טיפול תוך-ברובני עם בדיקות Resiniferatoxin וכאב בעכברים

Summary

קולטן ארעי פוטנציאל vanilloid סוג 1 (TRPV1) באזור העל-שדרתי הוצע לשחק כמה תפקידים בתפקוד המוח. מתואר כאן הוא פרוטוקול להזרקה intracerebroventricular של resiniferatoxin עבור desensitization TRPV1 על-שדרתי בעכברים. כמו כן, מוצגים הליכים לבדיקות כאב מסוימות.

Abstract

קולטן ארעי פוטנציאל vanilloid סוג 1 (TRPV1), ערוץ cation תרמוסיבי, ידוע לעורר כאב בעצבים ההיקפיים. בנוסף לתפקוד ההיקפי שלה, מעורבותה בתפקודי המוח הוצעה גם. Resiniferatoxin (RTX), אגוניסט TRPV1 אולטרהpotent, כבר ידוע לגרום לדה-רגישות לטווח ארוך של TRPV1, וdesensitization זה כבר גישה חלופית לחקירת הרלוונטיות הפיזיולוגית של תאים המביעים TRPV1. כאן אנו מתארים פרוטוקול לטיפול תוך-ברוונטרי (i.c.v. ) עם RTX בעכברים. הליכים מתוארים לבדיקת nociception לגירוי TRPV1 היקפי (בדיקת RTX) וגירוי מכני (בדיקת לחץ זנב) ולאחר מכן בצע. למרות התגובות nociceptive של עכברים שניתנו RTX i.c.v. היו דומים לאלה של קבוצות הבקרה, RTX-i.c.v.-מנוהל עכברים היו רגישים לאפקט משכך כאבים של פרצטמול, מציע כי טיפול RTX i.c.v. יכול לגרום לדה-רגישות TRPV1 סלקטיבית על-טבעית. מודל עכבר זה יכול לשמש כמערכת ניסיונית נוחה ללימוד התפקיד של TRPV1 בתפקוד המוח/על-שדרתי. טכניקות אלה ניתן להחיל גם על מחקרים של הפעולות המרכזיות של תרופות אחרות.

Introduction

בעלי חיים מקבלים גירויים פיזיים וכימיים שונים מהסביבה שלהם באמצעות חיישנים על העצבים ההיקפיים. קולטן ארעי פוטנציאל vanilloid סוג 1 (TRPV1) הוא אחד התרמוזים, לא בחירה cation ערוצים הפועלים כמו חיישני^{חום 1,2}, והפעלה ו / או אפנון של TRPV1 ידוע להיות צעד מפתח עבור nociception בהקשרים נורמליים ודלקתיים³. למרות דפוס הביטוי הכולל הוא שנוי במחלוקת, ביטוי של TRPV1 הוצע גם באזורים על-שדרתיים, להיות מעורב בפעילויות מוח שונות (כולל nociception⁴, thermoregulation⁵,^{חרדה 6}, הפרעת קשב^{וריכוז 7}, ואפילפסיה⁸). יתר על כן, לאחרונה הוצע כי פרצטמול, משכך כאבים בשימוש נרחב, מתווכת את ההפעלה של TRPV1 המרכזי כדי לעורר את פעולת משכך^{הכאבים שלה 9,10}.

ניהול עודף TRPV1 אגוניסט כולל קפסאיצין ו resiniferatoxin (RTX) לבעלי חיים מוביל למותם של נוירונים TRPV1 חיובי ו desensitization לטווח ארוך אנטגוניסטים TRPV1^11,12. בשילוב עם היישום המקומי^{(תוך-תקל 13,,14},^{תוך-15,,16,,17}ו-intraganglional^18),גישה זו של אבלציה כימית סיפקה דרך חלופית לחקור את הפונקציות הפיזיולוגיות של TRPV1. לאחרונה דיווחנו כי הזרקת intracerebroventricular (i.c.v.) של RTX מעכב את ההשפעה משכך כאבים של פרצטמול בעכברים, מציע supraspinal סלקטיבי TRPV1 desensitization¹⁹. בכתב היד הזה, אנו מציגים את הפרוטוקול המדויק להזרקת I.C.V. ובדיקות כאב עוקבות.

הזרקה ישירה של תרופות לחדרי המוח מאפשרת ללמוד את ההשפעות המרכזיות שלהם תוך מינימליזציה של כל השפעות היקפיות. הליך ההזרקה i.c.v. המוצג כאן הוא שינוי של השיטה שדווחה על ידי היילי ומקקורמיק²⁰. שיטה זו היא פשוטה הכרוכה החדרה של מחט הזרקה לתוך החדרים לחוץ דרך תפר הקורונה ואינה דורשת כל ציוד מיוחד או הליכים כירורגיים עבור קנטוריה.

יישום מקומי היקפי של אגוניסטים TRPV1 מעורר תחושת כאב בוער ודלקת נוירוגנית. עכברים שטופלו באופן שיטתי בעכברי RTX ו- TRPV1-KO אינם רגישים לגירוי זה¹³. ביצענו הזרקת תוך פלנטר של RTX (בדיקת RTX) כדי לאשר את השימור של TRPV1 היקפי ב RTX-i.c.v. עכברים . שיטה זו היא שינוי של מבחן פורמלין קונבנציונלי²¹.

דווח כי עכברים שטופלו באופן שיטתי בעכברי RTX ו- TRPV1-KO מראים סף רגיל^{לגירויים}מכניים 11^,13,22. כאן אנו מציגים הליך לבדיקת לחץ הזנב לבדיקת שינויים באפקט משכך כאבים של פרצטמול.

כל ההליכים הללו הם אורתודוקסיים ורב-תכליתיים, ותוכלים ליישם אותם במחקרים של תרופות אחרות.

Protocol

כל הפרוטוקולים הניסיוניים המשמשים כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ושימוש של אוניברסיטת Musashino. עכברי ddY זכר (SLC, Shizuoka, יפן) הוחזקו לפחות 7 ימים תחת מחזור אור / כהה 12 שעות לפני ניסויים עם מים ומזון אד libitum. עכברים בני 5 או 6 שבועות שימשו לניסויים.

1. הכנת סמים

1. RTX מחזירה את תחביר ה
   הערה: פתרון RTX אלכוהולי עלול לגרום לכוויות חמורות בעור ולנזק לעיניים. הקפד להשתמש בכפפות גומי ומשקפיים להגנה בעת הטיפול. ניתן להשתמש בפתרון מניות זה במשך 6 חודשים.
   1. להוסיף 500 μL של אתנול 1 מ"ג של RTX.
   2. להוסיף 500 μL של פוליאוקסיאתילן (20) מונוולט סורביטן לפתרון לעיל ומערבולת גם.
   3. מוסיפים 4 מ"ל של תמיסת מלח פיזיולוגית לתערובת ומערבלת היטב.
   4. Aliquot 40 μL של הפתרון לתוך צינורות 1.5 מ"ל מכסה בורג, ולאחסן אותם ב -40 °C.
2. פרצטמול (אצטמול)
   1. להוסיף 20% w / v פרופילןגליקול פתרון פרצטמול בריכוז של 30 מ"ג / מ"ל, ולהמיס עם sonicator. מאז פרצטמול עשוי לזרז בטמפרטורת החדר כמה שעות לאחר הפירוק, להכין ממש לפני השימוש או לשמור על הפתרון חם עד השימוש.

2. הזרקת תת עורית או תוך-עורית של RTX

1. להפשיר את הפתרון מצויד מוכן ב 1.1. מעל ולדלל אותו ל 20 μg / מ"ל בנוזל מוחי שדרתי תמיסת מלח או מלאכותי (ACSF) המורכב (ב mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 1 NaH₂PO₄, 26 NaHCO₃, 11 גלוקוז, 1.3 MgSO₄, 2.5 CaCl₂ שווה עם 95% O_{2 ו} 5% CO₂ (pH 7.2).
2. להרדמה עכברים עם מלח נתרן פנטוברביטל (60 מ"ג/ק"ג, תוך-זמנית), ולבדוק אם יש אובדן הרפלקס הנכון.
3. לטיפול S.C., להזריק RTX (20 μg / מ"ל) לתוך החלק האחורי של הצוואר בנפח של 0.1 מ"ל / 10 גרם משקל גוף. עבור קבוצת הביקורת, להזריק את הרכב (10% אתנול, 10% פוליאוקסיאתילן (20) מונוולט סורביטן ו 80% תמיסת מלח) באותו אופן.
4. לטיפול i.c.v. , להזריק 5 μL של RTX (20 μg / מ"ל) לתוך החדר הימני לכיוון. עבור קבוצת הביקורת, להזריק את הרכב (10% אתנול, 10% פוליאוקסיאתילן (20) מונוולט סורביטן ו 80% ACSF) באותו אופן.
   1. להעביר מחט חד פעמית 27-G דרך צינור מתכת (0.8 מ"מ I.D. ) כדי לחשוף את קצה 3.0-3.5 מ"מ של המחט(איור 1A).
   2. חיטו את ראש העכבר עם 70% אלכוהול, והחזיקו את עצמות העכבר בחוזקה עם האצבעות(איור 1B).
      הערה: שים לב לתנוחות של בלטים סקוומוסליים, מאז בלטים אלה ישמשו ציוני דרך להזרקה.
   3. להזיז את המחט לרוחב על הקרקפת, ולמצוא את התפר sagittal כמו קצה המחט הוא מכור על התפר.
   4. מעבירים את הקצה כ-1 מ"מ ימינה, ואז מזיזים את הקצה בכיוון ה-rostrally, ומצאו את תפר הקורונה עם 2.4.3. (איור1B).
   5. הכנס את המחט לאט ובמאונך, הזרק את פתרון RTX תוך כ-10 שניות והחזק אותה למשך כ-10 שניות.
   6. משוך את המחט לאט, ולהחזיר את העכבר לכלוב הבית שלה. דימום הוא בדרך כלל מינימלי או נעדר. אם מתרחש דימום גדול, יש לשקול שימוש בעכבר אחר.
5. הקצה את העכברים שטופלו מראש כנבדקים למבחן RTX או למבחן לחץ הזנב (שלב 3 ו- 4, בהתאמה).

3. מבחן RTX

הערה: הבדיקה מתבצעת בין השעות 10:00-17:00. חדר הבדיקות מתוחזק ב-200 לוקס ו-24-26 מעלות צלזיוס.

1. שבוע לאחר טיפולים מוקדמים עם RTX (שלב 2.), להעביר עכברים לחדר הבדיקה לפחות 60 דקות לפני תחילת הבדיקה.
2. לשקול ולמקם כל עכבר בנפרד בכלוב פרספקס (29.5 × 17.5 × 13.5^{ס"מ 3} גובה) לפחות 30 דקות לפני תחילת הבדיקה כדי לאפשר לו להסתגל לסביבה.
   הערה: יש לאזן את סדר הבדיקות בין קבוצות טיפול מקדים.
3. לתת פרצטמול (300 מ"ג/ק"ג) לעכבר תוך-אפילוניאלי 20 דקות לפני הבדיקה.
4. החזק את העכבר בחופשיות בשקית בד קטנה, והכנס מחט 30-מד לתוך העקב של כף הרגל האחורית הימנית. לקדם את המחט תת עורית ליד רפידות הליכה, ולהזריק 20 μL של פתרון RTX (0.05 μg / מ"ל).
5. למדוד את התקופה של ליקוק / נשך התנהגות באזורglabrous של כף הרגל המושפעת בכל בלוק 5 דקות.

4. בדיקת לחץ זנב

הערה: מד לחץ מסוג רנדל-סליטו משמש להערכת הסף עבור nociception מכני חריפה. הבדיקה מתבצעת בין השעות 10:00-17:00. חדר הבדיקות מתוחזק ב-200 לוקס ו-24-26 מעלות צלזיוס.

1. שבוע לאחר טיפולים מוקדמים עם RTX (שלב 2.), להעביר עכברים לחדר הבדיקה, ולשקול ולמקם כל עכבר בנפרד בכלוב פרספקס.
2. סמן את הנקודות ב- 1.5 ו- 2.5 ס"מ מבסיס הזנב.
3. החזיקו את העכבר בחופשיות בשקית בד קטנה, והפעילו לחץ על הכתמים באמצעות בדיקה קהה.
   הערה: לחץ ניתק של 250 גרם מוטל כדי למנוע נזק לרקמות.
4. לקבוע את הלחץ הדרוש כדי לעורר התנהגות בריחה (זנב מקציף, פיתול, ו חריקה), ולחשב את הסף nociceptive על ידי ממוצע הלחץ שנקבע בשני הנקודות.
5. חזור על שלבים 4.3. ל-4.4. כל 15 דקות.
6. לאחר קבלת הבסיס, לתת פרצטמול (300 מ"ג/ק"ג) לעכבר תוך-אפילוניאלי. לאחר הניהול, חזור על שלבים 4.3. ו 4.4 כל 15 דקות.

תוצאות

העכברים שטופלו ב-i.c.v. לא מראים חריגות ניכרות במראה שלהם, פעילויות ספונטניות,^{משקל גוף 19 וטמפרטורת} גוף ליבה (קבוצת רכב מטופל, 38.4 ± 0.3 ° C, n = 6; קבוצת RTX שטופלה, 38.7 ± 0.2 °C, n = 6).

איור 2A-B מראה את ההיענות של עכברים...

Discussion

הצעד הקריטי ביותר בניסויים אלה הוא ההצלחה של הזרקת I.C.V. טכניקת הזרקת I.c.v. בשימוש כאן הוא די פשוט אבל דורש קצת תרגול. לפני ניסויים, מומלץ להתאמן עם צבעים (למשל 0.5% טריפאן כחול בתמיסת מלח). אם הזריקה מבוצעת כראוי, סימן מחט צריך להיות ניכר על תפר הקורונה ואת הצבע המוזרק צריך להיות נוכח בחדר ההתפלה ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Resiniferatoxin	LKT Laboratories	R1774	used for s.c./i.c.v. pretreatments and the RTX test
Acetaminophen	IWAKI SEIYAKU		gifted from IWAKI SEIYAKU
Pentobarbital sodium salt	Tokyo Chemical Industry	P0776	used for anesthesia
Ethanol (99.5)	Wako Pure Chemical Industries	057-00456	used for dissolving RTX
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monooleate	Wako Pure Chemical Industries	161-21621	used for dissolving RTX
25 μL microsyringe	Hamilton	1702LT	used for i.c.v. injection
100 μL microsyringe	Hamilton	1710LT	used for intraplantar injection
26-gauge disposable needle	TERUMO	NN-2613S	used for i.c.v. injection
30-gauge disposable needle	NIPRO	01134	used for intraplantar injection
Pressure meter	Ugo Basile	Analgesy-Meter Type 7200	used for tail pressure test