JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

والهدف العام لأسلوب التنميط polysome تحليل النشاط متعدية الجنسيات مرناس الفردية أو مرناس الترنسكربيتوم خلال تخليق البروتين. الأسلوب مهم لدراسات البروتين التوليف تنظيم وتفعيل الترجمة والقمع في الصحة والأمراض البشرية المتعددة.

Abstract

تعبير البروتين المناسبة في الوقت المناسب وفي المبالغ الصحيحة التي هي أساس وظيفة الخلية الطبيعية والبقاء على قيد الحياة في بيئة سريعة التغير. لفترة طويلة، يهيمن عليها البحوث على المستوى النسخي دراسات التعبير الجيني. ومع ذلك، مستويات مستقرة مرناس ترتبط أيضا بإنتاج البروتين، وطواعية مرناس يختلف اختلافاً كبيرا تبعاً للظروف. في بعض الكائنات، مثل طفيلي الليشمانيا، ينظم التعبير البروتين معظمها على مستوى متعدية الجنسيات. أظهرت الدراسات الأخيرة أن التقلبات ترجمة البروتين يرتبط بالسرطان، والايض والأعصاب وغيرها من الأمراض البشرية. Polysome التنميط وسيلة قوية لدراسة تنظيم ترجمة البروتين. أنها تسمح لقياس حالة متعدية الجنسيات مرناس الفردية أو دراسة الترجمة على نطاق الجينوم. أساس هذا الأسلوب هو فصل polysomes وريبوسوم، والوحدات الفرعية ومرناس الحرة أثناء الطرد المركزي من هيولى من خلال تدرج سكروز. نقدم هنا، بوليسومي عالمي تنميط بروتوكول يستخدم في ثلاثة نماذج مختلفة--طفيل ليشمانيا كبيرة، استزراع الخلايا البشرية والأنسجة الحيوانية. ليشمانيا الخلايا تنمو بحرية في التعليق وتنمو الخلايا البشرية المستزرعة في أحادي الطبقة ملتصقة، بينما يمثل الخصية الماوس عينة أنسجة حيوانية. وهكذا، التقنية تتكيف مع كل مصدر من هذه المصادر. ويتضمن البروتوكول المتعلق بتحليل الكسور بوليسومال الكشف عن مستويات مرناً الفردية التي RT-قبكر، البروتينات لطخة غربية والتحليل للكشف الريباسي بالتفريد. الأسلوب يمكن تمديد دراسة رابطة مرناس مع الريبوسوم على مستوى الترنسكربيتوم بتسلسل الحمض النووي الريبي العميق وتحليل البروتينات المرتبطة الريبوسوم بالتحليل الطيفي الشامل للكسور. الأسلوب يمكن تعديلها بسهولة للنماذج البيولوجية الأخرى.

Introduction

ويسيطر تنظيم التعبير الجيني في الخلايا آليات النسخي وبوسترانسكريبشونال وبوستترانسلاشونال. السلف في تسلسل الحمض النووي الريبي عميقة تسمح دراسة مستويات مرناً مستقرة على نطاق الجينوم بمستوى لم يسبق له مثيل. ومع ذلك، أظهرت النتائج الأخيرة أن مستوى مرناً حالة ثابتة لا يرتبط دائماً بإنتاج البروتين1،2. مصير نسخة فردية معقدة جداً ويعتمد على عوامل كثيرة مثل المحفزات الداخلية والخارجية، والإجهاد، إلخ. تنظيم التعبير الجيني خلال تخليق البروتين يوفر طبقة أخرى من التعبير التحكم اللازمة لاستجابة سريعة في الظروف المتغيرة. بوليسومي (أو "بوليريبوسومي") التنميط، والانفصال، والتصور بنشاط ترجمة ريبوسوم، وسيلة قوية لدراسة تنظيم تخليق البروتين. وعلى الرغم من تطبيقاته التجريبية الأولى ظهرت في الستينات3، polysome التنميط حاليا واحدة من التقنيات الأكثر أهمية في البروتين ترجمة الدراسات4. يمكن ترجمة مرناس واحدة من الريبوسوم واحد أو أكثر مما يؤدي إلى تشكيل بوليسومي. يمكن أن توقف المحاضر في ريبوسوم مع سيكلوهيكسيميدي5 ويمكن فصل مرناس التي تحتوي على أرقام مختلفة من بوليسوميس عملية تجزئة بوليسومي بواسطة السكروز تنبيذ فائق التدرج6،7 , 8 , 9-يسمح تحليل الحمض النووي الريبي للكسور بوليسومال ثم قياس التغيرات في الدول المتعدية في مرناس الفردية على نطاق الجينوم، وخلال مختلف الظروف الفسيولوجية4،7، 10-الأسلوب قد استخدمت أيضا لتكشف عن أدوار 5 'UTR و 3' UTR تسلسل في السيطرة على مرناً طواعية11، ودراسة دور ميرناس في القمع متعدية12، كشف العيوب في الريبوسوم نشوء حيوي13 ، وفهم دور البروتينات المرتبطة الريبوسوم مع الأمراض التي تصيب الإنسان14،15. خلال العقد الماضي، برز دور متنام لتنظيم التعبير الجيني أثناء الترجمة أن يوضح أهميتها في الأمراض التي تصيب الإنسان. دليل مراقبة متعدية الجنسيات في السرطان، الأيضية وأمراض الأعصاب هو الساحقة15،16،،من1718. على سبيل المثال، يسهم في التقلبات eIF4E-تعتمد على مراقبة متعدية الجنسيات ذات الصلة بالتوحد في العجز15 وفمرب وتشارك في المماطلة من ريبوسوم في مرناس مرتبطة بالتوحد14. وهكذا، التنميط بوليسومال أداة هامة جداً لدراسة العيوب في التنظيم متعدية الجنسيات في العديد من الأمراض البشرية.

تحليل البروتين الكسور بوليسومال تحت ظروف فسيولوجية مختلفة يشرح وظيفة العوامل المرتبطة ريبوسوم أثناء الترجمة. وقد استخدمت تقنية polysome التنميط في العديد من الأنواع بما في ذلك الخميرة وخلايا الثدييات والنباتات والبروتوزوا10،19،،من2021. معرض الطفيليات الأوالي مثل المثقبيات و ليشمانيا التحكم النسخي محدودة للتعبير الجيني. وتنظم على الجينوم في مجموعات الجينات بوليسيسترونيك التي تفتقر إلى النسخ ينظم مروج22. بدلاً من ذلك، التعبير الجيني إنمائية يتم التحكم في الغالب على مستوى الترجمة البروتين والاستقرار مرناً في مثقبيات الأنواع23،24. ولذلك، فهم التحكم متعدية الجنسيات في غياب تنظيم النسخي أهمية خاصة بالنسبة لهذه الكائنات. التنميط بوليسومال أداة قوية لدراسة بوسترانسكريبشونال تنظيم التعبير الجيني في ليشمانيا25،26،،من2728.

التقدم الذي أحرز مؤخرا في الكشف عن المستويات الفردية مرناس ريال مرة PCR الكمي (RT-qPCR) وكامل الترنسكربيتوم بتسلسل الجيل القادم، فضلا عن التكنولوجيات البروتيوميات، يجلب القرار ومزايا التنميط بوليسومال إلى مستوى جديد. استخدام هذه الأساليب يمكن تمديد بتحليل للكسور بوليسومال الفردية بتسلسل الحمض النووي الريبي العميقة جنبا إلى جنب مع تحليل البروتين لرصد حالة متعدية الجنسيات من الخلايا في نطاق الجينوم. وهذا ما يسمح تحديد اللاعبين جزيئية جديدة تنظم الترجمة تحت مختلف الظروف الفسيولوجية والمرضية. نقدم هنا، بوليسومي عالمي التنميط بروتوكول يستخدم في ثلاثة نماذج مختلفة: طفيل ليشمانيا كبيرةومثقف الخلايا البشرية، والأنسجة الحيوانية. نقدم المشورة في إعداد ليساتيس الخلية من الكائنات المختلفة، والاستفادة المثلى شروط التدرج واختيار مثبطات رناسي وتطبيق قبكر RT ولطخة غربية والتفريد الحمض النووي الريبي لتحليل الكسور بوليسومي في هذه الدراسة.

Protocol

وأجريت جميع علاجات الحيوانات والتعامل مع الأنسجة التي تم الحصول عليها في الدراسة وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة الاستخدام في مركز العلوم تكساس تكنولوجيا جامعة الصحة وفقا للمعاهد الوطنية لرعاية الحيوان المؤسسية الإرشادات الصحية رعاية الحيوان، رقم بروتوكول 96005. الرجاء التضحية الحيوانات الفقارية وتعد الأنسجة وفقا للمبادئ التوجيهية من رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة. في حالة عدم وجود مثل هذه لجنة، يرجى الرجوع إلى المبادئ التوجيهية للرفق بالحيوان "المعاهد الوطنية للصحة". الكبار (> 60 يوم من العمر) واستخدمت الفئران C57BL/6. وتم الحصول على جميع الحيوانات والأنسجة وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة الاستخدام في مركز العلوم تكساس تكنولوجيا جامعة الصحة وفقا للمبادئ التوجيهية للرفق بالحيوان "المعاهد الوطنية للصحة" ورعاية الحيوان المؤسسية. للقتل الرحيم، وضعت ماوس واحدة في غرفة صغيرة، وتم تشريد الهواء تدريجيا مع حوالي 30% ثاني أكسيد الكربون لتخدير والتقليل من كرب الحيوان. في أعقاب توقف التنفس، استخدمنا التفكك عنق الرحم لتأكيد وفاة الحيوان قبل الحصاد الأنسجة.

تنبيه: جميع مع الخلايا البشرية مثقف ويعيش ليشمانيا العمل في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء في BSL-2 شهادة المختبر.

1-إعداد ليساتيس هيولى من ليشمانيا كبيرة ، استزراع الخلايا البشرية والأنسجة الماوس

ملاحظة: هناك العديد من الاختلافات في الأعمال التحضيرية ليساتي من مواد مختلفة المصدر. خطوات أخرى بما في ذلك إعداد التدرج السكروز وتجزئة بوليسومال متطابقة ولا تعتمد على مصدر العينة.

  1. ليشمانيا كبيرة إعداد ليستي هيولى
    1. تلقيح خلايا ليشمانيا كبيرة (سلالة FV1) في 30 مل من متوسطة 1 x M19929 الذي يحتوي على خليط 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين/ستربتوميسين (وحدات 100 و 100 ميكروغرام/مل في المقابل)في كثافة 1 × 105 خلايا/مل .
      ملاحظة: يجب أن تتم جميع الخطوات التي تنطوي على خلايا ليشمانيا كبيرة في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
    2. وضع الخلايا في الحاضنة وتنمو لهم في 27 درجة مئوية حتى المرحلة لوغاريتمي (منتصف سجل يطابق 5 × 106 خلايا/مل). عادة ما يستغرق يومين تنمو.
    3. إضافة سيكلوهيكسيميدي إلى ثقافة ليشمانيا كبيرة لتركيز نهائي من 100 ميكروغرام/مل للقبض على ريبوسوم في مرناس المترجمة. وضع الخلايا في الحاضنة لمدة 10 دقائق عند 27 درجة مئوية.
    4. بعد الانتهاء من العلاج سيكلوهيكسيميدي، نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل وتدور لهم في 1,800 س ز و 4 درجة مئوية للحد الأدنى 8 تجاهل المادة طافية.
    5. تغسل الخلايا مع 30 مل من الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس). الطرد المركزي في 1,800 س ز و 4 درجة مئوية لمدة 8 دقائق.
    6. تجاهل المادة طافية. ريسوسبيند الخلايا في 1 مل دببس.
    7. تأخذ قاسمة للخلايا ومزجها مع 3.5% فورمالدهايد الحل.
    8. حساب عدد الخلايا التي هيموسيتوميتير وتحديد تركيزها. تحويل العدد المطلوب من الخلايا إلى [ميكروفوج] أنابيب. أعدت من 0.5x108-2 × 108 خلايا/مل غير كافية لتحميل واحد السكروز التدرج.
    9. وتدور الخلايا في 1,800 س ز 4 درجة مئوية للحد الأدنى 8 تجاهل المادة طافية.
    10. ريسوسبيند بيليه الخلية على الجليد في 1 مل من تحلل المخزن المؤقت الذي يحتوي على مثبطات البروتياز ومثبط رناسي (20 مم هيبيس-كوه، درجة الحموضة 7.4، 100 ملم بوكل، 10 مم مجكل2, 2 مم DTT، 1% NP-40، 1 x حوزتي المانع كوكتيل (يدتا الحرة)، المانع رناسي 200 وحدة/مل).
    11. يمر إبرة 23-قياس ثلاث مرات. ينبغي أن تصبح شفافة بعد المرور عبر الإبرة.
    12. أجهزة الطرد المركزي في 11,200 س ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتوضيح ليستي. نقل توضيح إلى جديدة أنبوب وإبقائه على الجليد حتى السكروز تنبيذ فائق التدرج.
    13. جمع 400-500 ميكروليتر من ليساتي كمدخل (تحليلها في وقت لاحق)، تجميد من الحق بعيداً في النتروجين السائل لتحليل البروتين مستقبلا أو إضافة كاشف تنقية الحمض النووي الريبي قبل تجميد لتحليل الحمض النووي الريبي.
  2. إعداد ليساتي هيولى من استزراع الخلايا البشرية هيلا
    1. تقسيم خلايا هيلا والبذور منها إلى 20 مل المتوسطة دميم المحتوية على خليط 10% FBS والبنسلين/ستربتوميسين (وحدات 100 و 100 ميكروغرام/مل في المقابل) مع خلية العد 2 × 105 خلايا/مل في صفيحة 15 سم.
    2. تنمو خلايا هيلا في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاء 20-24 إجراء بلازميد الدنا تعداء وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
    3. نشر خلايا ح 24 بعد تعداء على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
    4. إضافة سيكلوهيكسيميدي إلى خلايا هيلا نمت إلى تركيز 100 ميكروغرام/مل لاعتقال ريبوسوم في مرناس المترجمة واحتضان خلايا لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5% CO2النهائي. نضح المتوسطة. تغسل الخلايا مرتين مع دببس الباردة على الجليد.
    5. إضافة 500 ميكروليتر من تحلل المخزن المؤقت (الرقم الهيدروجيني 20 مم كوه حبيس 7.4، 100 ملم بوكل، 5 مم مجكل2، 1 مم DTT، 0.5% NP-40، 1 x حوزتي المانع كوكتيل (يدتا خالية)، 200 وحدة/مل رناسي الهيبارين المانع أو 1 مغ/مل) اللوحة وكشط الخلايا على الجليد.
    6. نقل الخلايا ليسيد إلى [ميكروفوج] أنابيب. ضبط تركيز NP-40 إلى 0.5% و مجكل2 إلى 5 ملم وفقا للزيادة في حجم العينة.
    7. يمر إبرة 23-قياس 3-6 مرات.
    8. تدور في 11,200 س ز و 4 درجة مئوية لمدة 8 دقائق لتوضيح ليستي. بعد الطرد المركزي، بنقل المادة طافية إلى أنبوب جديد. استخدام جهاز المطياف الضوئي تقييم كفاءة تحلل الخلية وتحديد حجم العينة للتحميل على التدرج. إضافة 10 ميكروليتر من عينة إلى 0.5 مل من 0.1% الصوديوم دوديسيل كبريتات (الحزب الديمقراطي الصربي). فارغة ضد الحزب الديمقراطي الصربي 0.1%. قياس امتصاص في 260 نيوتن متر. القيمة المتوقعة امتصاص حوالي 15-20 وحدة/مل.
    9. تمييع جميع العينات مع تحلل المخزن المؤقت إلى نفس القيمة امتصاص قبل السكروز التدرج الطرد المركزي. الاحتفاظ بعينات على الجليد حتى السكروز التدرج الطرد المركزي.
  3. إعداد ليساتي هيولى من الخصية الماوس
    1. تشريح الخصية الماوس. إجراء شق صغير في الباجينا الغلالة وجمع الخصي الخصيتين وتحويلها في أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على 5 مل دببس تكملة مع فلوريد فينيلميثيلسولفونيل مم 0.1 (بمسف).
    2. مزج الأنسجة بقوة بعكس عدة مرات. تسمح الأنسجة لتستقر عند وحدة الجاذبية على الجليد لمدة 5 دقائق.
    3. إزالة وتجاهل غائم المخزن المؤقت الذي يحتوي على خلايا الضام والأنسجة الشظايا. كرر الإجراء 2-3 مرات أكثر. بيليه الأبيض المتبقي هو إثراء للخصي والخلايا الجرثومية.
    4. نقل بيليه أنبوب سيمينيفيروس إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل وتدور في 500 غرام x للحد الأدنى 1 تجاهل المادة طافية.
    5. إضافة 500 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت (20 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.4، 100 ملم بوكل، 5 مم مجكل2، 1 مم DTT، 0.5% NP-40، 1 x حوزتي المانع كوكتيل (يدتا الحرة)، الهيبارين 1 ملغ/مل أو 200 وحدة/مل من مثبط رناسي) للأنابيب. استخدام ماصة إلى تريتوراتي الأنسجة.
    6. نقل التعليق صغير (0.5-1.0 مل) الخالطون دونس. تعطيل الأنسجة مع السكتات الدماغية سبعة إلى ثمانية من مدقة الزجاج.
    7. نقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
    8. الطرد المركزي العينة في 12,000 س ز و 4 درجات مئوية عن 8 دقيقة لمسح في ليساتي. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد ومخزن على الجليد حتى التحميل على التدرج السكروز.
    9. جمع 50 ميكروليتر من ليساتي كنموذج الإدخال، وتجميد من الحق بعيداً في-80 درجة مئوية لتحليل البروتين مستقبلا؛ أو إضافة كاشف تنقية الحمض النووي الريبي قبل تجميد لتحليل الحمض النووي الريبي.

2-السكروز إعداد التدرج وتنبيذ فائق

  1. إعداد الحلول التدرج هما السكروز (20 مم هيبيس-كوه، درجة الحموضة 7.4، 100 ملم بوكل، 10 مم مجكل2، 1 مم DTT، مثبط البروتياز x 1 كوكتيل)، الذي يحتوي على السكروز 10% أو السكروز 50%. (يمكن استخدام تريس-HCl، درجة الحموضة 7.4، بدلاً من حبيس). إضافة 200 وحدة/مل الهيبارين المانع أو 1 مغ/مل رناسي وفقا للتصميم التجريبي. وضع أنبوب ultracentrifuge للدوار SW 41 إلى كتلة ماركر ورسم الخط على طول الطابق العلوي من الكتلة. نقل الأنبوب إلى رف مستقرة.
  2. تأخذ حقنه 10 مل مع طبقات الجهاز يعلق وملء المحاقن مع محلول السكروز 10% (أعدت كما ذكر أعلاه). بلطف الإصدار في الجزء السفلي من أنبوب أولتراسينتريفوجي حتى تصل إلى العلامة في الأنبوب.
  3. تعبئة آخر حقنه بمحلول السكروز 50% وإدراج الجهاز الخاص به طبقات من خلال طبقة السكروز 10% على الجزء السفلي من الأنبوب بعناية. الإفراج عن محلول السكروز بدءاً من القاع حتى تصل إلى علامة على الأنبوب بلطف. إغلاق الأنبوب مع غطاء المقدمة.
  4. إعداد التدرج السكروز، قم بتشغيل الجهاز صانع التدرج على. مستوى استخدام لأعلى أو لأسفل أزرار اللوحة واضغط حرر. التسوية أمر مهم للخطى للتدرج.
  5. بعد الاستواء اللوحة اضغط غراد لفتح قائمة التدرج. انتقل إلى قائمة التدرج من القائمة وحدد الدوار SW 41 منظمة الشفافية الدولية. ثم اختر التدرج السكروز المرجوة من قائمة القائمة باستخدام الأزرار أعلى واسفل . اضغط على استخدامها.
  6. مكان صاحب أنبوب التدرج في لوحة التدرج صانع. نقل الأنبوبة في الحامل. يمكن إعداد تصل إلى 6 التدرجات في نفس الوقت. اضغط على الزر تشغيل. صانع التدرج تدور هذه الأنابيب في السرعة المبرمجة وزوايا تشكيل تدرج خطي. وسوف يستغرق سوى بضع دقائق لإعداد التدرج.
  7. عند اكتمال العملية، وضع الأنابيب في رف. خلع القبعات. إزالة وحدة التخزين نفسها كحجم العينة من الجزء العلوي من أنابيب أولتراسينتريفوجي.
  8. تحميل 400-500 ميكروليتر ليستي التي تحتوي على 15-20260 وحدات من بوليسوميس على الأعلى بعناية. ضع الأنابيب في دلاء الدوار والتوازن لهم.
  9. الطرد المركزي في س 260,000 ز و 4 درجة مئوية عن ح 2 استخدام SW 41 دوار.

3-بوليسومي تجزئة وجمع العينات

ملاحظة: بينما الاستعدادات ليستي بعض الاختلافات تبعاً للمصدر، إعداد التدرج بروتوكولي تجزئة polysome هي نفسها بالنسبة لجميع أنواع ليساتيس.

  1. بعد الانتهاء من تنبيذ فائق، ضع دلاء الدوار مع الأنابيب على الجليد. دورة جامع الكسر والتدرج فراكتيوناتور على. انقر فوق مسح القائمة فراكتيوناتور. وضع رف مع 24 مجموعة أنابيب في جامع الكسر.
  2. ملء خزان شطف على جانب فراكتيوناتور بالمياه. اضغط على مفتاح الشطف 10 s شطف المضخة في فراكتيوناتور. إرفاق محول شطف مع حقنه مليئة بالمياه إلى المكبس للمعايرة.
  3. افتح برنامج فراكتيوناتور على الكمبيوتر. الصحافة معايرة. استخدام الإعدادات الافتراضية ، ثم اضغط على موافق. تكون على استعداد لضخ المياه من المحاقن.
  4. اضغط موافق للقيام بالمعايرة. البدء فورا في حقن الماء لل 5 القادمة s. خلال هذا الوقت، سوف تتدفق المياه من خلال خلية تدفق للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية وسوف تكون محسوبة في الصك. إتمام المعايرة الصفر سوف تظهر العلامة. الصك جاهز لتجزئة.
  5. قم بإزالة محول شطف مع المحاقن. إرفاق تلميح إلى المكبس فراكتيوناتور.
  6. فتح النحاس الجوية الصحافة وصمام الهواء مفتاح 10 s للأنابيب الجافة وتدفق الخلية. إغلاق صمام الهواء.
  7. بلطف إزالة أنبوب التدرج من دلو الدوار ووضعه في الرف. تطبيق غطاء حامل أنبوب في الجزء العلوي من الأنبوب بعناية تحريك الأنبوبة في حامل الأنابيب وقفله في الموقف.
  8. مكان صاحب تحت المكبس فراكتيوناتور. وغالباً ما يمكن رؤية العصابات بوليسومال بالعين المجردة. إدخال الإعدادات المطلوبة لكسر الأرقام وحجم (24 الكسور في 500 ميكروليتر/الكسر تكفي عادة). اسم الملف شكل مناسب. اضغط "موافق"، ومن ثم زر الذهاب إلى الرسم البياني . في الإطار التالي، اضغط بدء المسح الضوئي. وسوف تظهر الإعدادات، اضغط موافق. جامع سينتقل من البالوعة للكسر الأول وسيتم نقل المكبس في الأنبوب. عندما يصل المكبس إلى الأعلى من التدرج أنه سيتباطأ إلى السرعة المحددة وسيتم جمع الكسور. عند الانتهاء، يتحرك المكبس من الأنبوب التدرج.
  9. فتح النحاس الجوية الصحافة وصمام الهواء المفتاح على فراكتيوناتور لاسترداد جزء آخر.
  10. نقل الأنابيب من الرف على الجليد.
  11. إضافة 2 وحدات من الجيش الملكي النيبالي تنقية كاشف لكل جزء وفلاش تجميد في النتروجين السائل حتى تنقية الحمض النووي الريبي. وبدلاً من ذلك، إذا كان البروتين يحتاج إلى تحليل، إضافة حمض التريكلوروسيتيك بتركيز نهائي 10% للتركيز عليها لغربي النشاف (انظر القسم 8).

4-إعداد "رنا الاصطناعية" في المختبر لتطبيع مرناس "المستويات أثناء تحليل البيانات" RT-قبكر

ملاحظة: يتم استخدام مرناً أومبا كولاي في هذا البروتوكول للتطبيع. أي رنا الأخرى ليس لديها هوية واسعة النطاق مع مرناس في الحي درس (الثدييات أو ليشمانيا) يمكن استخدامها.

  1. إعداد الجزء "أومبا الحمض النووي" تحتوي على تسلسل المروج SP6 بفعل PCR قياسية من بلازميد يحتوي على الجينات أومبا30.
  2. إعداد 100 ميليلتر من الخليط: 80 مم حبيس-كوه، درجة الحموضة 7.5، 16 مم مجكل2, 2 مم سبيرمدين، 10 مم DTT، 3 مم ATP، 3 مم CTP، 3 مم UTP، 3 مم غتب، مثبط رناسي U/ميكروليتر 0.5، 1 ميكروغرام من "أومبا بكر الحمض النووي"، 3 ميكروليتر SP6 رنا بوليميراز ، 0.005 يو/ميكروليتر بيروفوسفاتاسي.
  3. احتضان عند 40 درجة مئوية ح 2.
  4. تنقية الحمض النووي الريبي بمجموعة مواد تنقية الحمض النووي الريبي.
  5. قياس تركيز بجهاز المطياف الضوئي وينظر في [اغروس] هلام التفريد.

5-الجيش الملكي النيبالي "في معزل" عن "الكسور التدرج" وكدنا إعداد

ملاحظة: انتقل مباشرة مع هذا البروتوكول لتنقية الحمض النووي الريبي إذا استخدمت مثبطات رناسي كمثبط ريبونوكليسي. ومع ذلك، عندما تستخدم كمثبط ريبونوكليسي، سوف تمنع الهيبارين المنتسخة العكسية المستخدمة في إعداد كدنا. ولذلك، سيلزم تنقية إضافية من الحمض النووي الريبي إذا استعمل الهيبارين في المخزن المؤقت لتحلل والتدرج. انظر القسم 6 إعداد الجيش الملكي النيبالي لتوليف كدنا إذا استعمل الهيبارين.

  1. ذوبان الجليد العينات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي تنقية الكاشف، إضافة 20 نانوغرام من الحمض النووي الريبي الاصطناعية كالمراقبة الداخلية للتطبيع لنتائج RT-قبكر. المضي قدما في إعداد الجيش النيبالي الملكي وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة باستثناء تعديل واحد. أضف 1 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي الصف الجليكوجين (20 ميكروغرام) ترسيب الايزوبروبانول السابقة. حل الكريات الجيش الملكي النيبالي في 20-25 ميليلتر من المياه خالية من رناسي.
    ملاحظة: الجليكوجين بمثابة ناقل ويساعد على تجنب الخسائر وتصور بيليه الجيش الملكي النيبالي خلال تنقية. يتم استخدام أومبا مرناً لمزيد من التطبيع في الرايت qPCR ردود فعل.
  2. قياس تركيز الجيش الملكي النيبالي باستخدام جهاز المطياف الضوئي لضمان عائد كاف. الجمع بين كميات متساوية من الحمض النووي الريبي الكسور التي تحتوي على 60S، 40S ومونوسوميس بريبوليسوميس. الجمع بين الكسور التي تحتوي على 2-4 ريبوسوم ك polysomes الخفيفة والكسور مع ريبوسوم 5-8 الجمع ك polysomes الثقيلة.
  3. استخدم 5-10 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي من الكسور مجتمعة لإعداد كدناس باستخدام مجموعة أدوات واتباع توصيات الشركة المصنعة.
  4. إضافة ميليلتر 80 من المياه مجاناً نوكلاس إلى 20 ميليلتر من كدنا. تجميد عينات كدنا في-20 درجة مئوية.

6-الجيش الملكي النيبالي التنقية من تلوث الهيبارين

ملاحظة: يمنع الهيبارين الحمض النووي تجهيز الإنزيمات مثل المنتسخة العكسية. ولذلك، استخدام هذا البروتوكول تنقية إضافية عندما يتم استخدام الهيبارين في المخزن المؤقت لتحلل و/أو في التدرج.

  1. إضافة ليكل إلى تركيز نهائي 1 م لعينات الحمض النووي الريبي المنقي.
  2. خلط العينات واحتضان على الجليد ح 1.
  3. وتدور هذه العينات في 16,000 س ز و 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. إزالة المادة طافية كاملا بقدر الإمكان باستخدام ماصة.
  5. أيردري الكريات لمدة حوالي 5 دقائق.
  6. إعادة تعليق الكريات في حجم المياه خالية من رناسي الأولى.
  7. إجراء القياس سبيكتروفوتوميتريك في 260 نيوتن متر لتحديد تركيز الجيش الملكي النيبالي. عادة، إلى فقدان العينة الحد الأدنى.

7--الرايت قبكر وتحليل البيانات لتوزيع مرناً

  1. الجمع بين 10.2 ميكروليتر المياه، 20 ميكروليتر من "الأخضر سيبر"، ميكروليتر 4.8 من الجينات محددة الإشعال (2.5 ميكرومتر في كل مجموعة)، 5 ميكروليتر من كدنا ومزيج جيد وتحميل 10 ميكروليتر الواحدة وكذلك في تريبليكاتيس في لوحة 384-جيدا.
  2. تغطية صفيحة مع فيلم لاصق محكم والطرد المركزي لوحة في س 1,800 ز لمدة 5 دقائق.
  3. باستخدام أداة PCR الوقت الحقيقي إعداد رد فعل qPCR تحت الشروط المبينة في الجدول 1.
  4. استخدام عتبة دورة (جر) القيم و الأسلوب جر (ΔΔCر) مقارنة31 حساب النسبة المئوية (%) للتوزيع مرناً في بريبوليسوميس والخفيفة والثقيلة بوليسوميس ك وصف32 مع تعديل واحد. استخدام الاصطناعية الحمض النووي الريبي (أومبا هنا) لتطبيع البيانات في تحليل البيانات RT-قبكر. الجيش الملكي النيبالي الاصطناعية يوفر عنصر تحكم تطبيع الذي يسمح لحساب مستويات مرناس النسبي ومقارنتها بكسور مختلفة من التدرج.

8-تحليل البروتينات في الكسور بوليسومال من النشاف الغربية

  1. من أصل 100% (w/v)، إضافة حمض التريكلوروسيتيك (TCA) للكسور مختارة (500 ميكروليتر) بتركيز نهائي 10%، الحفاظ على الجليد لمالا يقل عن 15 دقيقة، أجهزة الطرد المركزي في [ميكروفوج] لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية ويغسل مرتين مع الأسيتون المثلج وتذوب في 25 ميكروليتر من S س-صفحة نموذج تحميل المخزن المؤقت للتفريد.
  2. تحميل في الحزب الديمقراطي الصربي الصفحة وإجراء التفريد القياسية مع نقل التالي للغشاء PVDF. انتقل إلى غرب النشاف33.

النتائج

في هذه الدراسة، يصف لنا تطبيق أسلوب التنميط بوليسومال إلى ثلاثة مصادر مختلفة: الطفيلية ليشمانيا كبيرةومثقف الخلايا البشرية والخصية الماوس. ليشمانيا الخلايا تنمو بحرية في وسائل الإعلام السائلة في التعليق وتنمو الخلايا البشرية المستزرعة في أحادي الطبقة ملتصقة...

Discussion

تجزئة بوليسومي بالتدرج السكروز جنبا إلى جنب مع الجيش الملكي النيبالي، وتحليل البروتين الكسور وسيلة قوية لتحليل حالة متعدية الجنسيات مرناس الفردية أو ترانسلاتومي كله، فضلا عن أدوار العوامل البروتين تنظم متعدية الجنسيات إليه خلال حالة فيزيولوجية أو المرض العادي. التنميط بوليسومال وتقني?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون لي تشينغ للمساعدة في تسجيل الصوت. البحث تدعمها أموال بدء التشغيل من تكساس تكنولوجيا جامعة مركز علوم الصحة ومن مركز التميز "علم الأعصاب متعدية الجنسيات" والمداواة (كتنت) منح 2017 PN-كتنت-05 "أخرجدهو" A.L.K.؛ في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منحة R01AI099380 هوفمان K.Z. جيمس جيم وباكا ر. كريستين العلماء سيسير (مركز "التكامل لوقف" التعليم والبحوث) وكانت مدعومة البرنامج.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Instruments:
Gradient masterBiocomp Instruments Inc.108
Piston Gradient FractionatorBiocomp Instruments Inc.152
Fraction collectorGilson, Inc.FC203B
NanoDrop OneThermo ScientificNanoDrop One
Nikon inverted microscopeNikonECLIPSE Ts2-FL/Ts2
2720 Thermal CyclerApplied Biosystems by Life Technologies4359659
CO2 incubatorPanasonic Healthcare Co.MCO-170A1CUV
HERATHERM incubatorThermo Scientific51028063
Biological Safety Cabinet, class II, type A2NuAire Inc.NU-543-400
Revco freezerRevco TechnologiesULT1386-5-D35
Beckman L8-M UltracentifugeBeckman CoulterL8M-70
CentrifugeEppendorf5810R
CentrifugeEppendorf5424
Ultracentrifuge Rotor SW41Beckman Coulter331362
Swing-bucket rotorEppendorfA-4-62
Fixed angle rotorEppendorfF-45-30-11
Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228Applied Biosystems by life technologies4470661
TC20 Automated cell counterBio-Rad145-0102
HemacytometerHausser Scientific02-671-51B
Software 
Triax software Biocomp Instruments Inc.
Materials:
Counting slides, dual chamber for cell counterBio-Rad145-0011
1.5 mL microcentrifuge tubeUSA Scientific1615-5500
Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm)Seton Scientific7030
Syringe, 5 mLBD309646
BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch NeedleBD10020439
Nunclon Delta Surface plate, 14 cmThermo Scientific168381
Nunclon Delta Surface plate, 9 cmThermo Scientific172931
Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPESThermo Scientific569-0020
BioLite 75 cm3 flasksThermo Scientific130193
Nunc 50 mL conical centrifuge tubesThermo Scientific339653
Chemicals:
Trizol LSAmbion by Life Technologies10296028
HEPESFisher ScientificBP310-500
Trizma baseSigmaT1378-5KG
Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM)SigmaD6429-500ML
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF0926-50ML
Penicillin-Streptomycin (P/S)SigmaP0781-100ML
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)SigmaD8537-500ML
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O)Acros OrganicsAC413415000
Potassium Chloride (KCl)SigmaP9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40)Fluka (Sigma-Aldrich)74385
Recombinant Rnasin Ribonuclease InhibitorPromegaN2511
Heparin sodium saltSigmaH3993-1MU
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitorsRoche Diagnostics11836170001
GlycogenThermo ScientificR0551
WaterSigmaW4502-1L
CycloheximideSigmaC7698-1G
ChloroformFisher Scientific194002
Dithiotreitol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Ethidium BromideFisher ScientificBP-1302-10
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA)Fisher ScientificS316-212
OptimemLife Technologies22600050
Puromycin dihydrochlorideSigmaP8833-100MG
SucroseFisher ScientificS5-3KG
Trypsin-EDTA solutionSigmaT4049-100ML
Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase KitApplied Biosystems by life technologies4368814
Power SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems by life technologies4367659
HClFisher ScientificA144SI-212
IsopropanolFisher ScientificBP26324
Potassium Hydroxide (KOH)Sigma221473-500G
Anti-RPL11 antibodyAbcamab79352
Ribosomal protein S6 (C-8) antibodySanta Cruz Biotechnology Inc.sc-74459
1xM199SigmaM0393-10X1L
Lithium clorideSigmaL-9650
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificD128-500
Gel Loading Buffer IIThermo ScientificAM8546G
UltraPure AgaroseThermo Scientific16500-100
Trichloracetic acid (TCA)Fisher ScientificA322-100
SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrateThermo Scientific34580
FormaldehydeFisher ScientificBP531-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)SigmaL5750-1KG
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)SigmaP7626-5G
RNeasy Mini kitQiagen74104
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)SigmaA1852-1VL
Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP)SigmaC1506-250MG
Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP)SigmaU6625-100MG
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP)SigmaG8877-250MG
SP6 RNA PolymeraseNEBM0207S
PyrophoshataseSigmaI1643-500UN
SpermidineSigmaS0266-1G

References

  1. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host. PLoS One. 8 (6), e67069 (2013).
  3. Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).
  4. Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).
  5. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  6. Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
  7. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
  8. Zuccotti, P., Modelska, A. Studying the Translatome with Polysome Profiling. Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).
  9. Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), e15 (2017).
  10. Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).
  11. Gandin, V., et al. nanoCAGE reveals 5' UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).
  12. Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
  13. Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p. Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).
  14. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  15. Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
  16. Robichaud, N., Sonenberg, N. Translational control and the cancer cell response to stress. Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).
  17. Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).
  18. Ishimura, R., et al. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration. Science. 345 (6195), 455-459 (2014).
  19. Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).
  20. Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).
  21. Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 14 (11), R128 (2013).
  22. De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. Gene expression regulation in trypanosomatids. Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).
  23. Alves, L. R., Goldenberg, S. RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).
  24. De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra. Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).
  25. Soto, M., et al. Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum. Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).
  26. McNicoll, F., et al. Distinct 3 '-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).
  27. Folgueira, C., et al. The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 '-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).
  28. Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania. Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).
  29. Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
  30. Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane. Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).
  31. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  32. Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles. Bio Protocols. 7 (3), (2017).
  33. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (1989).
  34. Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).
  35. Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
  36. van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).
  37. Morita, M., et al. mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1. Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).
  38. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

134 polysome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved