Adeno-assoziierten Virus-vermittelten Transgene Ausdruck in genetisch definierten Nervenzellen des Rückenmarks

Zusammenfassung

Intraspinal Injektion von Rekombinase abhängigen recombinant Adeno-assoziierte Virus (rAAV) kann verwendet werden, um jeden genetisch gekennzeichneten Zelltyp im Rückenmark zu manipulieren. Hier beschreiben wir, wie Neuronen im Hinterhorn des Rückenmarks lumbale transduzieren. Diese Technik ermöglicht funktionale Verhör des Subtyps manipulierten Neuron.

Zusammenfassung

Gezielte Manipulation der Wirbelsäule neuronalen Subpopulationen wurde vor allem durch zwei unterschiedliche Methoden erreicht: 1) intersektionale Genetik, wobei doppelte oder dreifache transgenen Mäusen erzeugt sind, um selektiv Ausdruck eines Reporters oder Effektor zu erreichen gen (z.B.aus der Rosa26-Locus) in der gewünschten spinale Bevölkerung. (2) Intraspinal Injektion von Cre-abhängige recombinant Adeno-assoziierte Virus (rAAV); Hier werden das Rückenmark von Mäusen auszudrücken Cre-Rekombinase in die gewünschte neuronalen Subpopulation Cre-abhängige AAV-Vektoren, die Codierung für die Reporter oder Effektor gen Wahl injiziert. Dieses Protokoll beschreibt, wie Cre-abhängige rAAV Vektoren erzeugen und wie Sie transduzieren Neuronen im Hinterhorn des Rückenmarks lumbale Segmente L3-L5 mit rAAVs. Als der lumbalen Wirbelsäule Segmente L3-L5 sind die peripheren sensorischen Neuronen, die sensorische Informationen aus der Hintergliedmaßen übertragen innerviert, werden spontanes Verhalten und Reaktionen auf sensorische Prüfungen auf die Megalosauridae ipsilateral zur Injektion Seite angewendet analysiert, um die Funktion der manipulierten Neuronen in sensorischen Verarbeitung zu befragen. Wir liefern Beispiele dafür, wie diese Technik verwendet werden kann, um genetisch analysieren Teilmengen von der spinalen Neuronen definiert. Die wichtigsten Vorteile der Virus-vermittelten Transgene Ausdruck in Cre Transgene Mäuse im Vergleich zu klassischen Reporter Maus-induzierte Transgene Ausdruck sind die folgenden: 1) verschiedene Cre-abhängige rAAVs Codierung verschiedene Reporter oder Effektor-Proteine kann sein in einer einzelnen Cre transgene Linie überwinden somit die Notwendigkeit, mehrere mehrere Transgene Maus Linien schaffen injiziert. (2) Intraspinal Injektion beschränkt Manipulation der Cre exprimierenden Zellen an der Injektionsstelle und auf die Zeit nach der Injektion. Die wichtigsten Nachteile sind: 1) Reporter-Gen-Expression von rAAVs ist variabler. (2) Operation ist erforderlich, um die spinalen Neuronen des Interesses transduzieren. Welche der beiden Methoden besser geeignet ist, hängt von der Neuron Bevölkerung und Forschung Frage angegangen werden.

Einleitung

Die dorsale Rückenmark ist wichtig für den Informationsaustausch zwischen der Peripherie des Körpers und des Gehirns. Sensorische Reize wie Hitze, Kälte, tippen, oder Schmerzreize werden durch spezialisierte peripheren Nervenzellen, die diese Informationen an Neuronen des Rückenmarks Hinterhorn vermitteln erkannt. Hier, ein komplexes Netzwerk von exzitatorischen und inhibitorischen Interneuronen moduliert und schließlich Relais sensorische Informationen über spinale Projektion Neuronen zu supraspinalen Standorten^1,2. Die Berechnungen von Rückenmark durchgeführten inter- und Projektion Neuronen gate sensorische Informationen, so bestimmen, welche Informationen unterdrückt oder mit welcher Intensität weitergeleitet. Änderungen bei der Integration der sensorischen Reize, wie eine veränderte Balance zwischen Hemmung und Erregung, können sensorische Funktionsstörungen wie Überempfindlichkeit oder Allodynie (schmerzhafte Empfindungen nach der Regel schmerzhafte Stimulation) verursachen. Diese Änderungen werden gedacht, um die zugrunde liegende Ursache der verschiedenen chronischen Schmerzen^3,4Staaten. So, spinale Schaltungen sind von großer Bedeutung in der sensorischen Verarbeitung und damit in der Wahrnehmung der Umwelt eines Organismus und selbst. Mit dem jüngsten aufkommen und Kombination von molekularen, genetischen und chirurgische Techniken, mit denen die präzise Manipulation von genetisch identifizierten spinale Neuronen Subpopulationen, beginnen Wissenschaftler jetzt zu verstehen, die zugrunde liegende Rückenmark Schaltungen verantwortlich für die Verarbeitung von verschiedenen sinnesmodalitäten.

Intraspinal Injektion von rAAV in Wildtyp oder Transgene Mäuse trug wesentlich zum Verständnis der Funktion von bestimmten Teilmengen der spinalen Neuronen^5,6,7, , Manipulation und Analyse ^{8 , 9 , 10 , 11}. diese Technik ermöglicht die Lieferung von Marker-Proteine (z. B. GFP / GFP Fusionsproteine), Reporter Proteine (z. B. GCaMP) oder Effektor-Proteine (z. B. bakterielle Toxine, Channelrhodopsin oder pharmakogenetischen Rezeptoren) in einer räumlich eingeschränkten Weise spinale Neuronen. Lokale Injektion von Cre-abhängigen rAAVs in transgenen Mäusen, die mit dem Ausdruck Cre-Rekombinase in eine bestimmte Teilmenge der spinalen Neuronen ermöglicht die spezifische Analyse der entsprechenden neuronalen Bevölkerung. Wir haben diese Technik zu beschriften, Abtragen, hemmen oder aktivieren spinale glycinergen Neuronen, die beweisen, dass sie sind ein wesentlicher Bestandteil der spinalen Tor Steuerung Schmerzen und Jucken Übertragung⁷beschäftigt. In diesen Experimenten aktiviert intraspinal Injektion von Cre-abhängige rAAV in GlyT2::Cre Mäusen die selektive Manipulation von glycinergen Neuronen in der Lendenwirbelsäule Rückenmark. Dadurch kann gleichzeitige Manipulation der supraspinalen Schaltungen, die kritisch für das Überleben des Tieres glycinergen Neuronen enthalten vermieden werden.

Während eine intraspinal Injektion von rAAVs Infektion auf der Website der Injektion beschränkt, kann virale Transduktion auftreten, nicht nur in lokalen Neuronen, sondern auch in Neuronen, die an der Injektionsstelle über axonalen Projektionen anschließen. Letzteres dient oft zur Spur CNS Bereichen Bereitstellung von neuronalen Input zu einem bestimmten Kern in das Gehirn. Die Infektion der axonalen Projektionen kann, jedoch auch eine verwirrende Faktor sein, wenn an einer bestimmten Stelle eine definierte Population von Neuronen untersucht werden soll. Um diese Probleme anzugehen, haben wir vor kurzem durchgeführt, eine umfassende Analyse der AAV-Serotypen und Expressionskassetten Serotypen und Promotoren, die verwendet werden können, zu minimieren oder maximieren retrograde Transduktion zu identifizieren. Im Rahmen dieser spezifischen Forschung in spinaler Schaltungen analysierten wir die Fähigkeit der verschiedenen Serotypen und Promotoren, doppelthebel transduzieren Neuronen in den Dorsal Root Ganglien (DRG), der rostral ventromedialen Medulla (RVM) und somatosensorischen Cortex ¹². die Technik in diesem Protokoll beschriebenen kann daher verwendet werden, um spinale Neuronen an der Injektionsstelle zu analysieren oder Projektion Neuronen zu analysieren, die Beiträge zu den injizierten Seite des Rückenmarks liefern. In dem hier beschriebenen Protokoll werden drei Injektionen von rAAV in die linke Seite des lumbalen Rückenmarks durchgeführt, um die Transduktion von Neuronen in den drei Lendenwirbel (L3-L5) zu ermöglichen. Die L3-L5-Segmente erhalten die meisten sensorischen Input von ipsilateral Megalosauridae an der Injektionsstelle. Wir zeigen, dass funktionale Manipulation von genetisch beschrifteten Neuronen im L3-L5 ausreichend robuste Verhaltensänderungen hervorrufen so funktional Nachweis für die Funktion der Schaltung solch eines genetisch beschrifteten Neuron-Untertyps.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden genehmigt durch Schweizer kantonalen Veterinäramt (Zürich) und sind in Übereinstimmung und die Einhaltung aller relevanten rechtlichen und institutionellen Richtlinien.

Hinweis: Alle Materialien zusammen mit der jeweiligen Hersteller bzw. Lieferanten sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt.

1. Generation der Cre-abhängige AAV-Vektoren

Hinweis: Eine Vielzahl von Cre-abhängigen Vektoren mit verschiedenen Promotoren kann erworben werden (siehe Tabelle der Materialien) oder wenn der gewünschte Ausdruck Konstrukt nicht verfügbar ist, kann es durch eine Änderung der bestehenden AAV Konstrukte generiert werden. Beachten Sie, dass der Projektträger und der Serotyp können einen Einfluss auf die Ausbreitung der virale Transduktion (s. ¹²). Der erste Teil dieses Protokolls beschreibt kurz die Generierung von zwei verschiedenen Cre-abhängige AAV-Vektoren geeignet für Gewinn und Verlust der Funktion Experimente, beziehungsweise.

1. Pharmakogenetische Aktivierung (Gain-Funktion)
   1. Bestellen Sie pAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq)-mCherry (siehe Tabelle der Materialien) für Designer-Rezeptoren aktiviert ausschließlich von Designerdrogen (DREADD)-vermittelte Aktivierung.
   2. Nach Erhalt der bakteriellen Stich-Kultur, ergänzt Streifen Bakterien auf LB-Platten (bakteriologische Grade Agar aufgelöst im flüssigen Medium Luria-Bertani) mit dem entsprechenden Antibiotikum. Über Nacht bei 37 ° C inkubieren Sie und wählen Sie eine einzelne Kolonie am nächsten Tag.
      Hinweis: Plasmide mit AAV Vektor Genome instabil sein können und Rekombination des Virusgenoms, vor allem innerhalb der viralen inverted Terminal wiederholt (ITR) kann auftreten, während der Amplifikation in E. Coli. Wir empfehlen solche Stämme mit RecA-defizienten/unterdrückt als MDS42 oder Stbl3, Rekombination in das Plasmid mit dem AAV-Genom zu vermeiden.
   3. Bakterien, die nach den Anweisungen des Verkäufers des gewählten zu verstärken DNA-Maxi-Kit und bereiten hochwertige Plasmid-DNA mit einem im Handel erhältlichen DNA-Maxi-Kit (z.B., siehe Tabelle der Materialien). Führen Sie eine Qualitätskontrolle der Plasmid-DNA-Vorbereitung durch die Überprüfung der Integrität und Identität von Plasmid DNA durch Beschränkungsauswahl der eine Aliquote von Plasmid DNA.
      Hinweis: Es gibt Anerkennung Websites für die Einschränkung Endonuklease SmaI innerhalb der ITRs. Enthalten Sie einen SmaI Digest in der Qualitätskontrolle zum Überprüfen der Integrität der ITRs.
   4. Senden Sie die DNA zu einer viralen Vektoren Kern Einrichtung um hochwertige rAAV zu produzieren.
      Hinweis: Hohe Titer, hochwertige virale Preps sind entscheidend für die Vermeidung von Störfaktoren Phänotypen verursacht durch Verunreinigungen in der viralen Prep. Wir empfehlen daher die rAAV Wahl produziert in einer etablierten Vektor-Kern-Anlage sei die AAV-Herstellung im Labor etabliert.
2. Ablation (Funktionsverlust)
   Hinweis: Bakterientoxine oder Toxin Rezeptoren einsetzbar, Zelle Ablation oder neuronale Stummschaltung zu vermitteln. Wir haben pAAV.EF1α.flex.DTA auf ausdrückliche Diphtherie Toxin Fragment A (DBA) in eine Cre-abhängigen Weise erzeugt.
   1. Um Cre-abhängige viralen Vektoren zu generieren, wählen Sie einen Cre-abhängigen Vektor mit einem geeigneten Promotor (z.B., pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP). Verstärken Sie die kodierende Sequenz Wahl (z. B.DTA) durch Polymerase-Kettenreaktion mit Primern, die AscI und NheI oder kompatibel Einschränkung Endonuklease Anerkennung Websites in ihre Überhänge enthalten (siehe Foster Et al. ( ⁷)
   2. Mit standard molekularbiologischen Techniken durchführen Beschränkungsauswahl der Vektor-DNA (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) und von der PCR verstärkt (NheI-DTA-AscI) mit der Beschränkung Endonucleases AscI und NheI einsetzen. Verbinden Sie die gereinigten Fragmente.
   3. Verwandeln die Ligatur Reaktion in geeigneten Bakterien nach dem Protokoll vom Lieferanten der zuständigen Bakterien Wahl gegeben, und die Bakterien auf LB-Platten Teller. Verwenden Sie RecA-defizienten/unterdrückt Stämme, wie MDS42 oder Stbl3, für das Klonen und anschließende Verstärkung von Plasmid DNA.
   4. Am Tag nach der Transformation wählen Sie Klone und impfen sie in LB-Medium ergänzt durch die entsprechenden Antibiotika über Nacht bei 37 ° C. Am nächsten Tag Plasmid DNA Extrahieren von kultivierten Bakterien. Überprüfen Sie erfolgreiche Klonen von Beschränkungsauswahl und der extrahierten Plasmid DNA-Sequenzierung.
   5. Hohen Qualität, bakterielle Plasmid DNA zu verstärken (siehe Punkt 1.1.3). Senden Sie verstärkte DNA an einer viralen Vektoren zentrale Einrichtung für Virus-Produktion.

(2) Transduktion von spinalen Zellen

1. Vorbereitung der Virus-Lösung
   Achtung: Viren sind infektiöse Reagenzien und nach den einschlägigen Richtlinien behandelt werden. In den meisten Fällen können rAAVs auf Biosafety Niveau 1 (BSL1) behandelt werden.
   1. Am Tag der Injektion tauen Sie ein Lager Aliquote des gewünschten gereinigten Virus auf Eis auf und halten sie auf dem Eis bis unmittelbar vor der Injektion. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen, da diese die effektive Titer des Virus verringert.
      Hinweis: Bei Bedarf kann die aufgetaute Virus aliquoten bei 4 ° C bis zu 3 Tage aufbewahrt werden.
   2. Verdünnen Sie die Viruspartikel in steriler 0,9 % NaCl oder Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
      Hinweis: Die entsprechenden Titer hängt die experimentelle Ziele und experimentell bestimmt werden soll. Eine gute virale Gesamtlast ist 3 x 10⁹ Genom Kopien (3.33x10¹² GC/mL, 3 x 300 nL injiziert). Nehmen überschüssige und einige Verluste beim Laden der Kapillare zu berücksichtigen, etwa 2,5 µL des Virus-Lösung für jede Maus benötigt werden.
2. Vorbereitung der Mikropipetten für Intraspinal Injektionen
   1. "Pull" dünnwandige Glaskapillaren (Außendurchmesser 1 mm) auf einer Mikropipette Puller erstelle ich eine ~5.5 mm lang, flach Schaft. Verwenden Sie eine 3,0 mm-Heizung-Filament und Einstellungen des Programms 00 mit P(A) angepasst wie in Tabelle 1.
      Hinweis: Ziehen kann im Voraus erfolgen. Die gezogenen Kapillaren sollten gespeichert werden, in einem geschlossenen Behälter auf Knetmasse um Staub zu vermeiden, die später die Mikropipette verstopfen könnten. Autoklavieren von Mikropipetten ist nicht notwendig.
   2. Clip des Schafts der gezogenen Kapillare mit Laminektomie Zange auf eine Länge von etwa 4,5 bis 5 mm um eine Spitze, die Öffnung mit einem Innendurchmesser von 25-35 μm zu erstellen. Messen Sie unter Verwendung eines Mikroskops mit einem Mikrometer Skala, den Innendurchmesser des mehrere Mikropipetten zu bekommen ein Gefühl dafür wie groß die Öffnung sollte, oder für jeden Mikropipette messen.
      Hinweis: Ein kleiner Tipp zu Verstopfungen führen kann; eine größere Spitze könnte dazu führen, dass Gewebeschäden und Schwierigkeiten, das Rückenmark zu durchdringen.
3. Vorbereitung der OP-Setup und Tools
   1. Stellen Sie sicher, dass das Gerät sauber und einsatzbereit ist. Desinfizieren Sie der Arbeitsbereich durch Abwischen mit 70 % Ethanol zu und Sterilisieren Sie Werkzeuge durch Autoklavieren oder Desinfizieren sie. Lassen Sie Desinfektionsmittel nicht auf den Mikroliter-Spritze, die die viralen Vektoren zu verwendenden Schaden würde.
4. Anästhesie und Vorbereitung des Tieres für die Chirurgie
   Hinweis: Die Gesamtdauer der Operation beträgt 60-90 min..
   1. Wählen Sie 6-bis 10 - Woche alte Mäusen, den chirurgischen Eingriff zu erleichtern.
      Hinweis: Wenn das experimentelle Design erfordert, ist die Injektion von jüngeren oder älteren Tieren möglich. Jede Belastung und beide Geschlechter können grundsätzlich verwendet werden, sondern verwenden die gleichen Hintergrund-Stamm (z.B. C57BL/6J) zum Vergleich von Verhaltensweisen zwischen verschiedenen transgene Mauslinien. Geschlechtsunterschiede sind zu erwarten oder zu untersuchen, zu analysieren, Männchen und Weibchen in getrennten Gruppen.
   2. Anästhesie mit ~ 5 % Isofluran zu induzieren. Legen Sie das Tier in der stereotaktischen Rahmen auf einer Wärme-Matte und pflegen Anästhesie bei 1-2,5 % Isofluran (Luft Durchfluss 900 mL/min). Die Atemfrequenz während der Operation zu überwachen.
   3. Gelten Sie Schmierstoff Augensalbe Hornhaut Trocknen während der Operation zur Vermeidung.
   4. Den Rücken des Tieres zu rasieren und Haare vorsichtig mit nassen Gewebe zu entfernen. Desinfizieren Sie die rasierte Haut mit Jod-Lösung und lassen Sie die Haut trocknen.
   5. Schmerzlindernde Behandlung (z.B.0,1-0,2 mg/kg Buprenorphin subkutan).
5. Belastung der Wirbelsäule auf der Ebene der lumbalen Wirbelsäule
   Hinweis: Aufgrund der differenzierten Entwicklung des Rückenmarks und der Wirbelsäule, die jeweiligen Ebenen nicht ausgerichtet sind, sondern die Lendenwirbelsäule Rückenmark Segment L4 ist auf dem gleichen Niveau wie der Brustwirbel T13.
   1. Suchen Sie die meisten kaudalen Rippe paar durch Abtasten entlang der Wirbelsäule. Mit einem Skalpell, machen Sie einen 1,5-2,5 cm längs schnitt in die Haut nur rostral der meisten kaudalen Rippe paar ab.
   2. Heben Sie die Haut mit einer Pinzette und trennen Sie die darunter liegenden Muskeln mit einer Schere. Während der Operation die exponierten Geweben feucht halten mit steriler 0,9 % NaCl.
   3. Mit feinen Zangen und kleine Schere, einen Einschnitt in die nächste, dünnen häutigen Schicht direkt neben der Mittellinie und von den Dornfortsätzen abgeschnitten. Es ist unabhängig von der zugrunde liegenden Paraspinous Muskel, sondern an den Dornfortsätzen befestigt.
6. Identifikation der Wirbel auf die Lendenwirbelsäule Rückenmark-Ebene
   Hinweis: Sobald die Wirbelsäule ausgesetzt ist, sollte der intertransverse Bänder und dorsal Dornfortsätze sichtbar sein. Mehreren anatomische Landmarken können Hilfe bei der Ermittlung der richtigen Wirbel zum Ziel (Abbildung 1 b).
   1. Ziehen Sie die Haut wieder nach hinten, der Beckenkamm verfügbar zu machen. Auf der gleichen Ebene verbindet die meisten kaudalen paar sichtbar intertransverse Bänder L6-Dornfortsatz. Zählen Sie rückwärts in eine Caudale rostral Richtung des Wirbels von Interesse zu identifizieren.
   2. Palpieren Sie entlang der Wirbelsäule. Die meisten kaudalen Rippe paar befindet sich nur rostral zu T13 Wirbel und Beckenknochen auf Hüfthöhe ist auf der Ebene des Wirbels L6.
   3. Suchen Sie die Stelle wo die Sehne an der Seite der Wirbelsäule weißesten und die mediale ist. T13 Wirbels befindet sich nur rostral. Die Lendenwirbelsäule Rückenmark Segment L4 befindet sich innerhalb dieses Wirbels.
7. Fixierung der Wirbelsäule und Exposition des lumbalen Rückenmarks
   1. Legen Sie das Tier auf einem Luftkissen aufgerollten Gewebe, es an die Wirbelsäulen Klemmen des stereotaktischen Rahmens zu erheben.
   2. Befestigen Sie die Ziel-Wirbel um Bewegungen der Wirbelsäule durch Atmung zu vermeiden. Richten Sie zu diesem Zweck die Klammern neben der Ziel-Wirbel, fixieren Sie eine Klammer und festhalten Sie und die Wirbelsäule mit Adson Pinzette fixieren die zweite Leiste.
      Hinweis: Die Spalte sollte senkrecht zur Ebene Injektion und fest fixiert, so dass es nicht auf Druck von oben bewegt. Bei Bedarf kann ein zweites Paar Schellen an der Wirbelsäule befestigt werden. In diesem Fall ist es sinnvoll, die beiden Paare von Klammern an den beiden Wirbeln angrenzend an die Ziel-Wirbel zu beheben.
   3. Entfernen Sie den Paraspinous Muskel oben die Wirbel von Interesse. Mit einem Skalpell, machen Sie einen parallelen Schnitt nur medial die Sehnen, die parallel zu der Wirbelsäule als auch senkrechte Einschnitte rostral und kaudalen auf dem Ziel-Wirbel. Achten Sie darauf, dass Sie nicht zu tief schneiden. Geschnitten Sie Träne weg/den Muskel mit Rongeurs. Verwenden Sie Zange Bedarf um zu bleiben auf dem Wirbel oder über die Dura in der Bandscheibe Raum Gewebe zu entfernen.
   4. In der Bandscheibe Raum sollte der dorsale Blutgefäß Kennzeichnung der Mittellinie des Rückenmarks sichtbar. Durchführen Sie für einseitige Injektionen eine partielle Laminektomie durch Bohren ein Loch in der Mitte der Zielseite des Wirbels. Verwenden Sie eine feine Zahnheilkunde Apparat mit einem 0,5 mm sphärische Fräser Bohren und Bohren Sie besonders sorgfältig bei der Annäherung an das Rückenmark. Entfernen Sie alle restlichen Knochenfragmente mit einer abgeschrägten 26G-Nadel des Rückenmarks aussetzen.
   5. Mit Hilfe einer 26G abgeschrägte Nadel Perforieren der Dura im Bohrloch, und in den Bandscheiben Raum rostral und kaudalen zu dem Ziel Wirbel, alle etwa 200 µm Lateral, dorsal Blutgefäß. Liquor cerebrospinalis sollte aus den Löchern entkommen und das Rückenmark sollte sich leicht prall gefüllt.
8. Vorbereitung der Injektionsspritze
   Hinweis: Der Injektionsspritze sollte unmittelbar vor Beginn der Injektion vorbereitet werden, um die Gefährdung durch Staubpartikel verstopfen die Mikropipette.
   1. Montieren Sie die Glas-Kapillare auf einem Mikroliter-Spritze mit abnehmbaren Nadel Klemmverschraubung Kit. Befestigen Sie die Mutter fest um einen festen und sicheren Sitz zu gewährleisten.
   2. Füllen Sie Mikroliter Spritze mit sterilem destilliertem Wasser und starten Sie es heraus mit den Kolben drücken.
      Hinweis: Wenn gibt es zu viel Widerstand, so dass das Wasser nicht einfach aus der Spitze kommt, der Mikropipette wahrscheinlich blockiert und ausgetauscht werden.
   3. Montieren Sie die Spritze auf einem Mikromanipulator, verbunden mit einer elektronisch gesteuerten Microinjector. Achten Sie darauf, dass Sie nicht alles mit der Mikropipette berühren.
   4. Verwenden die Microinjector, aufstellen Sie, etwa 1 µL der Luft eine Blase zwischen dem Wasser und den Virus zu erstellen.
   5. Legen Sie ein 2,5 µL Tröpfchen Virenschutzlösung auf ein Stück Folie Paraffin, vorsichtig die Spitze der Mikropipette in das Tröpfchen mit dem stereotaktischen Rahmen bewegen und es auszuarbeiten. Dann sorgfältig Presse verzichten, bis an die Spitze ein wenig Virus-Lösung entsteht.
   6. Ziehen Sie die Spritze und markieren die Mikropipette mit einer Skala mit einem Stift, und beachten Sie die Ebene der Virus-Lösung; Dies erleichtert die Überwachung der ob die Infusion voranschreitet, wie programmiert.
9. Intraspinal Injektionen
   1. Bewegen Sie die Spitze der Mikropipette oberhalb eines der Löcher in die Dura und dann nach unten Sie, bis eine leichte delle in der Dura vermerkt ist. Um die Injektion an der Wirbelsäule Hinterhorn Ziel, nach unten 500 µm in 100 µm aufeinander folgenden Schritten (1 mm/s Geschwindigkeit) und dann 200 µm bis zur mechanischen Stabilisierung des Gewebes ermöglichen.
      Hinweis: Die endgültige Tiefe der Spitze 300 µm in diesem Fall ist, aber kann je nach Zielgebiet angepasst werden.
      1. Wenn das Gewebe eindringen resistent ist, könnte die Mikropipette auf die Dura fangen. In diesem Fall zurückzuziehen Sie, und bewegen Sie etwas nach überlagern das Loch, oder verwenden die Nadel erneut, um die Dura Perforieren ordnungsgemäß vor den Penetration-Versuch zu wiederholen.
   2. Programmieren Sie die Pumpe ein Zielvolumen Injektion von 300 nL bei einer Injektion Geschwindigkeit von 50 nL/min und drücken Sie die Schaltfläche "Start" um die Infusion zu beginnen.
   3. Nach die Injektion abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Waage, um festzustellen, ob das Virus Niveau gesunken ist und lassen die Mikropipette für eine zusätzliche 3 min um den Druck zu equilibrate vor die Spritze langsam zurückziehen lassen.
   4. Wiederholen Sie Schritt 2.9.1.-2.9.3. für die anderen zwei Injektionsstellen.
10. Nähen und Erholung
    1. Entfernen Sie die Wirbelsäulen Klemmen und das Kissen unter der Maus.
    2. Schließen Sie die Wunde schichtweise mit unterbrochenen Stiche, der Haut und den oberflächlichen Gewebeschichten mit resorbierbaren Fäden mit nicht resorbierbaren Fäden vernähen. Jod-Desinfektionsmittel auf die genähten Wunde auftragen.
    3. Kündigen Sie die Narkose zu und verlassen Sie das Tier auf der Wärme-Matte zu, bis es vor seinem Hause Käfig wieder erholt.
11. Postoperative Pflege
    1. Überwachen Sie den Status des Tieres am OP-Tag, am nächsten Tag und dann alle 2-3 Tage. Stellen Sie sicher, dass das Tier hat eine normale Gang, ein gesundes Aussehen (Gewicht, Augen, Fell und Verhalten), und die Wundheilung.
    2. Schmerzlindernde Behandlung fortsetzen (z.B.0,1-0,2 mg/kg Buprenorphin subkutan) wie nötig, drei Mal pro Tag.

3. Verhaltens- und morphologische Analysen

1. Verhaltensanalyse
   Hinweis: Können Sie Tiere, zu der jeweiligen Einrichtung für mindestens 30 min vor Beginn der Messungen an der neuen experimentellen Umgebung anpassen lassen unterzubringen.
   1. Testen von Frey
      1. Setzen Sie Tiere einzeln in einzelne Fächer von etwa 10 cm x 10 cm auf einem Metallgitter-Boden.
      2. Stimulieren Sie die plantare Oberfläche des ipsilateral Hindpaw auf die Injektionsstelle mit einem dynamischen von Frey-Filament. Beachten Sie die Kraft, an der das Tier seine Pfote aus dem Reiz zurückzieht.
      3. Wiederholen Sie fünfmal und berechnen Sie die durchschnittliche Auszahlung Schwelle aus den sechs Messungen für jedes Tier.
   2. PIN-Prick-Test
      1. Setzen Sie Tiere in einzelne Fächer von ca. 10 cm x 10 cm auf einem Metallgitter-Boden.
      2. Die plantare Oberfläche des ipsilateral Hindpaw an der Einstichstelle mit einer abgestumpften 26 G-Nadel ohne Durchdringung der Haut zu stimulieren. Verhalten der Gäste als NULL (keine Reaktion) oder ein (Reaktion).
      3. Wiederholen Sie 9 mal mit Abständen von 3 min zwischen Stimulationen und berechnen Sie Prozentsatz Antwort aus den 10 Messungen für jedes Tier zu.
   3. Injektion von DREADD-Liganden Clozapin-N-oxid (CNO)
      1. Lösen sich CNO in Dimethyl Sulfoxid (DMSO) erstelle ich eine Stammlösung von 0,2 mg/µL, die bei Raumtemperatur gelagert werden kann.
      2. Am Tag des Experiments, verdünnen Stammlösung in steriler 0,9 % NaCl, 0,2 µg/µL und intraperitoneale Injektion von 10 µL/g Körpergewicht. Kontrolltieren mit Fahrzeug zu injizieren (0,2 % DMSO in 0,9 % NaCl).
         Hinweis: Erfahrungsgemäß Peak Auswirkungen auf Verhalten können erwarteten 1-3 h nach der Injektion, und Effekte sollte vollständig nach 24 Stunden nachlassen. Im Falle der Aktivierung der glycinergen Neuronen beobachteten Verhaltensweisen reduzierte Schmerzen und Juckreiz Reaktionen gehören. Verhaltensweisen, hervorgerufen durch DREADD-vermittelte Aktivierung von Neuronen richtet sich nach der gezielten Teilmenge der spinalen Neuronen.
   4. Injektion von Pruritogens induzieren Juckreiz
      1. Auflösen von Pruritogens in 0,9 % NaCl-Lösungen von 8 mg/mL (Chloroquin) oder 10 mg/mL (Histamin). 2 h nach Verabreichung der CNO, injizieren 10 µL des Pruritogen oder Fahrzeug-Lösung in die plantar Oberfläche des ipsilateral Hindpaw an der Wirbelsäule Injektionsstelle subkutan. Alternativ injizieren Sie die Pruritogen mikrodialysemembranen in der Wade, die am Vortag rasiert worden, aversive Verhalten verursacht durch die Rasur selbst reduzieren.
   5. Spontane Nocifensive oder Pruritogen-induzierte Juckreiz Verhaltensweisen zu analysieren Videoaufnahmen
      1. Setzen Sie Tiere einzeln in transparente Fächer (ca. 10 cm Durchmesser) mit ein wenig Einstreu aus ihrer jeweiligen Heimat-Käfig auf dem Boden.
      2. Videoband die Tiere für 5 min zum Datensatz spontan und für 30 min um Pruritogen-induzierte Verhaltensweisen aufzuzeichnen. Analysieren Sie die Videos offline in Behältern von 5 Minuten.
   6. Schmerzen im Vergleich zu jucken Verhaltensweisen
      1. Beobachten Sie und notieren Sie zu zucken, lecken und beißen Verhalten.
         Hinweis: Zu zucken und lecken an der betroffenen Stelle ist als Reaktionen auf Schmerz, während beißen mit Juckreiz verbunden.
      2. Analysieren Sie Videos mit normaler Geschwindigkeit zu, Messen Sie die Zeit, dass die Maus verbrachte lecken oder beißen die betroffenen Stelle oder in Zeitlupe eine genauere Unterscheidung zwischen lecken und beißen Reflexe zu messen. Alternativ die Anzahl der Anfälle lecken/beißen/zucken.
2. Morphologische Analyse
   1. Morphologische Analysen von eins bis drei Wochen nach der Injektion des Virus oder am Ende eines behavioral Experiments.
      Hinweis: Wir haben erkannt eGFP Ausdruck bald 48 h nach der Injektion, aber auch festgestellt, dass Ausdruck innerhalb der nächsten Tage und sogar Wochen erhöht. Für Zellen mit starken Reporter Ausdruck kann eine Woche Inkubationszeit (von intraspinal Versenkung bis Perfusion) ausreichen. Für Zellen mit schwachen Transgene Ausdruck, Viren mit schwachen Promotoren oder schwächeren Fluorophore, eventuell ein längerer Ausdruck nachweisbare Konzentrationen zu gewährleisten.
   2. Gewebe-Fixierung
      1. Durchspülen Sie jede Maus Transcardially, zunächst mit 20 ml eiskaltes künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS)-Lösung (NaCl-125 mM, Nahco3₃ 25 mM, NaH₂PO₄ 1,25 mM, D-Glukose 20 mM KCl 2,5 mM und CaCl2 2 mM MgSO4 1 mM), dann mit 100 mL von 4 % eiskaltem Paraformaldehyd (in 0,1 M Natriumphosphat Puffer, pH-Wert 7,4).
         Achtung: Paraformaldehyd ist giftig und muss mit Vorsicht behandelt werden.
      2. Sofort sezieren Sie die Lendenwirbelsäule Rückenmark, und nach dem beheben Sie des Gewebes für 2 h mit 4 % Paraformaldehyd auf Eis. Das Post-fixierte Gewebe mit 0,1 M-Natrium-Phosphat-Puffer (pH 7,4) kurz waschen und dann es in 25 % Saccharoselösung (in 0,1 M Natriumphosphat Puffer, pH-Wert 7,4) über Nacht bei 4 ° c inkubieren
      3. Das Cryoprotected Gewebe an 30 μm auf einem Kryostat geschnitten und die Abschnitte auf Objektträger zu montieren.
   3. Immunfluoreszenz-Färbung
      1. Nach kurzen Waschgängen mit PBS-Puffer gelten 300 μl Lösung zu blockieren (10 % normale Esel Serum in 0,3 % Triton-PBS) auf den Abschnitten für 1 h bei Raumtemperatur.
      2. Inkubieren Sie die Folien mit 300 μL der jeweiligen Kombinationen von primären Antikörper blockieren Lösung (siehe Tabelle der Materialien) über Nacht bei 4 ° C. Waschen Sie in den Abschnitten 3 Mal für 5 min in PBS.
      3. Inkubieren Sie die Folien mit den jeweiligen Kombinationen von sekundären Antikörper blockiert Lösung für 1 h bei Raumtemperatur. Waschen Sie in den Abschnitten 3 Mal für 5 min in PBS.
      4. Kurz spülen Sie die Folien in DdH₂O, dann montieren Sie die Verwendung von fluoreszierenden Eindeckmedium Deckgläsern.
      5. Erwerben Sie fluoreszierende Bilder mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 20 X und einem 40 X Objektiv ausgestattet.

Ergebnisse

Um den Ausdruck-Ebenen zu verdeutlichen, die durch die intraspinal Injektion von rAAV Codierung ein Marker Protein gewonnen werden kann, injiziert wir zuerst AAV1. CAG.eGFP in der Lendenwirbelsäule Rückenmark von Wildtyp Mäusen. Drei Injektionen im Abstand von ca. 1 mm auseinander produziert eine nahezu permanente Infektion der lumbalen Wirbelsäule Segmente L3, L5 (Abb. 1A-C). Virus-Injektion in einer Tiefe von 300 µm von der Wirbelsäul...

Diskussion

Intraspinal Injektion von Flugabwehrpanzer kann eine leistungsfähige Technik in einem Forschungslabor ermöglicht die Analyse der Wirbelsäule Zellen mit einer hohen zeitlichen und räumlichen Lösung geworden. Dieses Protokoll ermöglicht die Signalweiterleitung der drei wichtigsten wirbelsäulensegmente sensorischen Neuronen erweitern ihre peripheren Axone, die Megalosauridae innerviert. Transducing drei Segmente produziert robuste und reproduzierbare Verhaltensdaten. Es ermöglicht auch ein größerer sensorischen Be...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller	Zeitz	NA
anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator	Weinmann	NA
anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer	Midmark	NA
Heat mat: Mio Star Thermocare 100	Migros	717614700000
Electric shaver	Philips	BT9290
surgical microscope (OPMI pico)	Zeiss	NA
Small animal stereotaxic apparatus	Kopf	NA
Neurostar StereoDrive (optional)	Neurostar	NA
Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor	Harvard Apparatus	72-4811
PHD Ultra syringe pump with nanomite	Harvard Apparatus	70-3601
Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe	Hamilton	7635-01
Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm	Hamilton	55750-01
fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40	Osada	OS-40
spherical cutter, 0.5mm	Busch	12001005B
electronic von Frey anesthesiometer	IITC	23905
flexible von Frey hairs	IITC	#7
LSM710 Pascal confocal microscope	Zeiss	NA
0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective	Zeiss	NA
1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective	Zeiss	NA
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Tools
Scalpel Handle #4, 13cm	Fine Science Tools	10004-13
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm	Fine Science Tools	11027-12
Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup	Fine Science Tools	16121-14
Dumont #2 laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20
Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length	Fine Science Tools	12002-12
Fine forceps #5	Fine Science Tools	11254-20
Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and Chemicals
Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter	World Precision Instruments	TW 100-3
Syringes (1, 5 and 20 ml)	B. Braun	(9166917V, 4606051V, 4606205V)
26G beveled needle	B. Braun	4665457
Sterile scalpel blades	B. Braun	BB523
Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable	B. Braun	C1046220
Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable	B. Braun	C0932191
Sterile PBS or saline (0.9%)		NA
Ethanol, 70% (disinfectant)		NA
Iodine solution (e.g. Braunol)	B. Braun	18380
Anaesthetics  (e.g. Attane isoflurane)	Provet	2222
Aldasorber	Provet	333526
analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic)	Indivior	GTIN: 7680419310018
Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos)	Pharma medica	GTIN: 4031626710635
Cotton swabs (e.g. from)	IVF Hartmann	1628100
Facial tissues (e.g. from)	Uehlinger AG	2015.10018
Superfrost plus microscope slides	ThermoScientific	J1800AMNZ
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
C57BL/6J mice  (wildtype)	The Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:000664
Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre)	The Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:023526
Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom)	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:007914
Name	Company	Catalog Number	Comments
Viral vectors
AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP)	Penn Vector Core	AV-1-PV1963
AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP)	Penn Vector Core	AV-1-ALL854
AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato)	Penn Vector Core	AV-1-ALL864
AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA)	Penn Vector Core	Custom production
AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi))	Penn Vector Core	Custom production
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry	Addgene	44361
pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP	Addgene	20298
Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacteria
MDS42	ScarabGenomics
Stbl3	ThermoScientific	C737303
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Quiagen	12362
NucleoBond PC 500	Machery & Nagel	740574
clozapine-N-oxide (CNO)	Enzo Life Sciences	BBL-NS105-0025
chloroquine diphosphate salt	Sigma	C6628
histamine	Sigma	H7125
Dapi	Invitrogen	D3571
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies (dilution)
Rabbit anti-GFP (1:1000)	Molecular Probes	RRID:AB_221570
Rabbit anti-NeuN (1:3000)	Abcam	RRID:AB_10711153
Goat anti-Pax2 (1 : 200)	R & D Systems	RRID:AB_10889828
Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000)	Dr Carmen Birchmeier	Muller et al. 2002
Rabbit anti-GFAP (1 : 1000)	DakoCytomation	RRID:AB_10013382
Secondary antibodies raised in donkey (1:800)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	NA