عزل إيمونوماجنيتيك سريعة ومحددة من الماوس Oligodendrocytes الأولية

Summary

يصف لنا عزلة إيمونوماجنيتيك oligodendrocytes الماوس الأساسي، الذي يسمح لعزل الخلايا في المختبر الثقافة سريعة ومحددة.

Abstract

عزلة فعالة وقوية وثقافة oligodendrocytes الأولية (عملية شريان الحياة) أداة قيمة للدراسة في المختبر لتطوير أوليجوديندروجليا، فضلا عن بيولوجيا دملينتينغ الأمراض مثل التصلب المتعدد و بليزايوس-ميرتسباخر-مثل مرض (PMLD). هنا، فإننا نقدم بسيطة وتحقيق الكفاءة في اختيار الأسلوب لعزل إيمونوماجنيتيك المرحلة O4 ثلاث⁺ الخلايا بريوليجوديندروسيتيس من الجراء الفئران حديثي الولادة. منذ را غير ناضجة تشكل أكثر من 80% من هذه المسألة الأبيض القوارض في الدماغ عند الولادة يوم 7 (P7) لا يضمن هذا الأسلوب عزل عالية الغلة الخلوية، ولكن أيضا عزلة محددة من شريان الحياة للسودان ملتزمة بالفعل النسب أوليجوديندروجليال، تناقص إمكانية عزل الخلايا تلويث مثل أستروسيتيس والخلايا الأخرى من الدماغ الماوس. هذا الأسلوب هو تعديل التقنيات التي ذكرت سابقا، ويوفر oligodendrocyte إعداد نقاوة أعلى من 80% في حوالي 4 ح.

Introduction

Oligodendrocytes (عملية شريان الحياة) هي خلايا ميليناتينج الجهاز العصبي المركزي (CNS)¹. بالعزلة وثقافة oligodendrocytes الأولية في بيئة محكم تنظيم أداة قيمة للدراسة في المختبر لتطوير أوليجوديندروجليا، فضلا عن بيولوجيا دملينتينغ الأمراض مثل التصلب المتعدد² . وهذا يتطلب oligodendrocyte فعالة وقوية العزلة وثقافة أسلوب³. في هذه الدراسة، ونحن استغل للتعبير عن علامة سطح الخلية oligodendrocyte المميزة لتنفيذ تقنية عزل معدلة التي سريعة ومحددة.

وقد تم التعرف على أربع مراحل متميزة من النضج أوليجوديندروسيتي، بعضها يتسم بالتعبير عن علامات سطح الخلية المميزة لكل مرحلة من مراحل النمو (الشكل 1). هذه العلامات السطحية الخلية يمكن التعرف عليه بواسطة أجسام مضادة محددة^4،5، ويمكن استخدامها لعزل عملية شريان الحياة في مراحل محددة. وفي المرحلة الأولى، oligodendrocyte خلايا السلائف (OPCs) لديها القدرة على تتكاثر وتهاجر، وتحديداً التعبير عن عامل النمو المشتقة من الصفيحات مستقبلات (بدجف-Rα)⁶، جانجليوسيدي A2B5، وبروتيوغليكان NG2^7،8 ، بوليسياليك حمض العصبية خلية التصاق جزيء⁹ والأحماض الدهنية-ملزمة البروتين 7 (FABP7)¹⁰. وقد المعاونة مورفولوجيا القطبين مع بعض العمليات قصيرة النابعة من أقطاب المعارضة لخلايا الجسم، والتي من سمات الخلايا العصبية السلائف¹¹.

رقم 1: التعبير عن علامات سطح الخلية أثناء وضع الماوس أوليجوديندروسيتي. عملية شريان الحياة الخلية السطحية علامات مثل A2B5، GalC (O1)، NG2، O4، وبدجف-Rα يمكن استخدامها لعزل oligodendrocytes على وجه التحديد في مرحلة إنمائية محددة باستخدام أجسام مضادة محددة.   الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

وفي المرحلة الثانية، تثير بريوليجوديندروسيتيس المعاونة ويعرب في غشاء الخلية علامات حزب مؤتمر اودوا الشعبي، ليس فقط، بل أيضا سولفاتيدي (جالاكتوليبيد مسلفت) المعترف بها من قبل ال^12،جسم O4¹³، بروتين GPR17¹⁴، التي استمرت حتى المرحلة oligodendrocyte غير ناضجة (الرتب الأخرى). وفي هذه المرحلة، تمديد بريوليجوديندروسيتيس العمليات قصيرة متعدد الأقطاب. بريوليجوديندروسيتيس هي مرحلة را رئيسيا في يوم الولادة 2 (P2) في هذا الشأن الأبيض الدماغي الجرذ والفأر مع سكان صغيرة غير ناضجة عملية شريان الحياة¹⁵.

خلال المرحلة الثالثة، وتواصل غير ناضجة عملية شريان الحياة التعبير عن O4 وتفقد التعبير عن علامات A2B5 وفي NG2 ويبدأ بالتعبير عن جالاكتوسيريبروسيدي ج¹⁶. في هذه المرحلة، ملتزمون بنسب أوليجوديندروجليال عملية شريان الحياة وتصبح الخلايا الانقسامية اللاحقة مع فروع متشعب طويل^17،18. را غير ناضجة تشكل أكثر من 80 في المائة من هذه المسألة الأبيض القوارض في P7 وتحترم الخلايا MBP⁺ الأولى في هذا الوقت^15،19،،من²⁰²¹. ولذلك، يمكن ضمان عزل عملية شريان الحياة في P7 عالية الغلة الخلوية.

في المرحلة الرابعة والنهائية من التنمية را، أعرب شريان ناضج ميليناتينج البروتينات (البروتين الأساسية المايلين (MBP) والبروتين بروتيوليبيد (حزب العمال التقدمي) وبروتين سكري المايلين المرتبطة (ماج) والمايلين أوليجوديندروسيتي بروتين سكري (موج)^{22،23 ،24،،}من²⁵²⁶. في هذه المرحلة، تمديد هذا الاتفاق شكل انورابينج مانعات حول محاور عصبية الأغشية شريان ناضج وقادرون على ميلينت. ويتزامن هذا مع ملاحظة أن الخلايا MBP⁺ في الدماغ الفئران والفأر، تصبح وفرة متزايدة في P14^19،،من²⁰²¹.

منذ عزل أول oligodendrocyte فوستر والزملاء في عام 1967²⁷، نفذت عدة طرق لعزل عملية شريان الحياة من القوارض الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك إيمونوبانينج^28،،من²⁹³⁰، الأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) استغلال الخلية الخاصة بسطح المستضدات^28،31، الطرد المركزي التدرج التفاضلية^32،،من^3334،35 وأسلوب هز على أساس الانضمام التفاضلية لإطلاق الجهاز العصبي المركزي مختلفة^36،37. ومع ذلك، أساليب الثقافة القائمة قد القيود، لا سيما من حيث النقاء والغلة والوقت المطلوب لتنفيذ إجراءات³⁸. ولذلك، أكثر كفاءة أساليب معزل oligodendrocytes المطلوبة.

في هذه الورقة، نقدم بسيطة وتحقيق الكفاءة في اختيار الأسلوب لعزل إيمونوماجنيتيك المرحلة O4 ثلاث⁺ الخلايا بريوليجوديندروسيتيس من الجراء الفئران حديثي الولادة. هذا الأسلوب تعديل التقنيات التي ذكرت باميرى et al. ³⁹ ودينكمان et al. ⁴⁰ ويوفر نقاء إعداد oligodendrocyte أكثر من 80 في المائة في حوالي 4 ح.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وكانت الفئران المستخدمة في هذه الدراسة يعتني بهم وفقا للمبادئ التوجيهية لجامعة ولاية نيويورك الولاية الطبي مركز الشعبة من مختبر الحيوان الموارد (دلار) البروتوكول عدد 15-10492.

ملاحظة: أوليجوديندروسيتيس الأولية كانت معزولة من حديثي الولادة (P5-P7 البرية من نوع C57Bl/6N) الفئران. وفي هذه المرحلة، تشكل شريان الحياة للسودان غير ناضجة أكثر من 80 في المائة من هذه المسألة الأبيض القوارض كفالة عالية الغلة الخلوية. تتوفر كافة المخزن المؤقت والتراكيب الكاشف في نهاية الجدول للمواد.

1-إعداد كوفيرسليبس

ملاحظة: بولي-د-يسين (PDL)/كوفيرسليبس لامينين المغلفة ينبغي أن تعد قبل عزلة الرتب الأخرى.

1. مكان #1 الألمانية الزجاج كوفيرسليبس في أنبوب 50 مل مخروطية وإضافة 35 مل من 70% EtOH لتنظيفها.
2. إغلاق الأنبوب ووضعه في خلاط نوتاتينج واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل في حين تعصف بلطف. يمكن المحتضنة كوفيرسليبس بين عشية وضحاها.
3. تجاهل EtOH 70%.
4. أغسل كوفيرسليبس 3 مرات مع المياه، وإزالة الماء كل مرة مع الشفط بالتخلية.
5. إضافة 30-35 مل PDL 50 ميكروغرام/مل كوفيرسليبس في 50 مل الأنبوب، ما يكفي لتغطية كوفيرسليبس.
6. ضع 50 مل الأنبوب الذي يحتوي على كوفيرسليبس في خلاط نوتاتينج واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل في حين تعصف بلطف.
7. أغسل كوفيرسليبس 3 مرات مع المياه، إزالة الماء كل مرة مع الشفط بالتخلية.
8. نقل كوفيرسليبس إلى 60 ملم بيتري الأطباق التي تحتوي على المياه.
9. استخدام تلميح ماصة P200 لترتيب كوفيرسليبس كطبقة تغطي كامل سطح طبق بيتري.
10. بعناية، إزالة الماء من الأطباق مع الشفط بالتخلية.
11. إزالة فائض المياه في جميع أنحاء كوفيرسليبس والسماح لهم الجافة بين عشية وضحاها مع غطاء مفتوحة وتحت الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة في غطاء محرك السيارة.
    ملاحظة: يمكن تخزين PDL مغلفة الزجاج كوفيرسليبس في 4 درجات مئوية في أطباق بتري معقمة لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.
12. مكان كوفيرسليبس في لوحات 24-حسنا، واحد لكل بئر، باستخدام الملقط غرامة.
13. الانتقال كوفيرسليبس إلى مركز جيدا مع التأكد من الحواف لا تلمس جدار البئر.
14. إضافة 100 ميليلتر من 10 ميكروغرام/مل laminin المخفف في B27NBMA (انظر الجدول للمواد) ابتداء من وسط كل ساترة وتتحرك بطريقة دائرية نحو الحواف لتغطية كل منطقة.
    ملاحظة: نظراً لتشارك في صيانة را laminin ويعزز التمايز في شريان الناضجة، أنها عاملاً هاما في بقاء را^43،،من⁴² في المختبر الثقافة^41،44.
15. احتضان اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية في 5% CO₂ ح 1 على الأقل أو حتى شريان الحياة للسودان على استعداد للطلاء.

2. الماوس تفارق قشرة الدماغ

1. التضحية الجراء الماوس C57Bl/6N 5-7 أيام القديمة بعد الولادة بقطع الرأس السريع مع مقص تنظيفها مسبقاً في الإيثانول 70%.
   ملاحظة: استخدمت كورتيسيس الدماغي من الجراء الفئران حديثي الولادة 5-6 لكل إعداد. وفي المتوسط، غلة واحد الماوس الدماغ 1-1.5 × 10⁶ عملية شريان الحياة.
2. قطع الجلد فروة الرأس على طول خط الوسط مع مقص تشريح الصغيرة، وسحب لفضح الجمجمة.
3. قطع الجمجمة بعناية على طول خط الوسط ابتداء من فتح في الجزء الخلفي من الجمجمة نحو منطقة أمامي، حتى رفع مع مقص لتفادي تلف الدماغ. بعد ذلك، فتح في الجزء الخلفي من الجمجمة باستخدام قطع تجاه كل محجر العين على طول قاعدة الجمجمة.
4. استخدام الملقط غرامة بلطف ندف كورتيسيس بعيداً عن midbrain ونقلها إلى طبق استنبات الأنسجة 60 ملم تحتوي على 7 مل B27NBMA. كرر الخطوات من 2.2 عن طريق 2.4 لكل الدماغ، وتجميع كورتيسيس تشريح.
5. نقل كورتيسيس إلى طبق استنبات الأنسجة 60 ملم جديدة تحتوي على 5 مل من المخزن المؤقت للانفصال (B27NBMA و 20-30 U/mL غراء 2,500 يو الدناز أنا).
6. الزهر في كورتيسيس إلى قطع صغيرة من حوالي 1 ملم³ باستخدام شفرة المبضع #15 واحتضان لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5% CO₂ حاضنة.
7. أضف 1 مل مصل النمو البقري (BGS) لوقف رد الفعل الأنزيمي.
8. نقل كورتيسيس جنبا إلى جنب مع وسائط الإعلام الانفصال إلى أنبوب مخروطي 15 مل باستخدام بيبيت مصلية 10 مل.
9. تبدأ بلطف أن تنأى بأنسجة المخ ببطء بيبيتينج أعلى وأسفل باستخدام 6-8 مرات من 10 مل بيبيت مصلية، واستخدام الرعاية لتصغير الفقاعات.
10. السماح لقطع الأنسجة تسوية لمدة 2-3 دقيقة ونقل المادة طافية إلى أنبوب جديد.
11. أضف 3 مل B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS/2500 "ش الدناز" أنا للأنسجة بيليه.
12. استخدام ماصة مصلية 5 مل أن تنأى بلطف بأنسجة المخ بينما بيبيتينج صعودا وهبوطاً 6-8 مرات. كن حذراً للتقليل من الفقاعات.
13. السماح لقطع الأنسجة تسوية لمدة 2-3 دقائق.
14. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد. أضف 3 مل B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS/الدناز أنا للأنسجة بيليه.
15. بلطف ننأى بأنسجة المخ باستخدام تلميح بيبيت P1000، بينما بيبيتينج المزيج من وسائل الإعلام والدماغ الأنسجة صعودا وهبوطاً. كرر الخطوات 2.13 و 2.14 حتى تبقى لا أجزاء كبيرة من الأنسجة أو حتى B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS/الدناز أنا استنفدت، أيهما يأتي أولاً. كن حذراً للتقليل من الفقاعات.
16. تعليق خلية تجمع مع سوبيرناتانتس السابقة.
17. مكان 70 ميكرومتر مصفاة الخلية في أنبوب 50 مل. استخدام بيبيت مصلية 10 مل، تمرير تعليق خلية المجمعة بلطف عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر.
18. أغسل مصفاة الخلية بإضافة 1 مل B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS/الدناز أنا.
19. تجاهل مصفاة الخلية. إحضار وحدة التخزين إلى 30 مل مع B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS/الدناز أنا.
20. نقل تعليق الخلية إلى اثنين من أنابيب مخروطية الشكل 15 مل. الطرد المركزي بتعليق خلية لمدة 10 دقائق في 200 x ز.
21. إزالة المادة طافية دون ترك الخلايا المعرضة للهواء. وستكون المادة طافية غائم بسبب الحطام خلية. أضف 3 مل B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS لبيليه.
22. ننأى بعناية بيليه الخلية باستخدام بيبيت P1000. إحضار وحدة التخزين إلى 15 مل مع B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS.
23. تمرير تعليق خلية عبر مصفاة خلية جديدة 40 ميكرومتر.
24. أغسل مصفاة الخلية بإضافة 1 مل B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS. تجاهل مصفاة الخلية.
25. إحضار وحدة التخزين إلى 30 مل مع B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS.
26. نقل تعليق خلية لأنابيب مخروطية 2 × 15 مل. الطرد المركزي بتعليق خلية لمدة 10 دقائق في 200 x ز.
27. إزالة معظم المادة طافية دون ترك الخلايا المعرضة للهواء. ريسوسبيند الكريات الخلية في 5 مل من الجليد الباردة المغناطيسي الخلية الفرز المخزن المؤقت (MCS).

3-تحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء

1. تمييع 100 ميليلتر من تعليق خلية مع 400 ميليلتر "حل تريبان الأزرق" في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل لتحقيق تخفيف 1:5 في 0.4% (w/v).
2. مركز زجاج تغطي أكثر من دائرة هيموسيتوميتير والتعبئة دائرتي مع 10 ميليلتر لتمييع الخلية باستخدام ماصة P10 وتجنب أوفيرفيل. سيتم تمرير الحل تحت غطاء الزجاج بعمل شعري.
3. وضع في هيموسيتوميتير في مرحلة مجهر وضبط التركيز باستخدام 40 X التكبير.
   ملاحظة: يتم تسجيل عدد خلايا استخدام عداد اليد في كل من المربعات الخمسة (أربعة أركان ومركز واحد). الخلايا غير قادرة على البقاء فقط امتصاص الصبغة وتظهر زرقاء، بينما يعيش وخلايا صحية تظهر جولة والانكسار ولا تستوعب صبغة زرقاء اللون، مما يسمح لتحديد عدد من خلايا قابلة للحياة، ومجموع في المليلتر.

4-عزل O4⁺ أوليجوديندروسيتيس

1. الطرد المركزي بتعليق خلية في 200 غ س لمدة 10 دقائق.
2. تجاهل المادة طافية بعناية باستخدام الشفط بالتخلية، تجنب التعرض للخلايا في الهواء.
3. ريسوسبيند بيليه في 90 ميليلتر من المخزن المؤقت MCS الواحدة 1 × 10⁷ مجموع الخلايا متبوعاً بإضافة 10 ميليلتر لمكافحة O4 الخرز الواحدة 1 × 10⁷ الخلايا.
4. مزيج تعليق خلية والخرز بالتحريك بلطف الأنبوبة المخروطية 15 مل مع الإصبع 4-5 مرات.
5. احتضان هذا المزيج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، يسددها الأنبوبة المخروطية 15 مل مع الإصبع تيميسيفيري 4-5 5 دقيقة.
6. أغسل هذا المزيج بإضافة 2 مل من المخزن المؤقت MCS الواحدة 1 × 10⁷ خلايا الأنبوب بلطف. الطرد المركزي ميكس في 200 غ س لمدة 10 دقائق.
7. تجاهل المادة طافية بعناية استخدام الشفط بالتخلية، تجنب التعرض للخلايا في الهواء. ريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للرصد والمراقبة لكل الخلايا⁷ 1 × 10.
8. إرفاق فاصل مغناطيسي لموقف فاصل مغناطيسي. إرفاق عمود اختيار الفاصل المغناطيسي ومصفاة خلية 40 ميكرومتر على رأس العمود. مكان اثنين 15 مل أو أنبوب مخروطي 50 مل واحد أسفل عمود فصل للتدفق من خلال جمع.
9. قبل شطف 40 ميكرومتر خلية العمود مصفاة وفصل مع 3 مل من المخزن المؤقت للرصد والمراقبة وترك المخزن المؤقت من خلال العمود تشغيل دون السماح لها الجافة.
10. إضافة هذا المزيج من تعليق خلية والخرز إلى مصفاة الخلية وفي العمود الاختيار.
11. أغسل مصفاة خلية 40 ميكرومتر مع 1 مل من المخزن المؤقت للرصد والمراقبة.
12. تجاهل مصفاة الخلية والسماح المزيج من الخلايا والخرز والمخزن المؤقت من خلال العمود تشغيل دون السماح لها الجافة.
13. أغسل العمود فصل 3 مرات مع 3 مل من المخزن المؤقت للإشراف والوقت 1 مع را انتشار وسائط الإعلام.
14. إزالة العمود فصل من الفاصل المغناطيسي ووضعها بسرعة في أنبوب مخروطي 15 مل فورا إضافة 5 مل من الرتب الأخرى انتشار وسائط الإعلام.
15. وضع المكبس على رأس العمود ودفع لطرد الخلايا المسماة في أنبوب مخروطي 15 مل بشدة.
16. إزالة 100 ميليلتر من تعليق خلية لتحديد عدد الخلايا وجدوى استخدام تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير كما هو مبين في الباب 3.
    ملاحظة: صلاحية خلية فوق 80% يعتبر مقبولاً المضي قدما مع ثقافة عملية شريان الحياة، ولكن صلاحية أكبر من 90% الأمثل.

5-الطلاء O4 المعزولة⁺ أوليجوديندروسيتيس

1. تمييع تعليق خلية لرغبة تصفيح الكثافة (5 × 10⁵ خلايا كل ساترة) استخدام الرتب الأخرى انتشار وسائط الإعلام.
   ملاحظة: را البذر كثافة مهم جداً، حيث ينبغي تأكيد كثافة الخلية المناسبة استخدام مجهر زراعة الأنسجة قبل المتابعة. بذر الكثافة أدناه خلايا 10,000/كوفيرسليبس قد يؤدي إلى بقاء الخلية الفقراء. في تصفيح الكثافة في الرتب الأخرى 10,000 إلى 25,000، هو التمايز المورفولوجي بطيئة⁴⁵. نحن لوحة عملية شريان الحياة في كثافة بذر لخلايا/كوفيرسليبس 50,000 على الأقل لضمان بقاء الخلية.
2. نقل 24-جيدا لوحات تحتوي على كوفيرسليبس المغلفة مع laminin من حاضنة هود زراعة الأنسجة.
3. إزالة لامينين من كل ساترة واستبدله مع 100 ميليلتر من تعليق الرتب الأخرى.
4. تبني عملية شريان الحياة في 37 °C/5% CO₂ الحاضنة لمدة أقصاها 45 دقيقة لتعزيز التصاق را إلى كوفيرسليبس.
5. بعد الحضانة، إزالة لوحات 24-جيدا من الحاضنة. الفيضانات كل جيدا لصفيحة 24-جيدا مع 500 ميليلتر من الرتب الأخرى انتشار وسائط الإعلام.
6. مكان عملية شريان الحياة مرة أخرى في 37 °C/5% CO₂ الحاضنة ل 24 ساعة إضافية.
7. 24 ساعة بعد عملية شريان الحياة، والطلاء إزالة انتشار وسائط الإعلام واستبدال مع را التمايز وسائل الإعلام للحث على التفرقة.
8. عملية شريان الحياة مرة أخرى في الحاضنة ولا تقم بإزالة حتى الخلايا جاهزة للتثبيت.
   ملاحظة: التغيرات في درجة الحموضة الضارة لعملية شريان الحياة وتقليل بقاء الخلية، ولذا ينبغي تجنب إزالة لا لزوم لها من الثقافات شريان الحياة للسودان من الحاضنة.

6-الفلورة تلطيخ

1. للكشف عن الخلية علامات السطحية (NG2 O1 و O4)، قم بإزالة الوسائط من الآبار.
2. إضافة 250 ميليلتر من الماوس هيبريدوما supernatants تحتوي على الأجسام المضادة الأولية ضد O1 (مخفف)¹³ و O4 (مخفف)¹³ وارنب [بولكلونل] ضد NG2 (1:150 المخفف في B27NBMA).
   ملاحظة: إذا كانت الأجسام المضادة O1 المضادة ومكافحة O4 المتاحة تجارياً لاستخدامها، من المستصوب الاستفادة من تخفيف اقترحتها الشركة المصنعة.
3. احتضان الخلايا بجسم الابتدائي لمدة 45 دقيقة كحد أقصى في 37 °C/5% CO₂ حاضنة.
4. تغسل مرتين مع 0.05% توين-20/1 X برنامج تلفزيوني. إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4% (4% منهاج العمل) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. تغسل ثلاث مرات لمدة كل 5 دقائق مع 0.05% توين-20/1 X برنامج تلفزيوني.
6. تمييع الماعز مترافق 488 أليكسا الماوس المضادة IgM أو أرنب المضادة مفتش الثانوي جسم (1: 400) في B27NBMA.
7. إزالة برنامج تلفزيوني العاشر توين-20/1 0.05% من كوفيرسليبس. احتضان الخلايا مع الجسم المضاد الثانوي ح 1 في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
8. تغسل ثلاث مرات لمدة كل 5 دقائق مع 0.05% توين-20/1 X برنامج تلفزيوني.
9. لتلطيخ مزدوجة للكشف عن علامات الداخلية (توصيني)، إزالة توين-20/1 0.05% الخلايا X برنامج تلفزيوني وكتلة/بيرميبيليزي مع المخزن المؤقت كتلة/بيرميبيليزيشن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وإلا انتقل إلى الخطوة 6.17.
10. إزالة كتلة/permeabilization المخزن المؤقت وإضافة 250 ميليلتر الدجاج مكافحة--توصيني (1: 100) المخفف في المخزن المؤقت لكتلة/بيرميبيليزيشن.
11. احتضان الخلايا مع توصيني المناهضة ح 1 في درجة حرارة الغرفة. تغسل ثلاث مرات لمدة كل 5 دقائق مع 0.05% توين-20/1 X برنامج تلفزيوني.
12. تمييع الماعز مترافق 594 أليكسا الدجاج المضادة مفتش الثانوي جسم (1: 400) في B27NBMA.
13. إزالة برنامج تلفزيوني العاشر توين-20/1 0.05% من كوفيرسليبس. احتضان الخلايا مع الجسم المضاد الثانوي ح 1 في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
14. تغسل ثلاث مرات لمدة كل 5 دقائق مع 0.05% توين-20/1 X برنامج تلفزيوني.
15. كونتيرستين مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) وجبل الخلايا مع تصاعد الوسائط التي تحتوي على DAPI أنتيفادي.
16. كوفيرسليبس علاج بين عشية وضحاها في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
17. صورة الخلايا الملون مع مجهر ابيفلوريسسينسي.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، تم تصويرها في الخلايا في 40 X التكبير باستخدام وقت تعرض موحدة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وكان الغرض من هذه الدراسة لإنشاء أسلوب عزل محسنة ل O4⁺ أوليجوديندروسيتيس الماوس الأساسية التي تتطلب أقل قدر ممكن التلاعب بالخلايا الهدف. يأخذ الإجراء بأكمله من القتل الرحيم الجراء لطلاء الخلايا في كوفيرسليبس حوالي 4 ح والبيانات الموضحة هنا تمثل ثلاث تجارب مستقلة. ب?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذه الرسالة، نقدم طريقة لعزل الماوس غير ناضجة جداً المنقي oligodendrocyte الثقافات تتسم بالكفاءة. بالمقارنة مع البروتوكولات المنشورة سابقا^39،40، أثمر هذا الأسلوب درجة نقاء أعلى بمستوى أقل بكثير من الإيجابية توصيني astrocytes ونسبة منخفضة جداً من الخلايا الأخرى غير ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10ml serological pipets	Fisher Scientific	13-676-10J
10ml syringe Luer-Loc tip	BD, Becton Dickinson	309604
15ml conical tubes	Falcon	352097
24-well tissue culture plates	Falcon	353935
40µm cell strainer	Fisher Scientific	22368547
50ml conical tubes	Falcon	352098
5ml serological pipets	Fisher Scientific	13-676-10H
60mm tissue culture plates	Falcon	353002
70µm cell strainer	Fisher Scientific	22363548
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A11001
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A21042
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A11008
Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A11042
Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-094-543
Apo-Transferrin human	Sigma	T1147
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml	USA Scientific	6032-1101
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml	USA Scientific	6032-1102
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044
Boric acid	Sigma	B7660
Bovine Growth Serum (BGS)	GE Healthcare Life Sciences	SH30541.03
BSA	Fisher Scientific	BP-1600-100
CNTF	Peprotech	450-50
d-Biotin	Sigma	B4639
Desoxyribonuclease I (DNAse I)	Worthington	LS002007
EDTA	Fisher Scientific	S311
Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera	Olympus	Bx51
Feather disposable scalpels	Andwin Scientific	EF7281C
Forskolin	Sigma	F6886
German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round	NeuVitro	GG-12-oz
GFAP antibody	Aves	GFAP
Glucose	Fisher Scientific	D16-1
GlutaMAX	Invitrogen	35050-61
Insulin	Invitrogen	12585-014
Magnetic separator stand - MACS multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Magnetic separator-MiniMACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Millex PES 0.22µm filter unit	Millipore	SLG033RS
Mounting media- Prolong Gold with DAPI	Thermo Fisher	P36930
N-acetyl-cysteine (NAC)	Sigma	A8199
Natural mouse laminin	Invitrogen	23017-015
Neurobasal Medium A	Invitrogen	10888-022
Neurotrophin-3 (NT-3)	Peprotech	450-03
NG2 antibody	Millipore	AB5320
Papain	Worthington	LS003126
PBS without Ca2+ and Mg2+	Sigma	D5652
PDGF	Peprotech	100-13A
Petri dishes	Falcon	351029
Poly-D-Lysine	Sigma	P6407
Primocin	Invivogen	ant-pm-2
Progesterone	Sigma	P8783
Putrescine	Sigma	P5780
Selection column-LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
Sodium Selenite	Sigma	S5261
Trace elements B	Corning	25-000-CI
Triiodothyronine (T3)	Sigma	T6397
Triton-X	Sigma	T8787
Trypan Blue Solution	Corning	25-900-CI
Tween 20	Sigma	P1379
B27NBMA			487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 °C until use.
B27NBMA + 10% BGS			27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum
CNTF solution stock (10 µg/ml; 1000X)			Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer’s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 °C. Working solution (10 µg/ml, 1000X) 1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize. 2. Dilute master stock aliquot to 10µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 4. Store aliquots at -80 °C.
d-Biotin stock solution (50 µg/ml; 5000X)			Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 µg/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37°C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10µg/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4°C.
DNase I stock solution			1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice. 2. Filter sterilize on ice 3. Aliquot at 200 µl and freeze overnight at -20°C. 4. Store aliquots at -20 to -30°C.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+)			Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 °C.
Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X)			Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 µl) and store at -20°C.
Hank’s balanced salts (HBSS) (Sigma			1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 °C) in a cylinder and stir gently. 2. Add the power and stir until dissolved. 3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder. 4. Add to the solution in step 2. 5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume. 6. Keep stirring until dissolved. 7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH. 8. Add additional water to bring the final volume to 1L. 9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns. 10. Store at 2-8 °C.
Insulin stock solution (4000 µg/ml)			Thaw the bottle and aliquot 25 µl per microcentrifuge tube and store at -20°C.
Laminin solution			Slowly thaw laminin in the cold (2°C to 8°C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5° C to -20° C in aliquots (e.g. 20 µl) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months.
Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer			Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5µg/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 µm Millex filter. Store the buffer at 4°C until use
N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X)			Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 µl). Store at -20°C.
NT3 stock solution (1 µg/ml; 1000X)			Master stock: Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80°C. Working stock (1µg/ml; 1000X): 1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize. 2. Dilute master stock aliquot to 1 µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 4. Store aliquots at -80°C.
PDGF stock solution (10 µg/ml; 1000X)			Master stock: Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80°C. Working stock (1µg/ml; 1000X): 1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize. 2. Dilute master stock aliquot to 1µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 4. Store aliquots at -80°C.
Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X)			Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100µl/tube). Store at -20°C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 µg/ml in sterile water.
Oligodendrocyte proliferation media			see Supplementary Table 1
Oligodendrocyte differentiation media			see Supplementary Table 1
Sato supplement (100X)			see Supplementary Table 1
References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))