Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، فإننا نقدم متجانسة وقت حل الحنق (هترف) كطريقة فعالة للكشف السريع عن الأنسولين يفرز من الخلايا.

Abstract

الكشف عن إفراز الأنسولين ضروري لتوضيح آليات إفراز الخاضعة للتنظيم، وكذلك كما هو الحال في دراسات الأيض. على الرغم من أن العديد من فحوصات الأنسولين كانت موجودة منذ عقود، مبسطة الأخيرة ظهور التكنولوجيا فورستر الرنين الطاقة نقل (هترف) حل الوقت متجانسة إلى حد كبير هذه القياسات. وهذا هو مقايسة ضوئية السريعة والفعالة من حيث التكلفة واستنساخه وقوية تعتمد على الأجسام المضادة مترافق ل fluorophores مشرق مع الانبعاثات طويلة الأمد التي يسهل حلها وقت "فورستر الرنين الطاقة نقل". وعلاوة على ذلك، اكتشاف الأنسولين هترف قابلة لتطوير فحوصات الفرز الفائق. هنا نستخدم هترف للكشف عن إفراز الأنسولين في الخلايا الإضافية-1E، خط خلية المستمدة من insulinoma الفئران. وهذا يسمح لنا تقدير المستويات القاعدية للأنسولين، وهذه التغييرات استجابة للتحفيز الجلوكوز. وبالإضافة إلى ذلك، نحن نستخدم هذا النظام اكتشاف الأنسولين لتأكيد دور الدوبامين كمنظم سلبية لإفراز الأنسولين الجلوكوز-وحفز (نظام خدمات التأمين الحكومية). بطريقة مماثلة أخرى الدوبامين د2-مثل يضع مستقبلات وكوينبيرولي وبروموكريبتين، خفض نظام خدمات التأمين الحكومية بطريقة تعتمد على التركيز. نتائجنا إبراز فائدة تنسيق المقايسة الأنسولين هترف في تحديد دور المخدرات عديدة في نظام خدمات التأمين الحكومية وملفاتهم الدوائي.

Introduction

وقد جرى ضبطه تنظيم استقلاب الطاقة بهرمون الابتنائية رئيسية، الأنسولين. الأنسولين هو توليف وصدر عن خلايا البنكرياس بيتا ردا على مستويات الغلوكوز خارج الخلية زيادة. مشغلات الأنسولين المفرج عنهم امتصاص الجلوكوز من الأنسجة حساسة للأنسولين1،2. الناحية الفسيولوجية، وهذا يرتبط بارتفاع تركيز الجلوكوز بعد تناول وجبة، متبوعاً بإفراز الأنسولين لتنظيم امتصاص الجلوكوز. اضطرابات في التوازن الجلوكوز تؤدي إلى الاعتلالات الأيضية التي توجت بمقاومة الأنسولين، وفي نهاية المطاف في بداية نوع 2 مرض السكري2،،من34.

على الرغم من إفراز الأنسولين وقد درست على نطاق واسع، وآلياتها التنظيمية تظل غير مفهومة. وكان مجالاً حيويا للتحقيق تحديد رواية المغيرون من إفراز الأنسولين من خلايا بيتا5،6،،من78. وتتطلب هذه الدراسات إلى فهم أفضل للعلاقة اقتران بين تنشيط الجلوكوز وإفراز الأنسولين. ولذلك كان من الضروري القدرة على دقة رصد وقياس مستويات إفراز الأنسولين الجلوكوز-وحفز (نظام خدمات التأمين الحكومية). حتى الآن، ومع ذلك، سوى عدد محدود من الأساليب متاحة للسماح للتحديد الكمي لنظام خدمات التأمين الحكومية باستخدام خطوط الخلايا إفراز الأنسولين و/أو جزيرات البنكرياس. واحد هو radioimmunoassay (ريا)، الذي يستخدم الأنسولين معلم النظائر المشعة والأجسام المضادة. وتشمل أوجه القصور الرئيسية في هذا النهج قضايا السلامة بسبب معالجة والتخلص من المواد المشعة. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب ذات العمالة الكثيفة، التي تشمل الغسيل الطويل وحضانة خطوات متعددة. المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA) هو نهج آخر مكلف وكثيفة العمالة التي تستخدم الأجسام المضادة لاكتشاف الأنسولين. التباين في الانتماءات جسم وكفاءة الاعتراف بالانسولين تعمل على الحد من العوامل لهذا الأسلوب، ويمكن أن تؤثر على إمكانية تكرار نتائج نتائج. أليسا ولا ريا صمم لتجارب الفائق. الفاسكرين مقايسة متجانسة المستخدمة لكشف وقياس مستويات إفراز الأنسولين. وتستند التكنولوجيا الفاسكرين تحويل الأكسجين المحيطة إلى دولة القميص الأوكسجين السعادة التي يمكن أن تتفاعل مع الأنواع تشيميلومينيسسينت، أدى إلى توليد تشيميلومينيسسينسي. نظراً للفحص متجانسة، تم القضاء على العديد من الخطوات الغسيل المرتبطة ريا وإليزا. عدم استقرار إشارة نظراً لطبيعة رد الفعل غير عاملاً يحد من التي قد تؤثر قراءات المقايسة. (TR-الكماشة، وضعته هييدوك والزملاء9، نهج متجانس آخر لقياس الأنسولين استناداً إلى ربط اثنين أضداد منفصل لمختلفة [ابيتوبس] في جزيء الأنسولين. الأضداد: هي كل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل مرتبطة كيميائيا لمزدوجة مع قصيرة متكاملة واحدة الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي يتدلى. يجمع لهم ملزمة من الأجسام المضادة للأنسولين ويؤدي إلى مزدوجة الاتجاه الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل. كل جسم مضاد يرتبط أيضا مع fluorophore المانحة أو يقبلون كل منهما، ورابطة الحمض النووي مزدوج يجمع بين هذه فلوروفوريس لتوليد فورستر الرنين نقل الطاقة (الحنق). ومع ذلك، واحد الحد المحتملة من TR-الكماشة، تقع على عاتق الحنق نفسه. قد يؤدي عدم القدرة على سرعة تبديد fluorescence الخلفية أثناء عملية التفاعل الحنق إلى مستويات عالية نسبيا من الأسفار الخلفية وإشارة منخفضة إلى نسبة الضوضاء داخل المقايسة. ولذلك، لا يزال موجوداً حاجة مقايسة موثوق بها وقوية وفعالة من حيث التكلفة للتحديد الكمي لنظام خدمات التأمين الحكومية بطريقة الفائق.

توجت التقدم الذي أحرز مؤخرا في الفيزياء الحيوية في تطوير متجانسة الأسفار وقت حل الطاقة الرنين نقل (هترف) على أساس المقايسة. على وجه التحديد، بينما نقل الطاقة داخل الإنزيم قد يمكن وصفها بأنها المستندة إلى الحنق، أكثر دقة، هترف يعتمد على التﻷلؤ الطاقة الرنين نقل (بعيد)10 الذي هو غير الإشعاعي نقل الطاقة بين المانحين ويقبلون الأنواع11،،من1213. هذا التمييز مهم، منذ توقيت الأسفار أو تبريد استناداً إلى الحنق التفاعل يختلف كثيرا مما عليه للانتقال، على الرغم من أن يمكن استخدام نفس أنواع النابضة للحنق والانتقال. وعلاوة على ذلك، استخدام التراب النادر لانثانيدات كريبتاتي المركبات مثل اليوروبيوم أو كريبتاتي تيربيوم في هترف تنتج fluorescence طويلة نصف عمر12،14. وهذا يوفر ميزة فريدة من نوعها للأخذ بتأخير زمني (µsec) بين المانحين الإثارة، وقياس الانبعاثات من يقبلون (أي حل وقت الفحص). يسمح هذا التأخير الزمني لوقت كاف للأسفار الخلفية لتبديد قبل قياس يقبلون الانبعاثات الأسفار. ونتيجة لذلك، هو قراءات مجاناً من الأسفار غير محددة، وهكذا، هو تحقيق نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، طبيعة متجانسة هترف يلغي الحاجة للغسيل الخطوات يغسل الأنواع غير منضم، مما يجعل المقايسة الكثير أكثر سرعة من أليسا أو الأساليب المستندة إلى ريا.

figure-introduction-4732
رقم 1: التخطيطي لآلية لاكتشاف الأنسولين هترف- الأجسام المضادة التي تم إنشاؤها بشكل مستقل اثنين تعترف على وجه التحديد، وربط للأنسولين في مواقع منفصلة. يتم مترافق هذه الأجسام المضادة إلى الجهة المانحة كريبتاتي يوروبيوم أو يقبلون XL665. الإثارة للجهات المانحة في نتائج نانومتر 337 في الانبعاثات في 620 نانومتر. نقل الطاقة الناتجة عن أسباب XL665 تنبعث منها في طول موجي أطول، 665 شمال البحر الأبيض المتوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لاستخدام نهج القائم على هترف لتحديد مستويات نظام خدمات التأمين الحكومية من الخلايا الإضافية-1E، راسخة الأنسولين إفراز المستمدة من خلية بيتا الفئران insulinoma الخلية خط15. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا التحليل لتحديد التشكيل الجانبي الدوائي من المنظمين الجزيئية لإفراز الأنسولين. نقوم بتطبيق هذا التحليل الأنسولين المستندة إلى هترف لدراسة الدوبامين د2-مثل تنظيم مستقبلات نظام خدمات التأمين الحكومية. وأظهرت الدراسات زيادة أن الدوبامين العصبي منظم هام لنظام خدمات التأمين الحكومية8،،من1617،،من1819،20، 21 , 22-الدوبامين يؤثر على نظام خدمات التأمين الحكومية بطريقة أوتوكريني/باراكريني سلبية عبر إجراءات على الدوبامين د2-مثل مستقبلات (د2، د3، د4 مستقبلات) أعربت في سطح خلايا البنكرياس بيتا8 , 16 , 19-استخدام هذا الفحص، تأكيد دور الدوبامين في كمنظم سلبية لنظام خدمات التأمين الحكومية، وإثبات أن الدوبامين د2-مثل مستقبلات يضع بروموكريبتين وكوينبيرولي أيضا الحد من نظام خدمات التأمين الحكومية.

Protocol

1-الوظائف-1E الخلايا: صيانة وطلاء

  1. الحفاظ على وظائف-1E الخلايا في هوميديفيد 37 ˚C/5% CO2 حاضنة ومثقف مع المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع 5% (v/v) إبطال الحرارة الجنين البقري المصل، مم 2 لتر-الجلوتامين، 10 مم حبيس، بيروفات صوديوم 1 مم، 100 يو/مليلتر البنسلين/ستربتوميسين الحل, 50 ميكرومتر β-ميركابتوثانول. ثقافة الخلايا في المتوسط RPMI 1640 كاملة 10 مل (لكل لوحة)، حتى تصل إلى التقاء 80-90%، وعندما يمكن أن تريبسينيزيد وباساجيد أو المستخدمة لفحص إفراز الأنسولين.
  2. يوم 1: نضح وسائط الإعلام ويغسل خلايا مرة واحدة مع 5 مل من برنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً. إضافة 0.5 مل التربسين (0.025%) المخفف 1:1 في 0.5 مل برنامج تلفزيوني تريبسينيزي الخلايا واحتضان لمدة 3-4 دقائق في 37 ˚C. قم بإلغاء تنشيط التربسين بإضافة 9 مل كامل وسائل الإعلام ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل من بيبيتينج.
  3. بيليه الخلايا بالطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه الخلية في حوالي 5 مل وسائط جديدة.
  4. تأخذ 10 ميليلتر من الخلايا إعادة تعليق وتخلط مع 10 ميليلتر تريبان الأزرق صبغ الحيوية للتحقق من صلاحية الخلية. عد الخلايا الحية والميتة في 10 ميليلتر من هذا الخليط باستخدام هيموسيتوميتير. ينبغي أن يكون مستوى صلاحية أكثر من 90 في المائة. تمييع الخلايا إعادة معلقة في وسائط جديدة للخلايا 1 مليون كل مل.
  5. قبل المغلفة بذور الخلايا الإضافية-1E 0.5 مل كل بئر في بولي-L-يسين لوحة 24-جيدا، وفي كثافة الخلايا 500,000/جيدا.
  6. يوم 2: قم بإزالة الوسائط ح 18-24 بعد الطلاء وإضافة 500 ميليلتر/بئر جديدة RPMI 1640 الوسائط. احتضان الخلايا لآخر 24 ساعة للسماح للخلايا التعافي تماما من الخطوة السابقة باساجينج. ويسمح هذا الوقت الإضافي الخلايا إلى نشر على لوحة زراعة الأنسجة.

2-الأنسولين إفراز الإنزيم (اليوم الثالث)

  1. إعداد المخزن المؤقت كربوفانتسي: مم 132.2 كلوريد الصوديوم، 3.6 ملم بوكل، 5 مم ناكو3، 0.5 مم نة2بو40.5 مم مجكل2، كاكل 1.5 مم2والبومين المصل البقري 0.001 غ/مل (BSA)، الرقم الهيدروجيني 7.4.
  2. نضح وسائل الإعلام من الخلايا ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً.
  3. الخطوة المجاعة الجلوكوز، إضافة 450 ميليلتر/بئر كربوفانتسي (التي تحتوي على جيش صرب البوسنة) دون الجلوكوز ح 1 في 37 ˚C/5% CO2.
  4. أثناء الخطوة المجاعة الجلوكوز، يعد تخفيف المسلسل من drug(s) في كربوفانتسي التي تحتوي على 200 ملم الجلوكوز (تركيز 10 x).
    1. تعد المخدرات في 10 × التركيز النهائي في كربوفانتسي تستكمل مع الجلوكوز 200 ملم (أيضا 10 × تركيز الجلوكوز الفحص النهائي). إذا كان المخزون المخدرات (بالإضافة إلى 10 وأضاف x الجلوكوز) هو في [دمس]، تأكد من يتم الاحتفاظ بنسبة مئوية [دمس] متسقة في جميع أنحاء المقايسة (النسبة المئوية النهائية من الناحية المثالية لأقل من 0.1% [دمس]).
    2. لعلاجات الدوبامين وكوينبيرولي، استخدام المخدرات مقايسة الختامية تركيز يتراوح من 100 ميكرومتر إلى 100 م (من أعلى إلى أدنى تركيز)، مع النقطة الأخيرة استجابة الجرعة التي تحتوي على أي دواء. بروموكريبتين، استخدم تركيز تحليل نهائي يتراوح بين 10 ميكرون إلى 10:00 م، مع النقطة الأخيرة استجابة الجرعة يجري التحكم خالية من المخدرات.
  5. بعد الجلوكوز المجاعة، إضافة تخفيف المسلسل المخدرات للمقايسة لإنتاج استجابة جرعة.
  6. إضافة 50 ميليلتر/جيدا من كل تمييع المسلسل إلى الآبار المقابلة (مقايسة إجمالي حجم 500 ميليلتر).
  7. الخطوة الجلوكوز التحفيز، احتضان الخلايا مع تخفيف المخدرات كل منها مسلسل (حضور الجلوكوز 20 ملم) لمدة 90 دقيقة في ˚C/5% 37 شركة2- وتشمل مجموعة من الآبار التحكم: (1) تحفيز مع الجلوكوز 20 مم وحدها في الغياب أي المخدرات الإضافية و (2) الخلايا التي لا تحفز بالمخدرات لا الجلوكوز (الذي يوفر معدل إفراز القاعدية).
  8. بعد هذه الخطوة التحفيز، بعناية إزالة سوبيرناتانتس (استخدام مباشرة أو مخزن في 4 ˚C).
    ملاحظة: خطوة الطرد المركزي لطيف 5 دقائق إضافية (600 x ز، 1 دقيقة) يمكن إدخال في هذه المرحلة لإزالة أي الخلايا المتبقية في supernatants المقايسة.

3-هترف لإفراز الأنسولين التدبير

  1. تمييع الإنزيم supernatants 01:10 في كربوفانتسي (بدون جيش صرب البوسنة)، يفضل أن يكون ذلك في لوحات واضحة 96-جيدا.
  2. إعداد المنحنى المعياري الأنسولين للمقايسة الأنسولين هترف (الجدول 1).
حل الأسهم القياسية 500 نانوغرام/مليلترتخفيف المسلسلتعمل [الأنسولين] نانوغرام/مليلتر
الأمراض المنقولة جنسياً 730 ميليلتر الأسهم + 140 ميليلتر كربوفانتسي150
الأمراض المنقولة جنسياً 630 ميليلتر STD 7 + 45 كربوفانتسي ميليلتر60
الأمراض المنقولة جنسياً 530 ميليلتر STD 6 + 45 كربوفانتسي ميليلتر24
الأمراض المنقولة جنسياً 430 ميليلتر STD 5 + 45 كربوفانتسي ميليلتر9.6
الأمراض المنقولة جنسياً 330 ميليلتر STD 4 + 45 كربوفانتسي ميليلتر3.84
الأمراض المنقولة جنسياً 230 ميليلتر STD 3 + 45 كربوفانتسي ميليلتر1.54
الأمراض المنقولة جنسياً 130 ميليلتر الأمراض المنقولة جنسياً 2 + 45 كربوفانتسي ميليلتر0.61
الأمراض المنقولة جنسياً 0كربوفانتسي ميليلتر 450
ملاحظة: تقييم الأمراض المنقولة جنسياً 500 نانوغرام/مليلتر

الجدول 1. مسلسل تخفيف جعل المنحنى القياسي الأنسولين.

  1. إضافة العينات المنحنى المعياري و supernatants المقايسة المخفف للوحة هترف. يمكن القيام بقياس الأنسولين يفرز من هترف في 96-بئر أو شكل لوحة 384، حسنا، مع الأخذ في الاعتبار حجم مقايسة لديه إعادة ضبط. استخدام 10 ميليلتر/بئر عينة في أبيض 96-بئر النصف-منطقة لوحات أو 5 ميليلتر/بئر في لوحة صغيرة الحجم، مستديرة القاع أبيض 384-جيدا (انظر الجدول للمواد).
  2. إعداد مزيج الأجسام المضادة في الكشف عن المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد) في إحدى الجهات مانحة 1:2 (كريبتاتي)/نسبة يقبلون (XL-665).
    ملاحظة: كذلك تفاصيل محددة حول الإنزيم هترف المتوفرة من الشركة المصنعة.
  3. إضافة مزيج الأجسام المضادة للانزيم في 30 ميليلتر/جيدا (على شكل 96 جيدا--لوحة فحص) أو 15 ميليلتر/جيدا (لتنسيق مقايسة لوحة 384-جيدا).
  4. ختم اللوحة واحتضان في درجة حرارة الغرفة.
  5. قراءة لوحة بعد ح 2، ح 4، و/أو الحضانة بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة باستخدام قارئ لوحة ووحدة الألياف البصرية هترف المناسبة (337 665 620 شمال البحر الأبيض المتوسط) (انظر الجدول للمواد وإرشادات الشركة المصنعة). تعيين بدء التكامل في المايكروثانيه 60 والوقت التكامل في المايكروثانيه 400-200 استخدام ومضات كل بئر.
    ملاحظة: تستند هذه المعلمات إلى استخدام قارئ معين. قراءات في 620 نانومتر و 665 شمال البحر الأبيض المتوسط قد تختلف بين مختلف الصكوك. وهذا أحد الأسباب التي نقترح استخدام نسبة 665/620. في حساب هذه النسبة، أي الاختلافات المحتملة من قارئ إلى قارئ سوف يكون تطبيع وتوفير قيم متسقة بغض النظر عن الوسيلة المستخدمة لقياس هترف.

4-بيانات التحليل والتطبيع

  1. حساب تركيزات الأنسولين من الآبار بالانزيم عن طريق استقراء راتيوميتريك قراءات الأسفار (665 nm nm/620) إلى ثانية ترتيب متعدد الحدود منحنى (الشكل 2).

figure-protocol-7265
الشكل 2 : المنحنى المعياري الأنسولين. مخزون الأنسولين البشري من تركيزات معروفة استخدمت لإنشاء المنحنى المعياري الأنسولين. نسب هترف الناتجة (665 نانومتر/620 نانومتر) وقد تآمروا ضد الأنسولين تركيزات. البيانات أفضل احتواء على منحنى ترتيب متعدد الحدود التربيعية ثانية (ص2 = 0.99996). وهذا منحنى قياسي ممثل. أشرطة الخطأ = sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

  1. مع البيانات المستنتجة نانوغرام/مل للأنسولين ويفرز، وتطبيع (الأنسولين يفرز استجابة لتزايد تركيزات يجند) إلى متوسط قيمة % الأنسولين أقصى إفراز الإنزيم الآبار (شرط وحدها الجلوكوز من عيار 20 ملم).
  2. استخدام ملائمة منحنى (ص2) من تجربة واحدة لحساب التباين الصفائحية. داخل التجربة، تستمد القيم الفردية2 R التكرارات داخل التجريبية، يسمح حساب الخطأ المعياري للوسط للمنحنى تناسب.
  3. لتحديد الاختلاف إينتيربلاتي، استخدام البيانات من ثلاثة على الأقل من التجارب الفردية لحساب الخطأ المعياري للوسط بقيمة2 R المنحنى الجماعية.

النتائج

علينا التحقق من صحة لدينا الإنزيم هترف الأنسولين عن طريق توليد منحنى المعياري الأنسولين استخدام معايير تنقية الأنسولين البشري من التركيزات المحددة مسبقاً (الشكل 2). جيل من المنحنى القياسي يسمح لنا باستقراء القراءات الأسفار راتيوميتريك، ومن ثم تحديد مست?...

Discussion

تحليل الأنسولين هترف الموصوفة هنا يوفر نظام سريع وفعال لقياس إفراز الأنسولين من نظام قائم على الخلايا المزروعة. من بين أهم مزاياها، يوفر هذا التحليل إشارة خلفية منخفضة بسبب ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضجيج. بالإضافة إلى ذلك، ونحن قد أكدت أن إشارة هترف مستقرة لفترات طويلة من الزمن (> ح 24)

Disclosures

ونحن نشكر بيار نيكولا (المقايسة سيسبيو) للحصول على مشورة مفيدة والدكتور بيير ماكلير (جامعة جنيف) لسخاء تقديم الخلايا الإضافية-1E. تم دعم هذا العمل بتمويل من وزارة الدفاع (منحة PR141292 إلى Z.F.)، جون ف. وألف-نانسي اميرلينج الصندوق في مؤسسة بيتسبرغ (إلى Z.F.).

Acknowledgements

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well white half area plateGreiner Bio-One82050-042
384-well white low-volume, round-bottom plateCorning15100157
Insulin High Range KitCisbio Bioassays62IN1PEH 10,000 test HTRF-based insulin assay kit
PHERAstar FSX plate readerBMG LabtechFSXPlate reader adapted for HTRF-based assay readings
Plate sealersFisher ScientificDY992To seal plate while antibodies incubate
HemocytometerHausser Scientific3100
RPMI Medium 1640 (1x)Gibco 11875-093[+] L-glutamine
Trypsin 0.05% Corning25-052-CI0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline)Corning21-031-CVWithout calcium and magnesium
Fetal Bovine SerumCorning35-010-CV
HEPESGibco 156-30-080
Sodium pyruvateGibco 11360070
Penicillin/Streptomycin solution 100xCorning30-002 CT
2-mercaptoethanolSigmaM1348
Trypan Blue Stain (0.4%)Gibco 15250-061
Dopamine hydrochlorideSigma8502
Bromocriptine mesylateTocris427
(-)-Quinpirole hydrochlorideTocris1061
Bovine Serum AlbuminCalbiochem12659
Poly-L-LysineSigmaP4832
GlucoseSigmaG7021
DMSO (Dimethyl sulfoxide)Sigma276855

References

  1. Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).
  2. Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes. Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).
  3. Despres, J. P., Lemieux, I. Abdominal obesity and metabolic syndrome. Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).
  4. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
  5. Barg, S. Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells. Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).
  6. Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. Autocrine regulation of insulin secretion. Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).
  7. Farino, Z. J., et al. Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence. PLoS One. 11 (2), e0148684 (2016).
  8. Simpson, N., et al. Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro. Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).
  9. Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets. Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).
  10. Heyduk, T. Measuring protein conformational changes by FRET/LRET. Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).
  11. Degorce, F. HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening. Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).
  12. Degorce, F., et al. HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications. Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).
  13. Mathis, G. HTRF(R) Technology. J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).
  14. Daijo, J. E., Sportsman, J. R. A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma. J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).
  15. Merglen, A., et al. Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells. Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).
  16. Ustione, A., Piston, D. W. Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations. Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).
  17. Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).
  18. Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet. Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).
  19. Rubi, B., et al. Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion. J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).
  20. Garcia-Tornadu, I., et al. Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance. Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).
  21. Garcia-Tornadu, I., et al. New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse. Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).
  22. Lopez Vicchi, F., et al. Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis. Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).
  23. Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes. Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).
  24. Mahajan, R. Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes. Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).
  25. Caicedo, A. Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye. Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).
  26. Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications. Trends Endocrinol Metab. , (2014).
  27. Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia. Front Neurosci. 11, 432 (2017).
  28. de Leeuw van Weenen, E. J., et al. The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells. Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

135

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved