JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Переходный рецептор потенциальных ваниллоид типа 1 (TRPV1) в надспинной области было предложено играть определенную роль в функции мозга. Описано здесь протокол для интрацеребровентрикулярной инъекции смолифератоксина для супраспинальной десенсибилизации TRPV1 у мышей. Процедуры для некоторых обезболивающих тестов также представлены.

Аннотация

Переходный рецептор потенциальных ваниллоид типа 1 (TRPV1), термочувствительный канал катиона, как известно, вызывают боль в периферических нервов. В дополнение к своей периферической функции, его участие в функции мозга также было предложено. Известно, что рецифератоксин (RTX), ультрапотентный агонист TRPV1, вызывает долгосрочную десенсибилизацию TRPV1, и эта десенсибилизация является альтернативным подходом для изучения физиологической значимости клеток, выражаюющих TRPV1. Здесь мы описываем протокол для intracerebroventricular (i.c.v.) обработки с RTX в мышах. Процедуры описаны для тестирования ноцицепции периферической стимуляции TRPV1 (тест RTX) и механической стимуляции (тест давления хвоста), а затем следовать. Хотя ноцицептивные реакции мышей, которые вводились RTX i.c.v. были сопоставимы с ответами контрольных групп, RTX-i.c.v.-administered мышей были нечувствительны к обезболивающему эффекту ацетаминофена, предполагая, что лечение i.c.v. RTX может вызвать супрастинал-селективную десенсибилизацию TRPV1. Эта модель мыши может быть использована в качестве удобной экспериментальной системы для изучения роли TRPV1 в мозге / супраспинальной функции. Эти методы также могут быть применены к исследованиям центральных действий других препаратов.

Введение

Животные получают различные физические и химические стимулы из окружающей среды с помощью датчиков на периферических нервах. Переходный рецептор потенциальных ваниллоид типа 1 (TRPV1) является одним из термочувствительных, неселективных каналов катионации, которые действуюткак датчики тепла 1,2, и активации и / или модуляции TRPV1, как известно, является ключевым шагом для ноцицепции в нормальных и воспалительныхконтекстах 3. Хотя общая модель выражения является спорным, выражение TRPV1 также было предложено в супраспинальных регионах, будучи вовлеченным в различные виды деятельности мозга (в том числе ноцицепции4,терморегуляция 5,тревога 6, синдром дефицитавнимания и гиперактивности 7, иэпилепсия 8). Кроме того, недавно было высказано предположение, что ацетаминофен, широко используемое обезболивающее, опосредует активацию центрального TRPV1, чтобы вызватьего обезболивающее действие 9,10.

Администрация избыточного агониста TRPV1, включая капсаицин и смолифератоксин (RTX) животным, приводит к смерти TRPV1-положительных нейронов и длительной десенсибилизации агонистов TRPV111,12. В сочетании с местным применением(внутритекалные 13,14, intracisternal15,16,17, и интраганглион18), этот химический подход абляции предоставил альтернативный способ исследовать физиологические функции TRPV1. Недавно мы сообщили, что intracerebroventricular (i.c.v.) инъекция RTX подавляет обезболивающее действие ацетаминофена у мышей, предлагая супраспинно-селективной ДЕСЕНСИТизации19. В этой рукописи мы представляем точный протокол для инъекций i.c.v. и последующих обезболивающих тестов.

Прямая инъекция наркотиков в желудочки головного мозга позволяет изучать их центральные эффекты при одновременном минимуме любых периферических эффектов. Процедура инъекций i.c.v., представленная здесь, является модификацией метода, о которого сообщили Хейли и Маккормик20. Этот метод прост, включающий вставку инъекционной иглы в боковой желудочек через корональный шов и не требует специального оборудования или хирургических процедур для канюляции.

Периферическое местное применение агонистов TRPV1 вызывает жжение и нейрогенное воспаление. Мыши, которые системно обрабатываются RTX, и TRPV1-KO мышей, нечувствительны к этой стимуляции13. Мы провели внутриплантарную инъекцию RTX (тест RTX), чтобы подтвердить сохранение периферического TRPV1 в RTX-i.c.v. Мышей. Этот метод является модификацией обычного формалина тест21.

Сообщалось, что мыши системно обработанные RTX и TRPV1-KO мышей показывают нормальный порог механическихстимулов 11,13,22. Здесь мы представляем процедуру теста давления хвоста для тестирования изменений в обезболивающем эффекте ацетаминофена.

Все эти процедуры являются православными и универсальными, и могут быть применены к исследованиям других препаратов.

протокол

Все используемые здесь экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию Университета Мусашино. Мышей-мышей (SLC, Сидзуока, Япония) держали по крайней мере 7 дней под 12-ч свет / темный цикл до экспериментов с водой и пищевой объявление libitum. Для экспериментов использовались 5- или 6-недельные мыши.

1. Подготовка лекарственных средств

  1. Rtx
    ПРИМЕЧАНИЕ: Алкогольное решение RTX может вызвать сильные ожоги кожи и повреждения глаз. Убедитесь в том, чтобы использовать резиновые перчатки и очки для защиты при обработке. Это решение запасов может быть использовано в течение 6 месяцев.
    1. Добавьте 500 л этанола в 1 мг RTX.
    2. Добавьте 500 МКЛ полиоксиэтилена (20) сорбитанового моноолята к раствору выше и хорошо вихрем.
    3. Добавьте 4 мл физиологического солевого раствора в смесь и вихрь хорошо.
    4. Aliquot 40 МКЛ раствора в 1,5-мл винт крышка трубки, и хранить их при -40 градусов по Цельсию.
  2. Ацетаминофен
    1. Добавьте 20% ж/в пропилегликоль раствор ацетаминофен при концентрации 30 мг/мл, и растворить с sonicator. Так как ацетаминофен может осаждать при комнатной температуре через несколько часов после растворения, подготовиться перед использованием или сохранить раствор теплым до использования.

2. Подкожная или интрацеребровентрикулярная инъекция RTX

  1. Оттепель запасного раствора, подготовленного в 1.1. выше и разбавить его до 20 мкг/мл в солевой или искусственной спинномозговой жидкости (ACSF), состоящей из (в mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 12PO4, 26 NaHCO3, 11 глюкозы, 1.3 MgSO4, 2.5 CaCl2 уравновешенный с 95% O2 и 5% CO2 (pH 7.2).
  2. Анестезировать мышей с пентобарбитальной солью натрия (60 мг/кг, intraperitoneally), и проверить на потерю правого рефлекса.
  3. Для лечения с.к. ввимит RTX (20 мкг/мл) в заднюю часть шеи при объеме 0,1 мл/10 г массы тела. Для контрольной группы, впрыскить транспортное средство (10% этанола, 10% полиоксиэтилен (20) сорбитан моноолят и 80% солевой раствор) таким же образом.
  4. Для лечения i.c.v. вводите 5 МКЛ РТХ (20 мкг/мл) в правый боковой желудочек. Для контрольной группы, впрыскить транспортное средство (10% этанола, 10% полиоксиэтилен (20) сорбитан моноолят и 80% ACSF) таким же образом.
    1. Перейдите одноразовые 27-G иглы через металлическую трубку (0,8 мм I.D.), чтобы разоблачить 3,0-3,5 мм кончик иглы(рисунок 1A).
    2. Дезинфицировать голову мыши с 70% алкоголя, и держать плоскоклеточные кости мыши твердо пальцами(рисунок 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание на позиции сквамосальных выступов, так как эти выступы будут служить ориентирами для инъекций.
    3. Переместите иглу боковой на кожу головы, и найти sagittal шов, как кончик иглы зацепили на шве.
    4. Перемести кончик примерно на 1 мм вправо, затем перемести кончик ростральным, и найдите корональный шов как с 2.4.3. (Рисунок 1B).
    5. Вставьте иглу медленно и вертикально, ввежете раствор RTX примерно за 10 секунд и удерживайте его около 10 секунд.
    6. Сверните иглу медленно, и вернуть мышь в свою домашнюю клетку. Кровотечение, как правило, минимально или отсутствует. Если происходит серьезное кровотечение, следует рассмотреть вопрос об использовании другой мыши.
  5. Назначить предварительно обработаемых мышей в качестве субъектов для теста RTX или теста давления хвоста (Шаг 3 и 4, соответственно).

3. Тест RTX

ПРИМЕЧАНИЕ: Тестирование проводится между 10:00 и 17:00. Испытательный зал поддерживается при 200 люкс и 24-26 градусов по Цельсию.

  1. Через неделю после предварительной обработки с RTX (Шаг 2.), передача мышей в испытательный зал по крайней мере за 60 минут до начала теста.
  2. Взвешивайте и поместите каждую мышь по отдельности в клетку из плексигласа (29,5 и 17,5 и 13,5см 3 высоты) по крайней мере за 30 минут до начала теста, чтобы она кламатизировалась к окружающей среде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Порядок испытаний должен быть уравновешен между группами предварительной обработки.
  3. Администрирование ацетаминофен (300 мг/кг) мыши intraperitoneally 20 минут до теста.
  4. Держите мышь свободно в небольшой мешок ткани, и вставьте 30-го калибра иглы в пятку правой задней лапы. Заранее иглы подкожно вблизи пешеходных прокладок, и вводить 20 МКЛ раствора RTX (0,05 мкг/мл).
  5. Измерьте период лизания/кусать поведение в глабрузной области пораженной лапы в каждом 5-минутном блоке.

4. Испытание давления хвоста

ПРИМЕЧАНИЕ: Рэндалл-Селитто типа давления метр используется для оценки порога для острого механического ноцицепции. Тестирование проводится с 10:00 до 17:00. Испытательный зал поддерживается при 200 люкс и 24-26 градусов по Цельсию.

  1. Через неделю после предварительной обработки с RTX (Шаг 2.), передача мышей в испытательный зал, и весят и поместить каждую мышь индивидуально в клетке плексигласа.
  2. Отметь пятна на 1,5 и 2,5 см от основания хвоста.
  3. Держите мышь свободно в небольшой мешок ткани, и применить давление на пятна с тупым зондом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Давление отсечения 250 г налагается, чтобы избежать повреждения тканей.
  4. Определите давление, необходимое для получения поведения побега (хвост взбивания, скручивания и скрипа), и вычислить ноцицептивный порог путем усреднения давления определяется в двух точках.
  5. Повторите шаги 4.3. до 4,4. каждые 15 минут.
  6. После получения базовой линии, управлять ацетаминофен (300 мг/кг) для мыши intraperitoneally. После введения повторите шаги 4.3. и 4,4 каждые 15 минут.

Результаты

I.c.v.-обработанные мыши не показывают никаких явных отклонений в их внешнем виде, спонтаннойдеятельности, массе тела 19 и температуре тела ядра (группа, обработанная транспортным средством, 38,4 и 0,3 градуса по Цельсию, n No 6; Группа, обработанная RTX, 38,7 и 0,2 градус...

Обсуждение

Наиболее важным шагом в этих экспериментах является успех инъекций i.c.v. Техника инъекций i.c.v., используемая здесь, довольно проста, но требует некоторой практики. Перед экспериментами рекомендуется практиковаться с красителями (например, 0,5% трипан-голубого солевого раствора). Если инъе...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, чтобы

Благодарности

Ни один.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
ResiniferatoxinLKT LaboratoriesR1774used for s.c./i.c.v. pretreatments and the RTX test
AcetaminophenIWAKI SEIYAKUgifted from IWAKI SEIYAKU
Pentobarbital sodium saltTokyo Chemical IndustryP0776used for anesthesia
Ethanol (99.5)Wako Pure Chemical Industries057-00456used for dissolving RTX
Polyoxyethylene(20) Sorbitan MonooleateWako Pure Chemical Industries161-21621used for dissolving RTX
25 μL microsyringeHamilton1702LTused for i.c.v. injection
100 μL microsyringeHamilton1710LTused for intraplantar injection
26-gauge disposable needleTERUMONN-2613Sused for i.c.v. injection
30-gauge disposable needleNIPRO01134used for intraplantar injection
Pressure meterUgo BasileAnalgesy-Meter Type 7200used for tail pressure test

Ссылки

  1. Cavanaugh, D. J., Chesler, A. T., Braz, J. M., Shah, N. M., Julius, D., Basbaum, A. I. Restriction of transient receptor potential vanilloid-1 to the peptidergic subset of primary afferent neurons follows its developmental downregulation in nonpeptidergic neurons. J Neurosci. 31 (28), 10119-10127 (2011).
  2. Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389 (6653), 816-824 (1997).
  3. Caterina, M. J., et al. Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science. 288 (5464), 306-313 (2000).
  4. Starowicz, K., et al. Tonic endovanilloid facilitation of glutamate release in brainstem descending antinociceptive pathways. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (50), 13739-13749 (2007).
  5. Gavva, N. R., et al. The vanilloid receptor TRPV1 is tonically activated in vivo and involved in body temperature regulation. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (13), 3366-3374 (2007).
  6. Marsch, R., et al. Reduced anxiety, conditioned fear, and hippocampal long-term potentiation in transient receptor potential vanilloid type 1 receptor-deficient mice. Journal of Neuroscience. 27 (4), 832-839 (2007).
  7. Tzavara, E. T., et al. Endocannabinoids activate transient receptor potential vanilloid 1 receptors to reduce hyperdopaminergia-related hyperactivity: Therapeutic implications. Biological Psychiatry. 59 (6), 508-515 (2006).
  8. Nazıroğlu, M., Övey, &. #. 3. 0. 4. ;. S. Involvement of apoptosis and calcium accumulation through TRPV1 channels in neurobiology of epilepsy. Neuroscience. 293, 55-66 (2015).
  9. Mallet, C., et al. TRPV1 in brain is involved in acetaminophen-induced antinociception. PloS one. 5 (9), 1-11 (2010).
  10. Barrière, D. A., et al. Fatty acid amide hydrolase-dependent generation of antinociceptive drug metabolites acting on TRPV1 in the brain. PloS one. 8 (8), e70690 (2013).
  11. Jancsó, G., Kiraly, E., Jancsó-Gábor, A. Pharmacologically induced selective degeneration of chemosensitive primary sensory neurones. Nature. 270 (5639), 741-743 (1977).
  12. Szallasi, A., Blumberg, P. M. Vanilloid receptor loss in rat sensory ganglia associated with long term desensitization to resiniferatoxin. Neuroscience Letters. 140 (1), 51-54 (1992).
  13. Cavanaugh, D. J., et al. Distinct subsets of unmyelinated primary sensory fibers mediate behavioral responses to noxious thermal and mechanical stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (22), 9075-9080 (2009).
  14. Jeffry, J. A., Yu, S. Q., Sikand, P., Parihar, A., Evans, M. S., Premkumar, L. S. Selective targeting of TRPV1 expressing sensory nerve terminals in the spinal cord for long lasting analgesia. PLoS ONE. 4 (9), e7021 (2009).
  15. Jancsó, G. Intracisternal capsaicin: selective degeneration of chemosensitive primary sensory afferents in the adult rat. Neuroscience letters. 27 (1), 41-45 (1981).
  16. Gamse, R., Saria, A., Lundberg, J. M., Theodorsson-Norheim, E. Behavioral and neurochemical changes after intracisternal capsaicin treatment of the guinea pig. Neuroscience Letters. 64 (3), 287-292 (1986).
  17. Neubert, J. K., et al. Characterization of mouse orofacial pain and the effects of lesioning TRPV1-expressing neurons on operant behavior. Molecular pain. 4, 43 (2008).
  18. Karai, L., et al. Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. The Journal of clinical investigation. 113 (9), 1344-1352 (2004).
  19. Fukushima, A., Mamada, K., Iimura, A., Ono, H. Supraspinal-selective TRPV1 desensitization induced by intracerebroventricular treatment with resiniferatoxin. Scientific reports. 7 (1), 12452 (2017).
  20. Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British journal of pharmacology and chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
  21. Tjølsen, A., Berge, O. G., Hunskaar, S., Rosland, J. H., Hole, K. The formalin test: an evaluation of the method. Pain. 51 (1), 5-17 (1992).
  22. Ohsawa, M., Miyabe, Y., Katsu, H., Yamamoto, S., Ono, H. Identification of the sensory nerve fiber responsible for lysophosphatidic acid-induced allodynia in mice. Neuroscience. 247, 65-74 (2013).
  23. Tanabe, M., Tokuda, Y., Takasu, K., Ono, K., Honda, M., Ono, H. The synthetic TRH analogue taltirelin exerts modality-specific antinociceptive effects via distinct descending monoaminergic systems. British journal of pharmacology. 150 (4), 403-414 (2007).
  24. Ono, H., et al. Reduction in sympathetic nerve activity as a possible mechanism for the hypothermic effect of oseltamivir, an anti-influenza virus drug, in normal mice. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 113 (1), 25-30 (2013).
  25. Kauer, J. A., Gibson, H. E. Hot flash: TRPV channels in the brain. Trends in neurosciences. 32 (4), 215-224 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1631 TRPV1RTX

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены