Tratamiento intracerebroventricular con resiniferatoxina y pruebas de dolor en ratones

Resumen

Se ha sugerido que el potencial de vaniloide de receptor transitorio tipo 1 (TRPV1) en la región supraespinal desempeña algunos papeles en la función cerebral. Aquí se describe un protocolo para la inyección intracerebroventricular de resiniferatoxina para la desensibilización supraespinal TRPV1 en ratones. También se presentan procedimientos para algunas pruebas de dolor.

Resumen

Se sabe que el potencial de vaniloide de receptor transitorio tipo 1 (TRPV1), un canal catiónico termosensible, desencadena dolor en los nervios periféricos. Además de su función periférica, también se ha sugerido su implicación en las funciones cerebrales. Se sabe que la resiniferatoxina (RTX), un agonista trPV1 ultrapotente, induce la desensibilización a largo plazo de TRPV1, y esta desensibilización ha sido un enfoque alternativo para investigar la relevancia fisiológica de las células que expresan TRPV1. Aquí describimos un protocolo para el tratamiento intracerebroventricular (i.c.v.) con RTX en ratones. Los procedimientos se describen para probar la nocisión a la estimulación periférica TRPV1 (prueba RTX) y la estimulación mecánica (prueba de presión de cola) y luego seguir. Aunque las respuestas nociceptivas de los ratones a los que se había administrado RTX i.c.v. eran comparables a las de los grupos de control, los ratones administrados por RTX-i.c.v. eran insensibles al efecto analgésico del paracetamol, lo que sugiere que el tratamiento i.c.v. RTX puede inducir la desensibilización TRPV1 supraespinal-selectiva. Este modelo de ratón se puede utilizar como un sistema experimental conveniente para estudiar el papel de TRPV1 en la función cerebral/supraespinal. Estas técnicas también se pueden aplicar a los estudios de las acciones centrales de otros fármacos.

Introducción

Los animales reciben diversos estímulos físicos y químicos de su entorno a través de sensores en los nervios periféricos. El potencial de receptor transitorio tipo 1 (TRPV1) es uno de los canales catiónicos termosensibles y no selectivos que actúan como sensores de calor^1,2, y la activación y/o modulación de TRPV1 se sabe que es un paso clave para la nocisión en contextos normales e inflamatorios^3. Aunque el patrón de expresión general es controvertido, la expresión de TRPV1 también se ha sugerido en regiones supraespinales, participando en diversas actividades cerebrales (incluyendo nocicepción^4,termorregulación⁵, ansiedad⁶, trastorno por déficit de atención con hiperactividad⁷, y epilepsia⁸). Por otra parte, recientemente se ha sugerido que el paracetamol, un analgésico ampliamente utilizado, media la activación del TRPV1 central para provocar su acción analgésica^9,10.

La administración del exceso de agonista TRPV1 incluyendo capsaicina y resiniferatoxina (RTX) a los animales conduce a la muerte de las neuronas TRPV1-positivas y la desensibilización de larga duración a los agonistas TRPV1^11,12. Combinado con la aplicación local (intratecal^13,14, intracisternal^15,16,17, y intraganglional¹⁸), este enfoque de ablación química ha proporcionado una forma alternativa de investigar las funciones fisiológicas de TRPV1. Recientemente hemos informado de que la inyección intracerebroventricular (i.c.v.) de RTX inhibe el efecto analgésico del paracetamol en ratones, lo que sugiere la desensibilización TRPV1 supraspinal-selectiva¹⁹. En este manuscrito, presentamos el protocolo preciso para la inyección i.c.v. y las pruebas de dolor posteriores.

La inyección directa de fármacos en los ventrículos del cerebro permite estudiar sus efectos centrales mientras se minimizan los efectos periféricos. El procedimiento de inyección i.c.v. presentado aquí es una modificación del método reportado por Haley y McCormick²⁰. Este método es simple que implica la inserción de una aguja de inyección en los ventrículos laterales a través de la sutura coronal y no requiere ningún equipo especial o procedimientos quirúrgicos para la cannulación.

La aplicación local periférica de los agonistas TRPV1 evoca una sensación de dolor ardiente e inflamación neurogénica. Los ratones que se tratan sistémicamente con ratones RTX y TRPV1-KO son insensibles a esta estimulación¹³. Hemos realizado inyección intraplantar de RTX (prueba RTX) para confirmar la preservación del TRPV1 periférico en RTX-i.c.v. Ratones. Este método es una modificación de la prueba de formalina convencional²¹.

Se ha informado que los ratones tratados sistémicamente con ratones RTX y TRPV1-KO muestran un umbral normal a los estímulos mecánicos^11,13,22. Aquí presentamos un procedimiento para la prueba de presión de la cola para probar los cambios en el efecto analgésico del paracetamol.

Todos estos procedimientos son ortodoxos y versátiles, y se pueden aplicar a estudios de otros fármacos.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales utilizados aquí fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad musa de Musashino. Los ratones machos ddY (SLC, Shizuoka, Japón) se mantuvieron durante al menos 7 días bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas antes de los experimentos con agua y alimentos ad libitum. Para los experimentos se utilizaron ratones de 5 o 6 semanas de edad.

1. Preparación de drogas

1. Rtx
   NOTA: La solución alcohólica RTX puede causar quemaduras graves en la piel y daños en los ojos. Asegúrese de usar guantes y gafas de goma para protegerse durante la manipulación. Esta solución de stock se puede utilizar durante 6 meses.
   1. Añadir 500 l de etanol a 1 mg de RTX.
   2. Añadir 500 l de polioxietileno (20) monooleato de sorbitano a la solución anterior y el vórtice.
   3. Añadir 4 ml de solución salina fisiológica a la mezcla y al vórtice.
   4. Aliquot 40 l de la solución en tubos de tapa de tornillo de 1,5 ml, y guárdelos a -40 oC.
2. Acetaminofén
   1. Añadir 20% v de solución de propilenglicol al paracetamol a una concentración de 30 mg/ml, y disolver con un sonicador. Dado que el paracetamol puede precipitarse a temperatura ambiente varias horas después de la disolución, preparar justo antes de usar o mantener la solución caliente hasta su uso.

2. Inyección subcutánea o intracerebroventricular de RTX

1. Descongelar la solución abastecida preparada en 1.1. arriba y diluirlo a 20 g/ml en líquido cefalorraquídeo salino o artificial (ACSF) que consiste en (en mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 1 NaH₂PO₄, 26 NaHCO₃, 11 glucosa, 1,3 MgSO₄, 2,5 CaCl₂ equilibrado con 95% O₂ y 5% CO₂ (pH 7.2).
2. Anestesiar ratones con sal sódica pentobarbital (60 mg/kg, intraperitonealmente) y comprobar la pérdida del reflejo corrector.
3. Para el tratamiento con s.c., inyecte RTX (20 g/ml) en la parte posterior del cuello a un volumen de 0,1 ml/10 g de peso corporal. Para el grupo de control, inyecte el vehículo (10% etanol, 10% polioxietileno (20) monooleato de sorbitano y 80% de solución salina) de la misma manera.
4. Para el tratamiento con i.c.v., inyecte 5 ml de RTX (20 g/ml) en el ventrículo lateral derecho. Para el grupo de control, inyecte el vehículo (10% etanol, 10% de polioxietileno (20) monooleato de sorbitano y 80% ACSF) de la misma manera.
   1. Pasar una aguja desechable de 27 G a través de un tubo metálico (0,8 mm I.D.) para exponer la punta de 3,0-3,5 mm de la aguja (Figura 1A).
   2. Desinfectar la cabeza del ratón con 70% de alcohol, y mantener los huesos escamosos del ratón firmemente con los dedos (Figura 1B).
      NOTA: Preste atención a las posiciones de las protuberancias escamósticas, ya que estas protuberancias servirán como puntos de referencia para la inyección.
   3. Mueva la aguja lateralmente sobre el cuero cabelludo y busque la sutura sagital a medida que la punta de la aguja está enganchada en la sutura.
   4. Mueva la punta alrededor de 1 mm hacia la derecha, luego mueva la punta rostralmente, y encuentre la sutura coronal como con 2.4.3. (Figura 1B).
   5. Inserte la aguja lenta y verticalmente, inyecte la solución RTX en unos 10 segundos y sostén esta rueda durante unos 10 segundos.
   6. Retire la aguja lentamente y devuelva el ratón a su jaula de origen. El sangrado suele ser mínimo o ausente. Si se produce un sangrado mayor, se debe considerar el uso de otro ratón.
5. Asigne a los ratones pretratados como sujetos para la prueba RTX o la prueba de presión de cola (pasos 3 y 4, respectivamente).

3. Prueba RTX

NOTA: Las pruebas se realizan entre las 10:00 AM y las 5:00 PM. La sala de pruebas se mantiene a 200 lux y 24-26 oC.

1. Una semana después de los pretratamientos con RTX (Paso 2.), transfiera los ratones a la sala de pruebas al menos 60 minutos antes de comenzar la prueba.
2. Pesar y colocar cada ratón individualmente en una jaula de plexiglás (29,5 x 17,5 x 13,5 cm³ de altura) al menos 30 minutos antes de iniciar la prueba con el fin de permitir que se aclimate al medio ambiente.
   NOTA: El orden de las pruebas debe contrarrestarse entre los grupos de pretratamiento.
3. Administrar paracetamol (300 mg/kg) al ratón por vía intraperitoneal 20 min antes del ensayo.
4. Sostenga el ratón libremente en una pequeña bolsa de tela e inserte una aguja de calibre 30 en el talón de la pata trasera derecha. Avance la aguja por vía subcutánea hasta cerca de las almohadillas para caminar e inyecte 20 ml de solución RTX (0,05 g/ml).
5. Mida el período de comportamiento de lamer/morder en la región del rayo de la pata afectada en cada bloque de 5 minutos.

4. Prueba de presión de cola

NOTA: Se utiliza un medidor de presión tipo Randall-Selitto para evaluar el umbral de nocicepción mecánica aguda. Las pruebas se realizan entre las 10:00 AM y las 5:00 PM. La sala de pruebas se mantiene a 200 lux y 24-26 oC.

1. Una semana después de los pretratamientos con RTX (Paso 2.), transfiera ratones a la sala de pruebas, y pese y coloque cada ratón individualmente en una jaula de plexiglás.
2. Marque las manchas a 1,5 y 2,5 cm de la base de la cola.
3. Sostenga el ratón libremente en una pequeña bolsa de tela y aplique presión a las manchas con una sonda contundente.
   NOTA: Se impone una presión de corte de 250 g para evitar daños en los tejidos.
4. Determine la presión necesaria para provocar el comportamiento de escape (golpeo de cola, torsión y chirrido) y calcule el umbral nociceptivo promediando la presión determinada en los dos puntos.
5. Repita los pasos 4.3. a 4.4. cada 15 min.
6. Después de obtener la línea de base, administre paracetamol (300 mg/kg) al ratón por vía intraperitoneal. Después de la administración, repita los pasos 4.3. y 4.4 cada 15 min.

Resultados

Los ratones tratados con i.c.v. no muestran anomalías aparentes en su apariencia, actividades espontáneas, peso corporal¹⁹ y temperatura corporal del núcleo (grupo tratado con vehículos, 38,4 a 0,3 oC, n a 6; Grupo tratado con RTX, 38,7 a 0,2 oC, n a 6).

La Figura 2A-B muestra la capacidad de respuesta de los ratones tratados con s.c.- o i.c.v. a la inyec...

Discusión

El paso más crítico en estos experimentos es el éxito de la inyección i.c.v. La técnica de inyección i.c.v. utilizada aquí es bastante simple, pero requiere un poco de práctica. Antes de los experimentos, se recomienda practicar con tintes (por ejemplo, 0,5% de color azul tripano en solución salina). Si la inyección se realiza correctamente, una marca de aguja debe ser evidente en la sutura coronal y el tinte inyectado debe estar presente en el ventrículo contralateral y el tercer ventrículo. Además, se debe...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Resiniferatoxin	LKT Laboratories	R1774	used for s.c./i.c.v. pretreatments and the RTX test
Acetaminophen	IWAKI SEIYAKU		gifted from IWAKI SEIYAKU
Pentobarbital sodium salt	Tokyo Chemical Industry	P0776	used for anesthesia
Ethanol (99.5)	Wako Pure Chemical Industries	057-00456	used for dissolving RTX
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monooleate	Wako Pure Chemical Industries	161-21621	used for dissolving RTX
25 μL microsyringe	Hamilton	1702LT	used for i.c.v. injection
100 μL microsyringe	Hamilton	1710LT	used for intraplantar injection
26-gauge disposable needle	TERUMO	NN-2613S	used for i.c.v. injection
30-gauge disposable needle	NIPRO	01134	used for intraplantar injection
Pressure meter	Ugo Basile	Analgesy-Meter Type 7200	used for tail pressure test