Homogene Zeitaufgelösten Förster Resonanz Energie Transfer-basierten Test zur Erkennung von Insulin-Sekretion

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir homogene Zeitaufgelöste FRET (HTRF) als effiziente Methode zum Schnellnachweis von Insulin aus den Zellen abgesondert.

Zusammenfassung

Die Erkennung der Insulin-Sekretion ist entscheidend für erhellendes Mechanismen der regulierten Sekretion sowie wie in Studien des Stoffwechsels. Obwohl zahlreiche Insulin-Assays für Dekaden bestanden haben, hat die jüngsten Aufkommen der homogenen Zeitaufgelösten Förster Resonance Energy Transfer (HTRF) Technologie diese Messungen deutlich vereinfacht. Dies ist eine schnelle, kostengünstige, reproduzierbare und robuste optische Assay abhängig, Antikörper konjugiert, helle Fluorophore mit lang anhaltende Emission, die Zeitaufgelöste Förster Resonance Energy Transfer erleichtert. Darüber hinaus ist HTRF Insulin Erkennung für die Entwicklung von Hochdurchsatz-Screening-Assays. Hier verwenden wir HTRF, um Insulin-Sekretion in INS-1E Zellen, eine Ratte Insulinom abgeleitet Zell-Linie zu erkennen. Dies ermöglicht es uns, basalen Ebenen von Insulin und deren Veränderungen in Reaktion auf die Stimulation der Glukose zu schätzen. Darüber hinaus verwenden wir diese Insulin-Detection-System, um die Rolle von Dopamin als negativer Regulator der Glukose-stimulierten Insulinsekretion (GSIS) zu bestätigen. In ähnlicher Weise, anderen Dopamin D₂-wie-Rezeptor-Agonisten, Quinpirole und Bromocriptin, GSIS Konzentration abhängig zu senken. Unsere Ergebnisse zeigen das Dienstprogramm des Formates HTRF Insulin-Test bei der Bestimmung der Rolle von zahlreichen Medikamenten im GSIS und ihre pharmakologische Profile.

Einleitung

Die Verordnung des Energiestoffwechsels ist durch ein großen anabole Hormon Insulin verfeinert. Insulin ist synthetisiert und von pankreatischen Betazellen in Reaktion auf erhöhte extrazelluläre Blutzuckerwerte veröffentlicht. Das freigesetzte Insulin löst die Aufnahme von Glukose durch Insulin-empfindlichen Gewebe^1,2. Physiologisch ist dies auf die Höhe der Glukosekonzentration nach einer Mahlzeit, gefolgt von Sekretion von Insulin, Glukoseaufnahme Regeln verbunden. Störungen in Glukose Homöostase zu metabolische Beeinträchtigungen bis hin zu Insulinresistenz führen und letztlich bei der Entstehung von Typ-2 Diabetes^2,3,4.

Obwohl die Insulinsekretion ausgiebig untersucht wurde, bleiben seine Regulationsmechanismen schlecht verstanden. Ein kritischer Bereich Untersuchung wurde Identifikation von neuartigen Modulatoren der Insulin-Sekretion von Beta-Zellen^5,6,7,8. Diese Studien erfordern ein besseres Verständnis der Kupplung Beziehung zwischen Stimulation von Glukose und Insulin-Sekretion. Daher ist die Fähigkeit, genau zu überwachen und zu quantifizieren, das Niveau der Glukose-stimulierten Insulinsekretion (GSIS) unerlässlich gewesen. Bisher wurden jedoch nur eine begrenzte Anzahl von Methoden zur Quantifizierung der GSIS mit Insulin-sezernierenden Zelllinien und/oder pankreatischen kleinen Inseln. Einer ist Radioimmunoassay (RIA), das Radioisotop-Tags Insulin und Antikörper verwendet. Die wichtigsten Einschränkungen dieses Ansatzes umfassen Fragen der Sicherheit durch die Handhabung und Entsorgung von radioaktiven Stoffen. Darüber hinaus ist diese Methode arbeitsintensiv, mit mehreren langen waschen und inkubationsschritte. Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) ist ein weiterer Kosten- und arbeitsintensive Ansatz, der Antikörper gegen Insulin-Erkennung nutzt. Veränderung des Antikörpers Affinitäten und der Effizienz von Insulin zu erkennen sind limitierende Faktoren dieser Methode und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse beeinflussen können. ELISA weder RIA wurde für Hochdurchsatz-Experimente entwickelt. AlphaScreen ist ein homogenes Assay verwendet für die Erkennung und Messung der Insulin-Sekretion. AlphaScreen Technologie basiert auf der Umwandlung von ambient Sauerstoff in einem aufgeregt Sauerstoff Singulett-Zustand, die mit Chemilumineszenz Arten, was die Generation der Chemilumineszenz reagieren kann. Da die Probe homogen ist, entfallen viele der Waschschritte RIA und ELISA zugeordnet. Die Instabilität des Signals aufgrund der Art der Reaktion ist jedoch ein limitierender Faktor, der die Ablesung des Tests beeinflussen kann. () TR-Zange, entwickelt von Heyduk und Kollegen⁹, ist ein weiterer homogenen Ansatz zur Insulin-Messung basiert auf der Bindung von zwei separaten Antikörper gegen unterschiedliche Epitope auf die Insulin-Molekül. Die Antikörper sind jedes chemisch mit Doppel stranded DNA mit kurze ergänzende einzelne stranded DNA Überhänge. Bindung von Antikörpern an Insulin bringt sie zusammen und führt zu ein Doppel stranded DNA Duplex. Jeder Antikörper ist auch verbunden mit einer jeweiligen Spender oder Akzeptor Fluorophor, und der Verband der DNA Duplex vereint diese Fluorophore, Förster Resonanz Energietransfer (FRET) zu generieren. Eine mögliche Einschränkung der TR-Zange, liegt jedoch bei den Bund selbst. Die Unfähigkeit, schnell zerstreuen Hintergrundfluoreszenz während der Bund Reaktion führen zu relativ hohen Hintergrundfluoreszenz und ein low-Signal Rauschabstand innerhalb der Assay. Daher besteht ein Bedürfnis nach wie vor für eine zuverlässige, robuste und kostengünstige Assay zur Quantifizierung der GSIS in gewissem Sinne Hochdurchsatz.

Jüngste Fortschritte in der Biophysik gipfelten in der Entwicklung eines homogenen Zeitaufgelöste Fluoreszenz Energie Resonanz Transfer (HTRF) basierte Assays. Insbesondere während der Energietransfer innerhalb kann der Assay als FRET-basierte, genauer gesagt, bezeichnen HTRF Lumineszenz Energie Resonanz Transfer (LRET)¹⁰ abhängig von der nichtstrahlenden Übertragung von Energie zwischen Donor und Akzeptor Art^11,12,13. Diese Unterscheidung ist wichtig, da der Zeitpunkt für eine Fluoreszenz oder Abschreckung basiert Bund Interaktion ist viel anders als bei LRET, obwohl die gleichen Arten von gating für Bund und LRET verwendet werden können. Darüber hinaus die Verwendung von seltenen Erden lanthanid Cryptate Verbindungen wie Europium oder Terbium Cryptate in HTRF produziert lange Fluoreszenz Halbwertszeiten^12,14. Dies bietet den einzigartigen Vorteil der Einführung einer zeitlichen Verzögerung (µsec) zwischen Spender Erregung und die Messung der Emission von den Akzeptor (d. h. Zeitaufgelösten Assay). Diese zeitliche Verzögerung ermöglicht ausreichend Zeit für die Hintergrundfluoreszenz, vor der Messung der Akzeptor Emission Fluoreszenz zu zerstreuen. Infolgedessen das Auslesen ist frei von unspezifischen Fluoreszenz und damit ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis erreicht ist (Abbildung 1). Darüber hinaus entfallen homogene Artder HTRF Waschschritten ungebundenen Arten, so dass des Tests viel schneller als ELISA oder RIA-basierten Methoden abwaschen.

Abbildung 1: Schematische des Mechanismus der Insulin-Erkennung HTRF. Zwei unabhängig generierten monoklonale Antikörper spezifisch erkennen und Binden an Insulin an verschiedenen Standorten. Diese Antikörper sind entweder dem Europium Cryptate Spender oder den XL665 Akzeptor konjugiert. Anregung des Spenders auf 337 nm Ergebnisse in Emission bei 620 nm. Die daraus resultierende Energieübertragung bewirkt XL665 emittieren bei einer längeren Wellenlänge, 665 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines HTRF ausgerichteten Ansatzes an der GSIS aus INS-1E Zellen bestimmen, eine gut etablierte Insulin-sezernierenden Beta-Zellen abgeleitet Ratte Insulinom Zelle Zeile¹⁵. Darüber hinaus kann dieser Assay verwendet werden, für die Ermittlung der pharmakologischen Profils der molekularen Regulatoren der Insulin-Sekretion. Wir wenden dieses HTRF-basierte Insulin-Assay untersuchen Dopamin D₂-Rezeptor Regulierung der GSIS mag. Immer mehr Studien haben gezeigt, dass der Neurotransmitter Dopamin ein wichtiger Regulator der GSIS^{8,16,17,18,19,20,} ist ^{21 , 22}. Dopamin wirkt GSIS in gewissem negativen Autokrine/Parakrine über Aktionen auf dem Dopamin D-₂-Rezeptoren (D₂, D₃, D-₄ -Rezeptoren) an der Oberfläche der Beta-Zellen der Bauchspeicheldrüse⁸ zum Ausdruck gebracht, wie ^{, 16 , 19}. mit dieser Assay, wir bestätigen Dopamin die Rolle als negativer Regulator der GSIS und nachweisen, dass die Dopamin D₂-wie Rezeptor-Agonisten Bromocriptin und Quinpirole auch GSIS reduzieren.

Protokoll

(1) INS-1E Zellen: Wartung und Beschichtung

1. Pflegen Sie, INS-1E Zellen in einem befeuchteten 37 ˚C/5% CO₂ Inkubator und kultivierten mit RPMI 1640 Medium mit 5 % (V/V) Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM Natrium Pyruvat, 100 U/mL Penicillin/Streptomycin ergänzt Lösung, 50 µM β-Mercaptoethanol. Kulturzellen Sie in 10 mL komplette RPMI 1640 Medium (pro Platte), bis zum Zusammenfluss von 80-90 % erreichen, wenn sie trypsiniert und passagiert oder verwendet werden können für die Insulin-Sekretion-Assay.
2. Tag 1: Aspirieren Sie Medien und waschen Sie Zellen einmal mit 5 mL vorgewärmten PBS. Fügen Sie 0,5 mL Trypsin (0,025 %) verdünnt 1:1 in 0,5 mL PBS trypsinize Zellen und 3-4 min bei 37 ° c inkubieren. Deaktivieren Sie Trypsin, indem eine 15 mL Zentrifugenröhrchen durch pipettieren 9 mL komplette Medien und Transfer Zellen hinzufügen.
3. Pellet-Zellen durch Zentrifugation und erneut aussetzen der Zelle Pellet in etwa 5 mL frische Medien.
4. Nehmen Sie 10 µL der neu suspendierten Zellen und mischen mit 10 µL Trypan blau vital Farbstoff für Zellviabilität zu überprüfen. Lebende und tote Zellen in 10 µL dieser Mischung mit einer Hemocytometer zu zählen. Lebensfähigkeit sollte über 90 % liegen. Verdünnen Sie die neu suspendierten Zellen in frische Medien auf 1 Million Zellen pro mL.
5. 0,5 mL INS-1E Samenzellen pro Bohrloch in einer Poly-L-Lysin vorbeschichtet 24-Well-Platte bei einer Dichte von 500.000 Zellen/gut.
6. Tag 2: Entfernen Sie die Medien 18-24 h nach der Beschichtung und 500 µL/Well frische RPMI 1640 Medien hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen für eine weitere 24 h damit Zellen vollständig von der vorherigen passaging Schritt zu erholen. Diese zusätzliche Zeit erlaubt die Zellen auf der Gewebekultur Platte verteilen.

2. Insulin-Sekretion Assay (Tag 3)

1. KRB Puffer vorzubereiten: 132,2 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 5 mM Nahco3₃, 0,5 mM NaH₂PO₄, 0,5 mM MgCl₂, 1,5 mM CaCl₂und 0,001 g/mL Rinderserumalbumin (BSA), pH 7.4.
2. Aspirieren Sie Medien aus Zellen und zweimal mit vorgewärmten PBS waschen.
3. Fügen Sie für den Glukose-Hunger-Schritt 450 µL/Well KRB (mit BSA) ohne Glukose für 1 h bei 37 ˚C/5% CO₂.
4. Während der Glukose-Hunger-Schritt vorzubereiten Verdünnungsreihen Gefäßsystem im KRB mit 200 mM Glukose (10 X-Konzentration).
   1. Bereiten Sie Medikament bei 10 x die Endkonzentration im KRB ergänzt mit 200 mM Glukose (auch 10 x die endgültige Assay-Glukosekonzentration vor). Wenn die Droge-Lager (plus die zusätzlichen 10 x Glukose) ist in DMSO, stellen Sie sicher, DMSO Prozentsatz Assay (idealerweise endgültige Prozentsatz von weniger als 0,1 % DMSO) konstant gehalten wird.
   2. Für Dopamin und Quinpirole Behandlungen, verwenden Sie einen abschließenden Test Medikament Konzentrationsbereich von 100 µM bis 100 pM (vom höchsten zum niedrigsten Konzentration), mit dem letzten Punkt der Dosis-Antwort enthält kein Medikament. Verwenden Sie für Bromocriptin einen abschließenden Test Konzentrationsbereich von 10 µM bis 22:00, mit dem letzten Punkt der Dosis-Antwort wird die wirkstofffreie Kontrolle.
5. Fügen Sie nach Glukose Hunger Medikament Verdünnungsreihen Assay, eine Dosis-Antwort zu produzieren hinzu.
6. Fügen Sie 50 µL/Well jedes serielle Verdünnung in die entsprechenden Vertiefungen (total Assay Volume 500 µL).
7. Zellen mit der jeweiligen Droge Verdünnungsreihen (in Anwesenheit von 20 mM Glukose) inkubieren Glukose Stimulation Schritt 90 min bei 37 ˚C/5% CO_2. Eine Reihe von Kontroll-Vertiefungen enthalten: (1) Stimulation mit 20 mM Glukose allein in Ermangelung jeder zusätzliche medikamentöse und (2) Zellen, die weder mit Medikamenten noch Glukose (bietet eine basale Rate der Sekretion) stimuliert werden.
8. Entfernen Sie nach der Stimulation Schritt vorsichtig die Überstände (Verwendung direkt oder bei 4 ° c).
   Hinweis: Eine zusätzliche 5 min. sanfte Zentrifugationsschritt (600 X g, 1 min) kann an dieser Stelle eingeführt werden, um alle verbleibenden Zellen in der Assay-Überstände entfernen.

3. HTRF, Maßnahme Insulin-Sekretion

1. Verdünnen Sie Assay Überstände 01:10 in KRB (ohne BSA), vorzugsweise in klaren 96-Well Platten.
2. Bereiten Sie der Insulin-Standardkurve für HTRF Insulin Assay (Tabelle 1).

Standard-Stammlösung 500 ng/ml	Verdünnungsreihen	Arbeiten [Insulin] ng/ml
STD 7	30 µl Lager + 140 µl KRB	150
STD 6	30 µl STD 7 + 45 µl KRB	60
5 STD	30 µl STD 6 + 45 µl KRB	24
4 STD	30 µl STD 5 + 45 µl KRB	9.6
3 STD	30 µl STD 4 + 45 µl KRB	3.84
2 STD	30 µl STD 3 + 45 µl KRB	1,54
1 STD	30 µl STD 2 + 45 µl KRB	0,61
STD 0	45 µl KRB	0
Hinweis: STD Lager ist 500 ng/ml

Tabelle 1. Verdünnungsreihen die Standardkurve Insulin zu machen.

3. Die HTRF-Platte die Standardkurve Proben und der verdünnten Probe Überstände hinzufügen. Die Messung des ausgeschiedenen Insulin durch HTRF kann erfolgen, in eine 96-Well oder einem 384-Well-Plattenformat, unter Berücksichtigung, die das Assay-Volumen muss neu eingestellt werden. Einsatz 10 µL/Well Probe in 96-Well weiße Hälfte-Bereich Platten oder 5 µL/Well in einem weißen 384-Well geringem Volumen, Rundboden Teller (siehe Tabelle der Materialien).
4. Antikörper-Mix in detektionspuffer vorzubereiten (siehe Tabelle der Materialien) in einem 1:2 Spender (Cryptate) / Akzeptor (XL-665) Verhältnis.
   Hinweis: Weitere spezifische Details über die HTRF Probe sind beim Hersteller erhältlich.
5. Der Test auf 30 µL/Well (für eine 96-Well-Platte-Assay-Format) oder 15 µL/Well (für ein 384-Well-Platte-Assay-Format) Antikörper-Mischung hinzufügen.
6. Die Dichtplatte und bei Raumtemperatur inkubieren.
7. Platte nach 2 h, 4 h und/oder Übernachtung Inkubation mit Antikörpern, die mit der Platte-Leser und die entsprechenden HTRF optische Modul zu lesen (337 665 620 nm) (siehe Tabelle der Werkstoffe und Anweisungen des Herstellers). Die Integration Start-bei 60 µs und die Integrationszeit bei 400 µs. Einsatz 200 blinkt pro Bohrloch.
   Hinweis: Diese Parameter beruhten auf den Einsatz unserer speziellen Leser. Das Auslesen bei 620 nm und 665 nm variieren zwischen verschiedenen Instrumenten. Dies ist einer der Gründe, warum wir empfehlen die Verwendung der 665/620-Verhältnis. Bei der Berechnung dieses Verhältnis, Potentialdifferenzen von Leser zu Leser werden normalisiert und konsistente Werte unabhängig von dem Instrument zur Messung der HTRF bieten.

(4) Datenanalyse und Normalisierung

1. Berechnen Sie die Insulin-Konzentrationen der Assay-Brunnen durch Extrapolation der ratiometrischen Fluoreszenz Lesungen (665 nm/620 nm), eine zweite Bestellung quadratische polynomische Kurve (Abbildung 2).

Abbildung 2 : Insulin Standardkurve. Humaninsulin Lager der bekannten Konzentrationen wurde verwendet, um die Standardkurve Insulin zu generieren. Die daraus resultierende HTRF Verhältnisse (665 nm / 620 nm) wurden gegen die Insulin-Konzentrationen aufgetragen. Die Daten am besten passte, eine zweite Bestellung quadratische polynomische Kurve (R² = 0.99996). Dies ist eine repräsentative Standardkurve. Fehlerbalken = SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

2. Normalisieren Sie mit den hochgerechneten Daten wie ng/mL Insulin sezerniert (Insulin abgesondert in Reaktion auf die steigende Konzentrationen Liganden) auf den Mittelwert der % maximale Insulin-Sekretion Assay Brunnen (20 mM Glukose allein Zustand).
3. Verwenden Sie die Kurve Passform (R²) aus einem einzigen Experiment um Intraplate Variation zu berechnen. Im Rahmen des Experiments R² Einzelwerte von Intra experimentelle Duplikate, so dass die Berechnung der Standardfehler des Mittelwerts für die Kurvenanpassung abgeleitet.
4. Verwenden Sie für die Bestimmung der interplate Variation die Daten aus mindestens drei einzelnen Experimente um den Standardfehler des Mittelwerts für die R-² -Wert der kollektiven Kurve berechnen.

Ergebnisse

Wir validiert unsere Insulin HTRF Assay durch die Erzeugung eines Insulin-Standardkurve mit gereinigtem Humaninsulin Standards der vordefinierten Konzentrationen (Abbildung 2). Generation der Standardkurve erlaubt uns, die ratiometrischen Fluoreszenz Lesungen zu extrapolieren und somit bestimmen die sekretierten Insulinspiegel in Reaktion auf die medikamentöse Behandlungen (Abbildung 2). Intraplate Variante für Kurvenanpassung ...

Diskussion

Die hier beschriebenen HTRF Insulin Assay bietet eine schnelle, effiziente System zur Messung der Insulin-Sekretion aus einem kultivierten Zell-basierte System. Einer der wichtigsten Vorteile bietet dieser Test eine geringe Hintergrundsignal aufgrund der hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Darüber hinaus haben wir bestätigt, dass das HTRF-Signal über einen längeren Zeitraum hinweg stabil ist (> 24 h)⁷. Dennoch, da die Insulin-Bindung monoklonaler Antikörper schnell bindende Sättigung nach Zugab...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well white half area plate	Greiner Bio-One	82050-042
384-well white low-volume, round-bottom plate	Corning	15100157
Insulin High Range Kit	Cisbio Bioassays	62IN1PEH	10,000 test HTRF-based insulin assay kit
PHERAstar FSX plate reader	BMG Labtech	FSX	Plate reader adapted for HTRF-based assay readings
Plate sealers	Fisher Scientific	DY992	To seal plate while antibodies incubate
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100
RPMI Medium 1640 (1x)	Gibco	11875-093	[+] L-glutamine
Trypsin 0.05%	Corning	25-052-CI	0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline)	Corning	21-031-CV	Without calcium and magnesium
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
HEPES	Gibco	156-30-080
Sodium pyruvate	Gibco	11360070
Penicillin/Streptomycin solution 100x	Corning	30-002 CT
2-mercaptoethanol	Sigma	M1348
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Dopamine hydrochloride	Sigma	8502
Bromocriptine mesylate	Tocris	427
(-)-Quinpirole hydrochloride	Tocris	1061
Bovine Serum Albumin	Calbiochem	12659
Poly-L-Lysine	Sigma	P4832
Glucose	Sigma	G7021
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma	276855