العلاج البطيني داخل المنظار مع Resiniferatoxin واختبارات الألم في الفئران

Summary

وقد اقترح مستقبلات عابرة نوع الفانيليايد المحتملة 1 (TRPV1) في المنطقة فوق مستوى السكان للعب بعض الأدوار في وظيفة الدماغ. هو موضح هنا بروتوكول للحقن intracerebrobrotricular من resiniferatoxin لتجاوز مستوى الحساسية TRPV1 في الفئران. كما يتم عرض إجراءات لبعض اختبارات الألم.

Abstract

ومن المعروف أن مستقبلات عابرة من النوع الفانيليا 1 (TRPV1)، قناة الموجبة الحرارية، لتحريك الألم في الأعصاب الطرفية. بالإضافة إلى وظيفتها الطرفية، وقد اقترح أيضا مشاركتها في وظائف الدماغ. وقد عرف Resiniferatoxin (RTX) ، وهو ناهض TRPV1 فائقة القدرة ، للحث على إزالة الحساسية على المدى الطويل من TRPV1 ، وكان هذا إزالة الحساسية نهجا بديلا للتحقيق في الأهمية الفسيولوجية للخلايا التعبير عن TRPV1. هنا نحن وصف بروتوكول لعلاج intracerebrobrotricular (i.c.v.) مع RTX في الفئران. يتم وصف الإجراءات لاختبار nociception لحفز TRPV1 الطرفية (اختبار RTX) والتحفيز الميكانيكي (اختبار ضغط الذيل) ثم اتبع. على الرغم من أن الاستجابات nociceptive من الفئران التي كانت تدار RTX i.c.v. كانت مماثلة لتلك التي من مجموعات التحكم، كانت الفئران RTX-i.c.v.تدار غير حساسة للتأثير مسكن من اسيتامينوفين، مما يشير إلى أن i.c.v. العلاج RTX يمكن أن تحفز إزالة الحساسية TRPV1 فوق مستوى الجنين انتقائية. ويمكن استخدام هذا النموذج الماوس كنظام تجريبي مناسب لدراسة دور TRPV1 في وظيفة الدماغ / فوق مستوى العمود الفقري. ويمكن أيضا تطبيق هذه التقنيات على دراسات الإجراءات المركزية للأدوية الأخرى.

Introduction

تتلقى الحيوانات العديد من المحفزات الفيزيائية والكيميائية من بيئتها من خلال أجهزة الاستشعار على الأعصاب الطرفية. مستقبلات عابرة المحتملة نوع الفانيليا 1 (TRPV1) هي واحدة من الترسيمترية، قنوات الموجبة غير انتقائية التي تعمل كمستشعرات الحرارة^1،2، ومن المعروف تفعيل و / أو تعديل TRPV1 لتكون خطوة رئيسية لالنابية في كل من السياقات العادية والتهابات³. على الرغم من أن نمط التعبير العام مثير للجدل ، فإن التعبير عن TRPV1 قد اقترح أيضًا في المناطق فوق مستوى العمود الفقري ، حيث يشارك في أنشطة مختلفة في الدماغ (بما في ذلك nociception⁴، thermoregulation⁵، القلق⁶، اضطراب فرط النشاط في عجز الانتباه⁷، والصرع⁸). وعلاوة على ذلك، فقد اقترح مؤخرا أن اسيتامينوفين، وهو مسكن للألم المستخدمة على نطاق واسع، يتوسط تفعيل TRPV1 المركزية لانتزاع عملها مسكن^9،10.

إدارة ناهض TRPV1 الزائدة بما في ذلك الكابسايسين وراتنجيفراتوشين (RTX) إلى الحيوانات يؤدي إلى موت الخلايا العصبية TRPV1 إيجابية وطويلة الأمد إزالة الحساسية لناهضات TRPV1^11,12. جنبا إلى جنب مع التطبيق المحلي (داخلthecal^13،14، intracisternal^15،16،17، و intraganglional¹⁸) ، وقد وفرت هذه الطريقة الاستئصال الكيميائية وسيلة بديلة للتحقيق في الوظائف الفسيولوجية من TRPV1. لقد أبلغنا مؤخرا أن حقن intracerebrobrotricular (i.c.v.) من RTX يمنع تأثير مسكن من الأسيتامينوفين في الفئران، مما يشير إلى أن الحساسية TRPV1 فوق مستوى^{انتقائية 19}. في هذه المخطوطة، نقدم البروتوكول الدقيق لحقن i.c.v. واختبارات الألم اللاحقة.

الحقن المباشر للأدوية في البطينين في الدماغ يجعل من الممكن لدراسة آثارها المركزية في حين الحد من أي آثار هامشية. إجراء الحقن i.c.v. المقدمة هنا هو تعديل للطريقة التي ذكرتها هالي وماكورميك²⁰. هذه الطريقة بسيطة تنطوي على إدخال إبرة الحقن في البطينين الجانبي من خلال خياطة الإكلين ولا تتطلب أي معدات خاصة أو إجراءات جراحية للتكبيل.

التطبيق المحلي المحيطي لـ TRPV1 يثير إحساسًا بألم حارق والتهاب عصبي. الفئران التي يتم التعامل معها بشكل نظامي مع RTX، و الفأر TRPV1-KO، غير حساسة لهذا التحفيز¹³. لقد قمنا بالحقن داخل محطة الإذاعة والتلفزيون (RTX) لتأكيد الحفاظ على TRPV1 الطرفية في RTX-i.c.v. الفئران. هذا الأسلوب هو تعديل للتقليدية formalin اختبار²¹.

وقد أفيد أن الفئران تعامل بشكل نظامي مع RTX و TRPV1- KO الفئران تظهر عتبة طبيعية للمحفزات الميكانيكية^11,13,22. هنا نقدم إجراء لاختبار ضغط الذيل لاختبار التغييرات في تأثير مسكن أسيتامينوفين.

كل هذه الإجراءات هي الأرثوذكسية وتنوعا، ويمكن تطبيقها على دراسات الأدوية الأخرى.

Protocol

وقد وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوانات التابعة لجامعة موساشينو على جميع البروتوكولات التجريبية المستخدمة هنا. تم الاحتفاظ بالفئران DdY الذكور (SLC, Shizuoka, Japan) لمدة 7 أيام على الأقل تحت دورة ضوء/داكنة 12-h قبل إجراء تجارب مع الماء والغذاء الإعلان libitum. 5- فئران عمرها 6 أسابيع استخدمت للتجارب.

1- تحضير المخدرات

1. Rtx
   ملاحظة: يمكن أن يسبب حل RTX الكحولي حروقًا شديدة في الجلد وتلفًا للعين. تأكد من استخدام قفازات مطاطية ونظارات للحماية عند التعامل معها. يمكن استخدام هذا الحل للمخزون لمدة 6 أشهر.
   1. إضافة 500 μL من الإيثانول إلى 1 ملغ من RTX.
   2. إضافة 500 ميكرولتر من البولي أوكسي إثيلين (20) monooleate السوربيتان إلى الحل أعلاه ودوامة جيدا.
   3. إضافة 4 مل من المالحة الفسيولوجية إلى الخليط ودوامة جيدا.
   4. Aliquot 40 ميكرولتر من الحل إلى أنابيب قبعة مسامير 1.5 مل، وتخزينها عند -40 درجة مئوية.
2. اسيتامينوفين
   1. إضافة 20٪ ث / v propyleneglycol حل لاسيتامينوفين بتركيز 30 ملغ / مل, وتذوب مع sonicator. منذ الأسيتامينوفين قد تترسب في درجة حرارة الغرفة عدة ساعات بعد حل, الاستعداد فقط قبل استخدام أو الحفاظ على الحل دافئة حتى الاستخدام.

2. حقن تحت الجلد أو داخل الجمجمة البطينية من RTX

1. اذيب المحلّل المخزن المعدّ في 1.1. أعلاه وتمييعه إلى 20 ميكروغرام / مل في السائل النخاعي الملحي أو الاصطناعي (ACSF) التي تتكون من (في mM): 119 NaCl، 2.5 KCl، 1 NaH₂PO_4،26 NaHCO_3،11 جلوكوز، 1.3 MgSO_4،2.5 CaCl₂ توازن مع 95٪ O₂ و 5٪ CO₂ (pH 7.2).
2. تخدير الفئران مع ملح الصوديوم pentobarbital (60 ملغ / كغ، intraperitoneally)، والتحقق من فقدان منعكس الحق.
3. لعلاج s.c. ، حقن RTX (20 ميكروغرام / مل) في الجزء الخلفي من الرقبة في حجم 0.1 مل / 10 غرام من وزن الجسم. بالنسبة لمجموعة التحكم، قم بحقن السيارة (10٪ إيثانول، 10٪ بوليوكسي إثيلين (20) مونووليات السوربيتان و 80٪ ملحي) بنفس الطريقة.
4. بالنسبة للعلاج i.c.v. ، قم بحقن 5 ميكرولتر من RTX (20 ميكروغرام / مل) في البطين الجانبي الأيمن. بالنسبة لمجموعة التحكم، قم بحقن السيارة (10٪ إيثانول، 10٪ من البولي أوكسي إثيلين (20) مونووليات السوربيتان و 80٪ ACSF) بنفس الطريقة.
   1. تمرير إبرة 27-G المتاح من خلال أنبوب معدني (0.8 مم م. د.) لفضح 3.0-3.5 ملم طرف الإبرة (الشكل 1A).
   2. تطهير رأس الفأرة مع الكحول 70٪ ، وعقد عظام squamosal من الفأر بحزم مع الأصابع (الشكل 1B).
      ملاحظة: انتبه إلى مواقف نتوءات squamosal، لأن هذه النتوءات ستكون بمثابة معالم للحقن.
   3. حرك الإبرة بشكلٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍّيّ على فروة الرأس، وَجدَ خياطة القوس حيث أنّ طرف الإبرة مُرَكَّب على الغرزة.
   4. حرك التلميح حوالي 1 مم إلى اليمين، ثم حرك التلميح بشكل مُجَرّد، ثم ابحث عن خياطة الإكلال كما هو الحال مع 2.4.3. (الشكل 1B).
   5. أدخل الإبرة ببطء وعموديا، وحقن محلول RTX في حوالي 10 ثوان، واحملها لمدة 10 ثوانٍ.
   6. سحب الإبرة ببطء، والعودة إلى قفص الماوس المنزل. عادة ما يكون النزيف ضئيلًا أو غائبًا. إذا حدث نزيف كبير، ينبغي النظر في استخدام ماوس آخر.
5. تعيين الفئران المعالجة المسبقة كمواضيع لاختبار RTX أو اختبار ضغط الذيل (الخطوة 3 و 4، على التوالي).

3. اختبار RTX

ملاحظة: يتم إجراء الاختبار بين الساعة 10:00 صباحًا والساعة 5:00 مساءً. يتم الحفاظ على غرفة الاختبار في 200 لوكس و 24-26 درجة مئوية.

1. بعد أسبوع من المعالجة المسبقة مع RTX (الخطوة 2. ) ، قم بنقل الفئران إلى غرفة الاختبار قبل 60 دقيقة على الأقل من بدء الاختبار.
2. وزن ووضع كل فأرة على حدة في قفص زجاج شبكي (29.5 × 17.5 × 13.5 سم³ ارتفاع) على الأقل 30 دقيقة قبل بدء الاختبار من أجل السماح لها بالتأقلم مع البيئة.
   ملاحظة: يجب أن يكون ترتيب الاختبارات موازن عبر مجموعات المعالجة المسبقة.
3. يُعطى الأسيتامينوفين (300 ملغ/كغ) إلى الماوس داخل الصفاق 20 دقيقة قبل الاختبار.
4. أمسك الماوس بشكل فضفاض في كيس من القماش الصغير، وأدخل إبرة من عيار 30 في كعب مخلب الظهر الأيمن. تقدم الإبرة تحت الجلد إلى قرب منصات المشي، وحقن 20 ميكرولتر من محلول RTX (0.05 ميكروغرام/مل).
5. قياس فترة لعق / العض السلوك في المنطقة theglabrous من مخلب المتضررة في كل كتلة 5 دقائق.

4. اختبار ضغط الذيل

ملاحظة: يتم استخدام مقياس الضغط من نوع راندال-Selitto لتقييم عتبة الناوستستين الميكانيكي الحاد. يتم إجراء الاختبار بين الساعة 10:00 صباحًا والساعة 5:00 مساءً. يتم الحفاظ على غرفة الاختبار في 200 لوكس و 24-26 درجة مئوية.

1. بعد أسبوع واحد من المعالجة المسبقة مع RTX (الخطوة 2.) ، نقل الفئران إلى غرفة الاختبار ، ووزن ووضع كل فأرة على حدة في قفص زجاج شبكي.
2. ضع علامة على البقع على 1.5 و 2.5 سم من قاعدة الذيل.
3. عقد الماوس فضفاضة في كيس من القماش الصغيرة، وتطبيق الضغط على البقع مع مسبار حادة.
   ملاحظة: يتم فرض ضغط قطع 250 غرام لتجنب تلف الأنسجة.
4. تحديد الضغط المطلوب لانتزاع سلوك الهروب (ذيل الخفقان، التواء، والصرير)، وحساب عتبة nociceptive عن طريق متوسط الضغط المحدد في البقعتين.
5. كرر الخطوات 4.3. إلى 4.4. كل 15 دقيقة.
6. بعد الحصول على خط الأساس، قم بإعطاء الأسيتامينوفين (300 ملغ/كغ) إلى الفأر داخل الصفاق. بعد الإدارة، كرر الخطوات 4.3. و4.4 كل 15 دقيقة.

النتائج

لا تظهر الفئران المعالجة بالـ i.c.v.- أي تشوهات ظاهرة في مظهرها، وأنشطتها العفوية، ووزن الجسم¹⁹ ودرجة حرارة الجسم الأساسية (المجموعة المعالجة بالمركبات، 38.4 ± 0.3 درجة مئوية، ن = 6؛ مجموعة معالجة RTX، 38.7 ± 0.2 درجة مئوية، ن = 6).

Discussion

الخطوة الأكثر أهمية في هذه التجارب هو نجاح حقن i.c.v. تقنية الحقن i.c.v. المستخدمة هنا بسيطة جدا ولكنها تتطلب بعض الممارسة. قبل التجارب، ينصح ممارسة مع الأصباغ (على سبيل المثال 0.5٪ trypan الأزرق في المالحة). إذا تم إجراء الحقن بشكل صحيح ، يجب أن تكون علامة الإبرة واضحة على خياطة الإكليل وينبغي أن تكو...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Resiniferatoxin	LKT Laboratories	R1774	used for s.c./i.c.v. pretreatments and the RTX test
Acetaminophen	IWAKI SEIYAKU		gifted from IWAKI SEIYAKU
Pentobarbital sodium salt	Tokyo Chemical Industry	P0776	used for anesthesia
Ethanol (99.5)	Wako Pure Chemical Industries	057-00456	used for dissolving RTX
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monooleate	Wako Pure Chemical Industries	161-21621	used for dissolving RTX
25 μL microsyringe	Hamilton	1702LT	used for i.c.v. injection
100 μL microsyringe	Hamilton	1710LT	used for intraplantar injection
26-gauge disposable needle	TERUMO	NN-2613S	used for i.c.v. injection
30-gauge disposable needle	NIPRO	01134	used for intraplantar injection
Pressure meter	Ugo Basile	Analgesy-Meter Type 7200	used for tail pressure test