
    2. Feche o ferimento em camadas com stiches interrompidos, suturar a pele e as camadas de tecido superficial com suturas absorvíveis com suturas não absorvíveis. Aplica o desinfetante iodo na ferida suturada.
    3. Terminar a anestesia e deixar o animal na esteira do calor até que se recupere antes de devolvê-lo à sua gaiola em casa.
11. Cuidados pós-operatórios
    1. Monitore a saúde do animal no dia da cirurgia, no dia seguinte e então a cada 2-3 dias. Certifique-se de que o animal tem uma marcha normal, uma aparência saudável (peso, olhos, pele e comportamento), e que a ferida está cicatrizando.
    2. Continuar o tratamento analgésico (por exemplo, 0,1-0,2 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea), se necessário, três vezes por dia.

3. comportamentais e morfológicas análises

1. Análise comportamental
   Nota: Permitir que os animais se acomodar para a respectiva instalação pelo menos 30 min antes de iniciar as medições para deixá-los a se adaptar ao novo ambiente experimental.
   1. Teste de von Frey
      1. Coloque animais individualmente em compartimentos individuais de aproximadamente 10 cm x 10 cm em um piso de grade metálica.
      2. Estimule a superfície plantar do hindpaw ipsilateral ao local da injeção com um filamento de von Frey dinâmico. Observe a força com que o animal retira a pata o estímulo.
      3. Repetir cinco vezes e calcular o limiar de retirada média de seis medidas para cada animal.
   2. PIN Prick Test
      1. Coloque os animais em compartimentos individuais de aproximadamente 10 cm x 10 cm em um piso de grade metálica.
      2. Estimule a superfície plantar do hindpaw ipsilateral ao local da injeção com uma agulha de 26-G cega sem penetração da pele. Marca o comportamento como zero (nenhuma reação) ou um (reação).
      3. Repita 9 vezes com intervalos de 3 min entre estímulos e calcular a porcentagem de resposta de 10 medições para cada animal.
   3. Injeção de DREADD-ligante clozapine-N-óxido (CNO)
      1. Dissolva o CNO em dimetilsulfóxido (DMSO) para criar uma solução stock de 0,2 mg / µ l, que pode ser armazenado em temperatura ambiente.
      2. No dia do experimento, diluir a solução-mãe no estéril 0,9% NaCl a 0,2 µ g / µ l e injectar 10 µ l/g de massa corporal intraperitonealmente. Injetar animais controle com veículo (0,2% DMSO em 0,9% NaCl).
         Nota: De acordo com a experiência, pico efeitos sobre comportamentos podem ser esperado 1-3 h após a injeção, e efeitos completamente devem diminuir após 24 h. No caso de ativação de neurônios glycinergic, observado comportamentos incluem respostas reduzidas de dor e coceira. Comportamentos evocados pela ativação mediada por DREADD de neurônios dependerá o subconjunto alvo dos neurônios da coluna vertebral.
   4. Injeção de Pruritogens para induzir a coceira
      1. Dissolver pruritogens em 0,9% NaCl para soluções de 8 mg/mL (cloroquina) ou 10 mg/mL (histamina). 2 h após a administração do CNO, injectar por via subcutânea 10 µ l de solução de pruritogen ou veículo a superfície plantar do hindpaw ipsilateral ao local da injeção da coluna vertebral. Alternativamente, injete o pruritogen por via intradérmica o bezerro, que tem sido raspado um dia antes para reduzir o comportamento contrário, causado pelo corte em si.
   5. Filmando para analisar Nocifensive espontâneo ou induzido por Pruritogen coceira comportamentos
      1. Coloque animais individualmente em compartimentos transparentes (cerca de 10 cm de diâmetro) com um pouco de roupa de cama da respectiva casa-gaiola no chão.
      2. Filme os animais por 5 min para registro espontâneo e por 30 min para gravar comportamentos induzida por pruritogen. Analise os vídeos off-line em caixas de 5 min.
   6. Dor contra coceira comportamentos
      1. Observar e anotar a vacilar, lambendo e mordendo a comportamentos.
         Nota: Vacilar e lambendo do site afetado são considerados respostas à dor, Considerando que morder está associado a coceira.
      2. Analisar vídeos em velocidade normal, medir o tempo que o rato passou a lamber ou morder o local afetado ou medir em câmera lenta para uma distinção mais precisa entre lambendo e mordendo os reflexos. Como alternativa, conte o número de acessos lamber/mordendo/vacilar.
2. Análise morfológica
   1. Realizar análises morfológicas de uma a três semanas após a injeção do vírus ou no final de uma experiência comportamental.
      Nota: Temos detectado eGFP expressão logo que 48 h após a injeção, mas também achei que a expressão aumenta significativamente nas próximas dias e até semanas. Para as células com expressão forte repórter, uma semana de incubação (de injeção intraspinal até perfusão) pode ser o suficiente. Para as células com expressão do transgene fraco, vírus com promotores fracos ou fluorophores mais fraco, uma expressão mais longa pode ser necessária para assegurar níveis detectáveis.
   2. Fixação de tecidos
      1. Perfundir cada rato transcardially, primeiro com de 20 mL de solução gelada artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF) (125mm NaCl, NaHCO₃ a 25 mM, NaH₂PO₄ 1,25 mM, 20 mM, KCl 2.5 mM e CaCl2 2 mM MgSO4 1 mM D-glicose), então com 100 mL de 4% paraformaldeído gelada (em tampão de fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,4).
         Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico e deve ser manuseado com cuidado.
      2. Imediatamente dissecar a lombar da medula espinhal e fixar o tecido para 2h com paraformaldeído 4% no gelo. Brevemente, lave o tecido pós-fixados com tampão de fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,4) e incube-a então em solução de sacarose de 25% (em tampão de fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,4) durante a noite a 4 ° C.
      3. Cortar o tecido de cryoprotected a 30 μm em um criostato e montar as seções em corrediças do microscópio.
   3. Mancha da imunofluorescência
      1. Após breves lavagens em PBS, aplicar 300 μL de solução de bloqueio (10% de soro Normal burro em 0,3% Triton-PBS) nas seções por 1h à temperatura ambiente.
      2. Incubar as lâminas com 300 μL das respectivas combinações de anticorpos primários em solução de bloqueio (ver Tabela de materiais) durante a noite a 4 ° C. Lave as seções 3 vezes durante 5 min em PBS.
      3. Incube os slides com as respectivas combinações de anticorpos secundários em solução bloqueio por 1h à temperatura ambiente. Lave as seções 3 vezes durante 5 min em PBS.
      4. Brevemente enxaguar os slides em ddH₂O e, em seguida, montar as lamelas usando o meio de montagem fluorescente.
      5. Adquira imagens fluorescentes, utilizando um microscópio confocal, equipado com um x 20 e um objetivo de 40x.

Resultados

Para ilustrar os níveis de expressão que podem ser obtidos pela injeção intraspinal de rAAV codificação de uma proteína de marcador, injetamos primeiro AAV1. CAG.eGFP na medula espinhal lombar de ratos tipo selvagem. Três injeções espaçadas aproximadamente 1mm distante produziram uma infecção quase contínua de segmentos da coluna vertebral lombares L3 a L5 (figura 1A-C). Injeção de vírus em uma profundidade de 300 µm da supe...

Discussão

Intraspinal injeção de AAVs pode tornar-se uma técnica poderosa em um laboratório de pesquisa, permitindo a análise das células da coluna com uma solução espacial e temporal elevada. Este protocolo permite que a transdução dos três principais segmentos da coluna vertebral inervados pelos neurônios sensoriais, estendendo seus axônios periféricos para o membro posterior. Transducing três segmentos produz dados comportamentais robustos e reprodutíveis. Ele também permite que o teste de uma área sensorial m...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller	Zeitz	NA
anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator	Weinmann	NA
anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer	Midmark	NA
Heat mat: Mio Star Thermocare 100	Migros	717614700000
Electric shaver	Philips	BT9290
surgical microscope (OPMI pico)	Zeiss	NA
Small animal stereotaxic apparatus	Kopf	NA
Neurostar StereoDrive (optional)	Neurostar	NA
Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor	Harvard Apparatus	72-4811
PHD Ultra syringe pump with nanomite	Harvard Apparatus	70-3601
Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe	Hamilton	7635-01
Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm	Hamilton	55750-01
fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40	Osada	OS-40
spherical cutter, 0.5mm	Busch	12001005B
electronic von Frey anesthesiometer	IITC	23905
flexible von Frey hairs	IITC	#7
LSM710 Pascal confocal microscope	Zeiss	NA
0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective	Zeiss	NA
1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective	Zeiss	NA
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Tools
Scalpel Handle #4, 13cm	Fine Science Tools	10004-13
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm	Fine Science Tools	11027-12
Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup	Fine Science Tools	16121-14
Dumont #2 laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20
Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length	Fine Science Tools	12002-12
Fine forceps #5	Fine Science Tools	11254-20
Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and Chemicals
Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter	World Precision Instruments	TW 100-3
Syringes (1, 5 and 20 ml)	B. Braun	(9166917V, 4606051V, 4606205V)
26G beveled needle	B. Braun	4665457
Sterile scalpel blades	B. Braun	BB523
Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable	B. Braun	C1046220
Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable	B. Braun	C0932191
Sterile PBS or saline (0.9%)		NA
Ethanol, 70% (disinfectant)		NA
Iodine solution (e.g. Braunol)	B. Braun	18380
Anaesthetics  (e.g. Attane isoflurane)	Provet	2222
Aldasorber	Provet	333526
analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic)	Indivior	GTIN: 7680419310018
Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos)	Pharma medica	GTIN: 4031626710635
Cotton swabs (e.g. from)	IVF Hartmann	1628100
Facial tissues (e.g. from)	Uehlinger AG	2015.10018
Superfrost plus microscope slides	ThermoScientific	J1800AMNZ
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
C57BL/6J mice  (wildtype)	The Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:000664
Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre)	The Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:023526
Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom)	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:007914
Name	Company	Catalog Number	Comments
Viral vectors
AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP)	Penn Vector Core	AV-1-PV1963
AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP)	Penn Vector Core	AV-1-ALL854
AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato)	Penn Vector Core	AV-1-ALL864
AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA)	Penn Vector Core	Custom production
AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi))	Penn Vector Core	Custom production
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry	Addgene	44361
pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP	Addgene	20298
Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacteria
MDS42	ScarabGenomics
Stbl3	ThermoScientific	C737303
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Quiagen	12362
NucleoBond PC 500	Machery & Nagel	740574
clozapine-N-oxide (CNO)	Enzo Life Sciences	BBL-NS105-0025
chloroquine diphosphate salt	Sigma	C6628
histamine	Sigma	H7125
Dapi	Invitrogen	D3571
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies (dilution)
Rabbit anti-GFP (1:1000)	Molecular Probes	RRID:AB_221570
Rabbit anti-NeuN (1:3000)	Abcam	RRID:AB_10711153
Goat anti-Pax2 (1 : 200)	R & D Systems	RRID:AB_10889828
Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000)	Dr Carmen Birchmeier	Muller et al. 2002
Rabbit anti-GFAP (1 : 1000)	DakoCytomation	RRID:AB_10013382
Secondary antibodies raised in donkey (1:800)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	NA