Espressione del Transgene di mediata da Virus adeno-associato in neuroni geneticamente definiti del midollo spinale

Riepilogo

L'iniezione intraspinal di recombinase dipendente ricombinanti virus adeno-associato (rAAV) può essere utilizzato per manipolare qualsiasi tipo di cellula geneticamente etichettati nel midollo spinale. Qui descriviamo come trasduce neuroni nel corno dorsale del midollo spinale lombare. Questa tecnica consente funzionale interrogatorio del sottotipo del neurone manipolati.

Abstract

Manipolazione selettiva delle sottopopolazioni neuronali spinali è stato realizzato principalmente con due metodi differenti: 1) Intersezionali genetica, per cui vengono generati topi transgenici doppi o triplo per conseguire l'espressione selettiva di un giornalista o un effettore gene (ad es., dal locus Rosa26) nella popolazione spinale desiderata. 2) intraspinal iniezione di virus ricombinante adeno-associato Cre-dipendente (rAAV); qui vettori AAV Cre-dipendente che codifica per il gene reporter o effettore di scelta vengono iniettati nel midollo spinale di topi che esprimono Cre ricombinasi nella sottopopolazione neuronale desiderata. Questo protocollo viene descritto come generare dei vettori-rAAV Cre-dipendente e come trasduce neuroni nel corno dorsale del midollo spinale lombare L3-L5 dei segmenti con rAAVs. Come i segmenti spinali lombari L3-L5 sono innervate da quei neuroni sensoriali periferici che trasmettono informazioni sensoriali dalle zampe posteriori, comportamento spontaneo e le risposte al test sensoriali applicato per l'arto posteriore ipsilateral al lato di iniezione possono essere analizzati al fine di interrogare la funzione dei neuroni manipolati in elaborazione sensoriale. Forniamo esempi di come questa tecnica può essere utilizzata per analizzare geneticamente definita sottoinsiemi dei neuroni spinali. I principali vantaggi di espressione del transgene virus-mediate in topi transgenici Cre rispetto all'espressione indotta da mouse transgene reporter classica sono i seguenti: 1) diverse Cre-dipendente rAAVs codifica diverse proteine reporter o effettore può essere iniettato in una singola riga transgenica Cre, superando così la necessità di creare diversi mouse transgenico più linee. 2) intraspinal iniezione limita la manipolazione di cellule che esprimono Cre al sito di iniezione e per il tempo dopo l'iniezione. Gli svantaggi principali sono: 1) espressione di gene Reporter da rAAVs è più variabile. 2) chirurgia è necessaria per trasdurre i neuroni spinali di interesse. Quale dei due metodi è più appropriato dipende dalla domanda di ricerca e di popolazione di neurone da affrontare.

Introduzione

Il dorsale del midollo spinale è essenziale per lo scambio di informazioni tra la periferia del corpo e il cervello. Stimoli sensoriali quali calore, freddo, toccare, o stimoli nocivi vengono rilevati da neuroni periferici specializzati, che trasmettono queste informazioni ai neuroni del corno dorsale del midollo spinale. Qui, una complessa rete di interneuroni inibitorie ed eccitatorie modula e alla fine il informazioni sensoriali relè tramite i neuroni di proiezione spinale di supraspinal siti^1,2. I calcoli effettuati da midollo spinale inter- e neuroni di proiezione informazioni sensoriali, determinando così le informazioni che sono soppresso o inoltrate a quale intensità del cancello. Cambiamenti nell'integrazione degli stimoli sensoriali, come ad esempio un equilibrio alterato tra inibizione ed eccitazione, possono causare disfunzioni sensoriali quali ipersensibilità o allodynia (sensazioni dolorose dopo stimolo normalmente non doloroso). Questi cambiamenti sono probabilmente che la causa del dolore cronico vari stati^3,4. Così, circuiti spinali sono di grande importanza nell'elaborazione sensoriale e di conseguenza nella percezione di sé e ambiente di un organismo. Con il recente avvento e combinazione di genetica, molecolare e le tecniche chirurgiche che consentono la manipolazione precisa delle sottopopolazioni di neuroni spinali geneticamente identificati, gli scienziati ora stanno cominciando a capire i circuiti spinali sottostanti responsabile per l'elaborazione di distinte modalità sensoriali.

Iniezione intraspinal di rAAV nei topi wild-type o transgenici ha notevolmente contribuito alla comprensione della funzione di sottoinsiemi specifici di neuroni spinali^5,6,7, , l'analisi e manipolazione ^{8 , 9 , 10 , 11}. questa tecnica permette la consegna delle proteine marker (come GFP / proteine di fusione di GFP), proteine reporter (ad esempio GCaMP), o proteine effettrici (ad esempio tossine batteriche, channelrhodopsin o recettori farmacogenetici) nello spazio modo limitato ai neuroni spinali. Iniezione locale di Cre-dipendente rAAVs in topi transgenici che esprimono Cre ricombinasi in un sottoinsieme specifico dei neuroni spinali permette l'analisi specifica della rispettiva popolazione neuronale. Abbiamo impiegato questa tecnica di un'etichetta, l'ablazione, inibire o attivare glycinergic spinale neuroni dimostrando che sono una parte essenziale del cancello spinale controllo del dolore e prurito trasmissione⁷. In questi esperimenti, iniezione intraspinal di rAAV Cre-dipendente nei topi GlyT2::Cre abilitato la manipolazione selettiva dei neuroni glycinergic nel midollo spinale lombare. Quindi, manipolazione simultanea dei circuiti sovraspinali che contengono glycinergic neuroni critici per la sopravvivenza dell'animale può essere evitato.

Mentre un'iniezione intraspinal di rAAVs limita l'infezione al sito di iniezione, trasduzione virale può verificarsi non solo nei neuroni locali, ma anche nei neuroni che si connettono al sito di iniezione tramite proiezioni assonali. Quest'ultimo viene spesso utilizzato per aree cerebrali traccia che fornisce l'input di un neurone a un particolare nucleo nel cervello. L'infezione delle proiezioni axonal può, tuttavia, essere anche un fattore di confusione quando una popolazione definita dei neuroni deve essere studiata presso un determinato sito. Per risolvere questi problemi, abbiamo recentemente condotto un'analisi completa di AAV sierotipi e cassette di espressione per identificare i sierotipi e promotori che possono essere utilizzati per minimizzare o massimizzare la trasduzione retrograda. Nell'ambito di questa specifica ricerca in circuiti spinali, abbiamo analizzato la capacità di diversi sierotipi e promotori di trasdurre retrogradely neuroni a livello dei gangli della radice dorsale (DRG), il midollo rostrale ventromediale (RVM) e la corteccia somatosensoriale ¹². la tecnica descritta in questo protocollo può essere utilizzata quindi per analizzare i neuroni spinali al sito di iniezione o per analizzare i neuroni di proiezione che forniscono l'input per il sito iniettato del midollo spinale. Nel protocollo descritto qui, tre iniezioni di rAAV nel lato sinistro del midollo spinale lombare vengono eseguite per abilitare la trasduzione dei neuroni nei tre segmenti lombari (L3-L5). I segmenti di L3-L5 ricevono la maggior parte dell'input sensoriale dall'arto posteriore ipsilateral al sito di iniezione. Dimostriamo che la manipolazione funzionale dei neuroni geneticamente con etichettati in L3-L5 è sufficiente per evocare cambiamenti comportamentali robusti, così fornendo la prova funzionale per il circuito in funzione di un sottotipo di neurone geneticamente con etichetta.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'ufficio veterinario cantonale svizzero (Zurigo) e sono in accordo e in conformità con tutte le pertinenti orientamenti normativi e istituzionali.

Nota: Tutti i materiali con rispettivi produttori e/o fornitori sono elencati nella Tabella materiali.

1. generazione di vettori AAV Cre-dipendente

Nota: Una varietà di vettori di Cre-dipendente con differenti promotori possa essere acquistata (Vedi Tabella materiali) o, se il costrutto di espressione desiderata non è disponibile, può essere generato modificando costrutti AAV esistenti. Notare che il promotore e il sierotipo possono avere un impatto sulla diffusione della trasduzione virale (cfr. ¹²). La prima parte del presente protocollo descrive brevemente la generazione di due diversi vettori AAV Cre-dipendente adatti per guadagno e perdita di esperimenti di funzione, rispettivamente.

1. Attivazione di farmacogenetica (guadagno di funzione)
   1. Ordine pAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq)-mCherry (Vedi Tabella materiali) per progettazione recettori attivati esclusivamente da droghe di sintesi (DREADD)-attivazione mediata.
   2. Dopo aver ricevuto la cultura batterica pugnalata, striscia fuori batteri sulle piastre di LB (agar batteriologico-grade disciolte in mezzo liquido Luria-Bertani) completati con l'antibiotico adatto. Incubare per tutta la notte a 37 ° C e scegliere una singola Colonia il giorno successivo.
      Nota: Plasmidi contenenti AAV genomi di vettore possono essere instabili e ricombinazione del genoma virale, soprattutto all'interno del terminale di invertito virale si ripete (ITR), può verificarsi durante l'amplificazione in Escherichia coli. Suggeriamo usando recA-carenti/soppresso ceppi tali come MDS42 o Stbl3 per evitare di ricombinazione all'interno del plasmide contenente il genoma AAV.
   3. Amplificare i batteri seguendo le istruzioni fornite dal fornitore del scelto DNA-Maxi-Kit e preparare il DNA del plasmide di alta qualità con un DNA-Maxi-Kit disponibile in commercio (ad es., Vedi Tabella materiali). Eseguire un controllo di qualità della preparazione del DNA del plasmide verificando l'integrità e l'identità del plasmide DNA attraverso la raccolta di limitazione di un'aliquota del plasmide del DNA.
      Nota: Ci sono siti di riconoscimento per l'endonucleasi di restrizione SmaI entro il ITRs. Includere un digest di SmaI nel controllo qualità per verificare l'integrità di ITRs.
   4. Inviare il DNA in una struttura di nucleo del vettore virale al fine di produrre alta qualità rAAV.
      Nota: Alto titolo, preps virale di alta qualità sono fondamentali per evitare confusione fenotipi causati da contaminazioni nel prep virale. Si consiglia pertanto di avere rAAV di scelta prodotto in un impianto di nucleo di vettore stabilito, a meno che la produzione di AAV è ben consolidata in laboratorio.
2. Ablazione (perdita di funzione)
   Nota: Le tossine batteriche o tossina recettori utilizzabile per mediare ablazione delle cellule o il silenziamento di un neurone. Abbiamo generato pAAV.EF1α.flex.DTA al frammento di tossina di difterite espressa A (DTA) in modo Cre-dipendente.
   1. Per generare un vettore virale Cre-dipendente, selezionare un vettore di Cre-dipendente con un promotore adatto (ad es., pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP). Amplificare la sequenza codificante di scelta (ad es., DTA) da reazione a catena della polimerasi con gli iniettori che includono AscI e NheI o compatibile riconoscimento endonuclease di limitazione in loro sporgenze (Vedi Foster et al. ⁷)
   2. Utilizzando tecniche di biologia molecolare standard, eseguire digest di restrizione del DNA vettore (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) e di PCR-amplificato inserire (NheI-DTA-AscI) con l'endonucleasi di restrizione AscI e NheI. Legare i frammenti purificati.
   3. Trasformare la reazione di legatura in batteri adatti, secondo il protocollo dato dal fornitore dei batteri competenti della scelta e i batteri sui piatti della libbra della lastra. Utilizzare recA-carenti/soppresso per la clonazione, ad esempio MDS42 o Stbl3, ceppi e successiva amplificazione del DNA del plasmide.
   4. Il giorno dopo trasformazione, pick cloni e inoculare loro in LB medium completate con l'appropriato antibiotica durante la notte a 37 ° C. Il giorno successivo, è possibile estrarre il DNA del plasmide da batteri coltivati. Verificare successo clonazione di restrizione digest e sequenziamento del plasmide Estratto del DNA.
   5. Amplificare il DNA del plasmide batterico di alta qualità (Vedi punto 1.1.3). Invia DNA amplificato ad un impianto di nucleo di vettori virali per la produzione di virus.

2. trasduzione delle cellule spinali

1. Preparazione della soluzione di Virus
   Attenzione: Virus sono infettivi reagenti e devono essere smaltiti secondo le linee guida pertinenti. Nella maggior parte dei casi, rAAVs possono essere gestiti a livello di biosicurezza 1 (BSL1).
   1. Il giorno dell'iniezione, sbrinamento un'aliquota di riserva del virus purificato desiderata sul ghiaccio e tenerlo su ghiaccio fino a quando non direttamente prima dell'iniezione. Evitare di gelo-disgelo-cicli ripetuti, come questi ridurrà il titolo efficace del virus.
      Nota: Se necessario, il virus decongelato aliquota può tenuto a 4 ° C fino a 3 giorni.
   2. Diluire le particelle di virus in sterile 0,9% NaCl o fosfato tampone salino (PBS).
      Nota: Il titolo appropriato dipende gli obiettivi sperimentali e dovrebbe essere determinato sperimentalmente. Un buon carico virale totale è di iniziare con 3 x 10⁹ copie del genoma (3.33x10¹² GC/mL, 3 x 300 nL iniettato). Assunzione in eccesso e qualche perdita durante il caricamento il capillare in conto, saranno necessari circa 2,5 µ l di soluzione di virus per ogni mouse.
2. Preparazione di Micropipette per iniezioni Intraspinal
   1. 'Tirare' tubi capillari in vetro a parete sottile (diametro esterno 1 mm) su un estrattore micropipetta per creare una lunghezza di mm ~5.5, superficiale tibia. Utilizzare un filamento riscaldatore di 3,0 mm e impostazioni di programma 00 con p (a) adattato come in tabella 1.
      Nota: Tirare può essere fatto in anticipo. I capillari tirati devono essere conservati in un contenitore chiuso sulla modellazione di argilla per evitare la polvere, che più tardi potrebbe intasare la micropipetta. Sterilizzazione in autoclave di micropipette non è necessario.
   2. Clip la tibia del capillare tirato con forcipe laminectomia per una lunghezza di circa 4,5-5 mm per creare una punta di apertura con un diametro interno di 25-35 μm. Usando un microscopio con una scala di micrometro, misurare il diametro interno di micropipette diversi per avere un'idea di quanto sia grande l'apertura dovrebbe essere, o misurare per ogni micropipetta.
      Nota: Una punta più piccola può portare all'occlusione; una punta più grande potrebbe causare danni ai tessuti e difficoltà a penetrare il midollo spinale.
3. Preparazione dell'installazione chirurgica e strumenti
   1. Assicurarsi che l'apparecchiatura è pulito e pronto per essere utilizzato. Disinfettare la zona di lavoro strofinando con etanolo al 70% e sterilizzare strumenti di sterilizzazione in autoclave o disinfettarli. Non lasciare qualsiasi disinfettante sulla siringa microliter che danneggerebbe il vettore virale deve essere utilizzato.
4. Preparazione dell'animale per la chirurgia e l'anestesia
   Nota: La durata totale dell'intervento è di 60-90 min.
   1. Scegli 6 - ai 10 - settimana-vecchi topi per facilitare la procedura chirurgica.
      Nota: Se il disegno sperimentale lo richiede, l'iniezione degli animali più giovani o più vecchi è possibile. Qualsiasi ceppo ed entrambi i sessi possono essere utilizzati in linea di principio, ma utilizzano lo stesso ceppo di sfondo (ad es., C57BL/6J) per il confronto di comportamenti tra le linee di diverso tipo di mouse transgenici. Se le differenze del sesso sono attesi o da indagare, analizzare i maschi e le femmine in gruppi separati.
   2. Indurre l'anestesia con isoflurano ~ 5%. Metti l'animale nella cornice stereotassica su una stuoia di calore e mantenere l'anestesia a 1-2,5% isoflurane (portata aria: 900 mL/min). Monitorare il tasso di respirazione durante l'intervento chirurgico.
   3. Applicare unguento oculare lubrificante per prevenire la secchezza della cornea durante l'intervento chirurgico.
   4. Radere la parte posteriore dell'animale e rimuovere i capelli accuratamente con tessuti bagnati. Disinfettare la pelle rasata con soluzione di iodio e consentire la pelle si asciughi.
   5. Dare il trattamento analgesico (per esempio, 0.1-0.2 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea).
5. Esposizione della colonna vertebrale a livello lombare del midollo spinale
   Nota: A causa dello sviluppo differenziale del midollo spinale e la colonna vertebrale, dei rispettivi livelli non sono allineati, ma il segmento di midollo spinale lombare L4 è allo stesso livello come la vertebra toracica T13.
   1. Individuare la coppia di costola più caudale di palpazione lungo la colonna vertebrale. Usando un bisturi, trasformare un taglio longitudinale di 1,5-2,5 cm per la pelle a partire da soli rostral alla coppia più caudale della nervatura.
   2. Sollevare la pelle con il forcipe e staccarlo dal muscolo sottostante con le forbici. Durante l'intervento chirurgico, mantenere i tessuti esposti umido con sterile 0,9% NaCl.
   3. Utilizzando una pinzetta e piccole forbici, fare un'incisione nel prossimo, sottile strato membranoso proprio accanto alla linea mediana e tagliarlo dai processi spinous. È separata dal sottostante muscolo paraspinali, ma associata ai processi spinous.
6. Identificazione delle vertebre a livello lombare del midollo spinale
   Nota: Una volta che la colonna vertebrale è esposta, i legamenti intertransverse e i processi spinous dorsali dovrebbe essere visibili. Diversi punti di riferimento anatomici può aiutare a identificare la vertebra corretta destinazione (Figura 1B).
   1. Tirare la pelle indietro verso la coda per esporre la cresta iliaca. Allo stesso livello, la coppia più caudale dei legamenti intertransverse visibile si unisce il processo spinous L6. Conta all'indietro in un caudale alla direzione rostrale per identificare la vertebra di interesse.
   2. Palpare lungo la colonna vertebrale. La coppia di costola più caudale si trova appena rostral alla vertebra T13 e l'osso pelvico a livello dell'anca è al livello della vertebra L6.
   3. Individuare il punto dove il tendine lungo il lato della colonna vertebrale è più bianca e più mediale. La vertebra T13 si trova appena rostrale. Il segmento di midollo spinale lombare L4 si trova all'interno di questa vertebra.
7. Fissazione della colonna vertebrale e l'esposizione del midollo spinale lombare
   1. Metti l'animale su un cuscino di tessuti arrotolati per elevarlo ai morsetti spinali della cornice stereotassica.
   2. Difficoltà della vertebra di destinazione per evitare movimenti della colonna vertebrale a causa di respirazione. Per questo scopo, allineare i morsetti adiacenti alla vertebra destinazione, fissare un morsetto in posizione e tenere la colonna vertebrale con forcipe Adson mentre il secondo morsetto di fissaggio.
      Nota: La colonna dovrebbe essere perpendicolare al piano di iniezione e saldamente fissati in modo che non si muove su pressione dall'alto. Se necessario, una seconda coppia di morsetti può essere fissata alla colonna vertebrale. In questo caso, è utile fissare le due coppie di morsetti per le due vertebre adiacenti alla vertebra destinazione.
   3. Rimuovere il muscolo paraspinous sopra le vertebre di interesse. Usando un bisturi, fare un'incisione parallela appena mediale ai tendini che sono paralleli alla colonna vertebrale, così come incisioni perpendicolare rostrale e caudale alla vertebra destinazione. Fare attenzione a non tagliare troppo in profondità. Lacrima/tagliato via il muscolo utilizzando Pinze ossivore. Utilizzare pinze necessari per rimuovere il tessuto rimanente sulla vertebra o sopra la dura madre nello spazio intervertebrale.
   4. Nello spazio intervertebrale, il vaso sanguigno dorsale dovrebbe essere visibile la marcatura della linea mediana del midollo spinale. Per preparazioni iniettabili unilaterale, eseguire un laminectomy parziale da un foro nel mezzo del lato destinazione della vertebra. Utilizzare un bene Odontoiatria apparecchi con una fresa sferica di 0,5 mm di perforazione e forare con particolare attenzione quando ci si avvicina al midollo spinale. Rimuovere eventuali frammenti di osso restante con un ago smussato 26G per esporre il midollo spinale.
   5. Utilizzando un ago smussato 26G, perforare la dura madre nel foro e nello spazio intervertebrale rostrale e caudale alla vertebra destinazione, distano circa 200 µm laterale al vaso sanguigno dorsale. Liquido cerebrospinale dovrebbe essere fuoriuscita dai fori e il midollo spinale dovrebbe essere leggermente sporgenti.
8. Preparazione della siringa di iniezione
   Nota: La siringa di iniezione dovrebbe essere preparata immediatamente prima dell'inizio dell'iniezione per ridurre il rischio di intasamento la micropipetta di particelle di polvere.
   1. Montare il capillare di vetro su una siringa di microliter utilizzando la compressione di ago rimovibile kit di montaggio. Fissare il dado strettamente per assicurare una vestibilità sicura e stretta.
   2. Riempire la siringa di microliter con acqua distillata sterile e avviare premendo fuori con lo stantuffo.
      Nota: Se c'è troppa resistenza in modo che l'acqua non esce facilmente la punta, la micropipetta probabilmente è bloccata e deve essere scambiata.
   3. Montare la siringa un micromanipolatore collegato ad un microinjector controllato elettronicamente. Fare attenzione a non toccare nulla con la micropipetta.
   4. Utilizzando il microinjector, redigere circa 1 µ l di aria per creare una bolla tra l'acqua e il virus.
   5. Mettere una goccia di 2,5 µ l di soluzione di virus su un pezzo di pellicola di paraffina, muovere con cautela la punta della micropipetta nella gocciolina utilizzando la cornice stereotassica e aspirare la stessa. Quindi attentamente stampa erogare fino a quando un po' di soluzione virus emerge sulla punta.
   6. Ritrarre la siringa e, usando una penna, contrassegnare la micropipetta con una scala e notare il livello della soluzione virus; Questo faciliterà il monitoraggio di se l'infusione sta procedendo come programmato.
9. Iniezioni intraspinal
   1. Spostare la punta della micropipetta di sopra di uno dei fori nella dura e poi giù fino a una lieve ammaccatura è notata nella dura. Per impostare come destinazione l'iniezione al corno dorsale spinale, Sposta giù 500 µm in incrementi consecutivi di 100 µm (velocità 1 mm/s) e poi 200 µm fino per consentire la stabilizzazione meccanica del tessuto.
      Nota: La profondità finale della punta è 300 µm in questo caso, ma può essere adattata a seconda dell'area di destinazione.
      1. Se il tessuto è resistente alla penetrazione, la micropipetta potrebbe essere prendendo piede la dura madre. In questo caso, ritirare e spostare leggermente verso il foro di overlie, o utilizzare l'ago di nuovo per perforare la dura madre correttamente prima di ripetere il tentativo di penetrazione.
   2. Programmare la pompa ad un volume di iniezione di destinazione di 300 nL ad una velocità di iniezione di 50 nL/min e premere il pulsante start per iniziare l'infusione.
   3. Una volta completata l'iniezione, controllare la scala per vedere se il livello di virus è sceso e lasciare la micropipetta in posto per altri 3 minuti permettere alla pressione di equilibrare prima lentamente ritraendo la siringa.
   4. Ripetere il passo 2.9.1.-2.9.3. per gli altri siti di due iniezione.
10. Sutura e recupero
    1. Rimuovere i morsetti spinali e il cuscino sotto il mouse.
    2. Chiudere la ferita a strati con pinzature interrotti, suturare la pelle e gli strati di tessuto superficiale con suture assorbibili con suture non assorbibili. Applicare iodio disinfettante sulla ferita suturata.
    3. Terminare l'anestesia e lasciare l'animale sulla stuoia di calore fino a quando si recupera prima di restituirlo alla sua gabbia a casa.
11. Cura postoperatoria
    1. Monitorare l'integrità dell'animale sul giorno dell'intervento, il giorno successivo e poi ogni 2-3 giorni. Garantire che l'animale ha un'andatura normale, un aspetto sano (peso, occhi, pelliccia e comportamento), e che la ferita sta guarendo.
    2. Continuare il trattamento analgesico (per esempio, 0.1-0.2 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea) se necessario, tre volte al giorno.

3. analisi comportamentali e morfologiche

1. Analisi comportamentale
   Nota: Permettere agli animali di ospitare per il rispettivo setup per almeno 30 min prima di iniziare le misurazioni per far loro di adattarsi al nuovo ambiente sperimentale.
   1. Test di von Frey
      1. Inserire animali individualmente i singoli raggruppamenti di circa 10 x 10 cm su un piano di griglia del metallo.
      2. Stimolare la superficie plantare dei hindpaw ipsilateral al sito di iniezione con un filamento di von Frey dinamico. Si noti la forza in cui l'animale si ritira la sua zampa dallo stimolo.
      3. Ripetere cinque volte e calcolare la soglia di ritiro medio da sei misurazioni per ogni animale.
   2. Pin Prick Test
      1. Inserire animali singoli compartimenti di circa 10 x 10 cm su un piano di griglia del metallo.
      2. Stimolare la superficie plantare dei hindpaw ipsilateral al sito di iniezione con un ago smussato-26g senza penetrazione della pelle. Punteggio di comportamento come zero (nessuna reazione) o uno (reazione).
      3. Ripetere 9 volte con intervalli di 3 minuti tra stimolazioni e calcolare la percentuale di risposta da 10 misurazioni per ogni animale.
   3. Iniezione di DREADD-ligando clozapine-N-ossido (CNO)
      1. Sciogliere CNO in dimetilsolfossido (DMSO) per creare una soluzione di 0,2 mg / µ l, che può essere conservato a temperatura ambiente.
      2. Il giorno dell'esperimento, diluire la soluzione di riserva nello sterile 0,9% NaCl a 0,2 µ g / µ l e iniettare 10 µ l/g del peso corpo intraperitonealmente. Iniettare gli animali di controllo con il veicolo (0,2% DMSO nello 0,9% NaCl).
         Nota: Secondo esperienza, effetti di picco sui comportamenti possono essere previsto 1-3 h dopo l'iniezione, ed effetti dovrebbero abbassarsi completamente dopo 24 h. In caso di attivazione dei neuroni glycinergic, osservati comportamenti includono le risposte ridutrici di dolore e prurito. Comportamenti evocati da DREADD-ha mediato l'attivazione dei neuroni dipenderà il sottoinsieme mirato dei neuroni spinali.
   4. Iniezione di Pruritogens per indurre prurito
      1. Sciogliere pruritogens nello 0,9% NaCl alle soluzioni di 8 mg/mL (clorochina) o 10 mg/mL (istamina). 2 h dopo amministrazione del CNO, iniettare 10 µ l di soluzione di pruritogen o di un veicolo per via sottocutanea in superficie plantare dei hindpaw ipsilateral al sito di iniezione spinale. In alternativa, iniettare la pruritogen per via intradermica nel piccolo, che è stato rasato un giorno prima per ridurre il comportamento avversivo causata dalla rasatura stessa.
   5. Videoregistrazione per analizzare nocicettivi spontanea o indotta da Pruritogen prurito comportamenti
      1. Inserire animali individualmente in scomparti trasparenti (circa 10 cm di diametro) con un po' di biancheria da letto dai loro rispettivo casa-gabbia sul pavimento.
      2. Videocassetta gli animali per 5 min a record spontanea e per 30 min per registrare i comportamenti indotti da pruritogen. Analizzare i video off-line in bidoni di 5 min.
   6. Dolore contro comportamenti di prurito
      1. Osservare e prendere nota di batter ciglio, leccare e mordere i comportamenti.
         Nota: Batter ciglio e la leccata del sito interessato sono considerati risposte al dolore, mentre morde è associata a prurito.
      2. Analizzare il video a velocità normale, misurare il tempo che il mouse trascorso leccare o mordere il sito interessato o misurare al rallentatore per una più precisa distinzione tra leccare e mordere i riflessi. In alternativa, contare il numero di attacchi leccare/mordere/batter ciglio.
2. Analisi morfologica
   1. Eseguire analisi morfologiche da una a tre settimane dopo l'iniezione del virus o alla fine di un esperimento comportamentale.
      Nota: Abbiamo rilevato espressione di eGFP in appena 48 ore dopo l'iniezione, ma anche trovato che l'espressione aumenta significativamente entro i prossimi giorni e addirittura settimane. Per le celle con espressione forte reporter, una settimana di incubazione (da iniezione intraspinal fino a perfusione) può essere sufficiente. Per le celle con l'espressione del transgene debole, virus con deboli promotori o fluorofori più debole, un'espressione più lunga potrebbe essere necessario garantire livelli rilevabili.
   2. Fissazione del tessuto
      1. Irrorare ogni via mouse, prima con 20 ml di soluzione ghiacciata del liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) (NaCl 125mm, NaHCO₃ 25mm, NaH₂PO₄ 1,25 mM, D-glucosio 20 mM, KCl 2.5 mM e CaCl2 2 mM MgSO4 1 mM), quindi con 100 mL di paraformaldeide 4% ghiacciata (in tampone di sodio fosfato 0,1 M, pH 7,4).
         Attenzione: Paraformaldeide è tossico e deve essere maneggiato con cura.
      2. Immediatamente sezionare il midollo spinale lombare e post-fissare il tessuto per 2 h con paraformaldeide al 4% sul ghiaccio. Lavare brevemente il tessuto post-fisso con tampone di fosfato di sodio 0.1 M (pH 7.4) e quindi viene quindi incubato in soluzione di 25% di saccarosio (in tampone di sodio fosfato 0,1 M, pH 7,4) durante la notte a 4 ° C.
      3. Tagliare il tessuto prelevate a 30 μm su un criostato e montare le sezioni su vetrini da microscopio.
   3. Colorazione di immunofluorescenza
      1. Dopo breve lavaggi in PBS, applicare 300 μL di soluzione bloccante (10% di siero normale asino in 0,3% Triton-PBS) sulle sezioni per 1 h a temperatura ambiente.
      2. Incubare i vetrini con 300 μL delle rispettive combinazioni di anticorpi primari nella soluzione di blocco (Vedi Tabella materiali) tutta la notte a 4 ° C. Lavare le sezioni 3 volte per 5 minuti ciascuno in PBS.
      3. Incubare i vetrini con le rispettive combinazioni di anticorpi secondari in soluzione bloccante per 1 h a temperatura ambiente. Lavare le sezioni 3 volte per 5 minuti ciascuno in PBS.
      4. Brevemente sciacquare le diapositive con ddH₂O e poi montare i vetrini coprioggetti utilizzando il mezzo di montaggio fluorescente.
      5. Acquisire immagini fluorescenti utilizzando un microscopio confocale equipaggiato con un 20x e un obiettivo 40x.

Risultati

Al fine di illustrare i livelli di espressione che possono essere ottenuti tramite l'iniezione intraspinal di rAAV codifica una proteina marker, abbiamo iniettato prima AAV1. CAG.eGFP nel midollo spinale lombare di topi wild-type. Tre iniezioni a distanza di circa 1 mm prodotta un'infezione quasi continua dei segmenti spinali lombari L3 a L5 (Figura 1A-C). Iniezione di virus ad una profondità di 300 µm dalla superficie spinale conduce all'i...

Discussione

Intraspinal iniezione di AAVs può diventare una tecnica potente in un laboratorio di ricerca, consentendo l'analisi delle cellule spinali con un'alta soluzione temporale e spaziale. Questo protocollo consente la trasduzione dei tre principali segmenti spinali innervati dai neuroni sensoriali, estendendo loro assoni periferici per l'arto posteriore. Transducing tre segmenti produce dati comportamentali robusti e riproducibili. Permette inoltre di test di un'area sensoriale più grande rispetto a possibili dopo una singol...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller	Zeitz	NA
anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator	Weinmann	NA
anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer	Midmark	NA
Heat mat: Mio Star Thermocare 100	Migros	717614700000
Electric shaver	Philips	BT9290
surgical microscope (OPMI pico)	Zeiss	NA
Small animal stereotaxic apparatus	Kopf	NA
Neurostar StereoDrive (optional)	Neurostar	NA
Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor	Harvard Apparatus	72-4811
PHD Ultra syringe pump with nanomite	Harvard Apparatus	70-3601
Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe	Hamilton	7635-01
Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm	Hamilton	55750-01
fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40	Osada	OS-40
spherical cutter, 0.5mm	Busch	12001005B
electronic von Frey anesthesiometer	IITC	23905
flexible von Frey hairs	IITC	#7
LSM710 Pascal confocal microscope	Zeiss	NA
0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective	Zeiss	NA
1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective	Zeiss	NA
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Tools
Scalpel Handle #4, 13cm	Fine Science Tools	10004-13
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm	Fine Science Tools	11027-12
Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup	Fine Science Tools	16121-14
Dumont #2 laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20
Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length	Fine Science Tools	12002-12
Fine forceps #5	Fine Science Tools	11254-20
Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and Chemicals
Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter	World Precision Instruments	TW 100-3
Syringes (1, 5 and 20 ml)	B. Braun	(9166917V, 4606051V, 4606205V)
26G beveled needle	B. Braun	4665457
Sterile scalpel blades	B. Braun	BB523
Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable	B. Braun	C1046220
Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable	B. Braun	C0932191
Sterile PBS or saline (0.9%)		NA
Ethanol, 70% (disinfectant)		NA
Iodine solution (e.g. Braunol)	B. Braun	18380
Anaesthetics  (e.g. Attane isoflurane)	Provet	2222
Aldasorber	Provet	333526
analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic)	Indivior	GTIN: 7680419310018
Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos)	Pharma medica	GTIN: 4031626710635
Cotton swabs (e.g. from)	IVF Hartmann	1628100
Facial tissues (e.g. from)	Uehlinger AG	2015.10018
Superfrost plus microscope slides	ThermoScientific	J1800AMNZ
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
C57BL/6J mice  (wildtype)	The Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:000664
Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre)	The Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:023526
Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom)	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:007914
Name	Company	Catalog Number	Comments
Viral vectors
AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP)	Penn Vector Core	AV-1-PV1963
AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP)	Penn Vector Core	AV-1-ALL854
AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato)	Penn Vector Core	AV-1-ALL864
AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA)	Penn Vector Core	Custom production
AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi))	Penn Vector Core	Custom production
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry	Addgene	44361
pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP	Addgene	20298
Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacteria
MDS42	ScarabGenomics
Stbl3	ThermoScientific	C737303
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Quiagen	12362
NucleoBond PC 500	Machery & Nagel	740574
clozapine-N-oxide (CNO)	Enzo Life Sciences	BBL-NS105-0025
chloroquine diphosphate salt	Sigma	C6628
histamine	Sigma	H7125
Dapi	Invitrogen	D3571
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies (dilution)
Rabbit anti-GFP (1:1000)	Molecular Probes	RRID:AB_221570
Rabbit anti-NeuN (1:3000)	Abcam	RRID:AB_10711153
Goat anti-Pax2 (1 : 200)	R & D Systems	RRID:AB_10889828
Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000)	Dr Carmen Birchmeier	Muller et al. 2002
Rabbit anti-GFAP (1 : 1000)	DakoCytomation	RRID:AB_10013382
Secondary antibodies raised in donkey (1:800)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	NA