JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המטרה הכוללת של טכניקה פרופיל polysome הוא ניתוח של פעילות translational של הפרט mRNAs או transcriptome mRNAs במהלך סינתזת החלבון. השיטה זו חשוב ללימודים של רגולציה סינתזה של חלבון, הפעלת תרגום ודיכוי בריאות ומחלות האנושי מרובים.

Abstract

ביטוי חלבון הנכון בזמן הנכון, בכמות הנכונה היא הבסיס של תאים נורמליים פונקציה והישרדות בסביבה המשתנים במהירות. במשך זמן רב, המחקרים ביטוי גנים נשלטו על ידי מחקר על רמת גנים ברמת השעתוק. עם זאת, רמות מצב יציב mRNAs לא מתאימות היטב עם ייצור החלבון, translatability של mRNAs משתנה מאוד בהתאם לתנאים. אורגניזמים מסוימים, כמו טפיל לישמניה, הביטוי חלבון מוסדר בעיקר ברמת translational. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו ש-dysregulation תרגום החלבון הזה מזוהה עם סרטן, חילוף החומרים, ניווניות מחלות אנושיות אחרות. פרופיל polysome היא שיטה חזקה ללמוד תקנה תרגום החלבון. זה מאפשר למדוד את מצב translational mRNAs בודדים או לבחון תרגום בקנה מידה הגנום כולו. הבסיס של טכניקה זו היא ההפרדה polysomes, ריבוזומים, שלהם subunits, mRNAs חינם במהלך צנטריפוגה של cytoplasmic lysate דרך מעבר הדרגתי סוכרוז. כאן, אנו מציגים polysome אוניברסלי פרופיל פרוטוקול המשמש על שלושה דגמים שונים - טפיל לישמניה הגדולות, בתרבית תאים אנושיים ורקמות חיות. לישמניה תאים לגדול באופן חופשי ההשעיה, בתרבית תאים אנושיים לגדול חסיד טפט, בעוד העכבר testis מייצג של דגימת רקמה חיה. לכן, השיטה היא מותאם לכל אחד ממקורות אלה. הפרוטוקול עבור הניתוח של שברים polysomal כולל זיהוי של רמות ה-mRNA בודדות מאת RT-qPCR, חלבונים על ידי תספיג וניתוח של RNAs ribosomal על ידי אלקטרופורזה. השיטה ניתן להרחיב הלאה על ידי לספקטרומטרית מסות של השברים על ידי בחינת mRNAs שיוך הריבוזום ברמת transcriptome על ידי RNA עמוק-seq וניתוח של חלבונים הקשורים ריבוזום. השיטה ניתן להתאים בקלות למודלים ביולוגיים אחרים.

Introduction

בקרת גנים בתאים נשלטת על ידי גנים ברמת השעתוק, posttranscriptional ו- posttranslational. ההתקדמות רצף הרנ א עמוק לאפשר המחקר של מצב יציב רמות ה-mRNA בקנה מידה הגנום כולו ברמה חסרת תקדים. עם זאת, הממצאים האחרונים גילה כי רמת ה-mRNA מצב יציב לא תמיד לתאם עם חלבון ייצור1,2. גורלו של התעתיק בודדים מורכב מאוד, תלוי בגורמים רבים כמו גירויים פנימי/חיצוני, הלחץ, וכו '. בקרת גנים במהלך סינתזת החלבון מספק שכבה נוספת של בקרת ביטוי הכרחי לתגובה מהירה בשינוי תנאי. Polysome (או "polyribosome") שימוש בפרופילים, את ההפרדה והדמיה של פעיל תרגום הריבוזומים, היא שיטה חזקה ללמוד ברגולציה של סינתזת החלבון. למרות, יישומים ניסיוני הראשון שלו הופיע של שנות ה-603, פרופיל polysome נחשב כיום לאחד הטכניקות החשובות חלבון תרגום מחקרים4. MRNAs יחיד יכול להיות מתורגם על ידי אחד או יותר ריבוזום שמוביל היווצרות polysome. תעתיקים יכול להיות התעכב על הריבוזומים עם cycloheximide5 ו mRNAs המכיל מספר שונה של polysomes ניתן להפריד בתהליך polysome fractionation על ידי סוכרוז הדרגתיות ultracentrifugation6,7 , 8 , 9. ניתוח RNA של שברים polysomal מכן מאפשרת מדידה של שינויים בארצות translational של הפרט mRNAs בקנה מידה הגנום כולו, ובמהלך מצבים פיזיולוגיים שונים4,7, 10. השיטה שימש גם כדי לחשוף את התפקידים של 5' UTR, 3' UTR רצפי הבקרה של ה-mRNA translatability11, לבחון את תפקיד miRNAs דיכוי translational12, שמתוכננות לגלות פגמים בריבוזום להן13 , ולהבין את התפקיד של הריבוזום-הקשורים חלבונים עם מחלות אנושיות14,15. במהלך העשור האחרון, תפקיד גדל והולך עבור בקרת גנים במהלך התרגום התפתחה הממחיש את חשיבותו של מחלות אנושיות. העדויות על בקרה translational ב סרטן, מטבוליות, מחלות ניווניות הוא המכריע15,16,17,18. לדוגמה, dysregulation של שליטה translational תלויי-eIF4E תורמת אוטיזם הקשורים גירעונות15 ו- FMRP מעורב השתהות של הריבוזומים על mRNAs קשורה לאוטיזם14. לפיכך, פרופיל polysomal הוא כלי מאוד חשוב ללמוד פגמים בתקנה translational מחלות אנושיות מרובות.

אנליזת חלבונים שברים polysomal בתנאים פיזיולוגיים שונים מבתר את הפונקציה של גורמים הקשורים הריבוזומים במהלך התרגום. הטכניקה פרופיל polysome שימש במינים רבים, לרבות שמרים בתרבית של תאים, צמחים, חד-תאיים10,19,20,21. טפילים protozoan כמו Trypanosoma ולישמניה להפגין שליטה מוגבלת תעתיק של ביטוי גנים. הגנום שלהם מאורגנות אשכולות גנים polycistronic חסרי שעתוק מקדם מוסדר22. במקום זאת, ביטוי גנים התפתחותית נשלטת בעיקר ברמה של חלבון תרגום ויציבות mRNA trypanosomatid מינים23,24. לכן, הבנה של שליטה translational בהעדר רגולציה תעתיק זה חשוב במיוחד עבור אורגניזמים אלה. פרופיל polysomal הוא כלי רב עוצמה כדי ללמוד posttranscriptional בקרת גנים לישמניה25,26,27,28.

התקדמות האחרונות בזיהוי של רמות mRNAs בודדים על-ידי אמת בפעם ה-PCR כמותי (RT-qPCR), transcriptome מלאה על ידי רצף הדור הבא, כמו גם טכנולוגיות פרוטאומיקס, מביא את הרזולוציה ואת היתרונות של פרופיל polysomal לרמה חדשה. השימוש בשיטות אלה ניתן להרחיב הלאה על ידי רצף הרנ א עמוק בשילוב עם ניתוח פרוטיאומיה מבנית כדי לפקח על מצב translational של תאים בקנה מידה הגנום כולו על ידי ניתוח של שברים polysomal בודדים. דבר זה מאפשר זיהוי שחקנים מולקולריים חדשים ויסות תרגום בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. כאן, אנו מציגים polysome האוניברסלית של פרופיל פרוטוקול המשמש על שלושה דגמים שונים: טפיל לישמניה הגדולות, בתרבית תאים אנושיים, רקמות חיות. אנו מציגים את העצה על הכנת תא lysates אורגניזמים שונים, אופטימיזציה של תנאי מעבר צבע, הבחירה של מעכבי RNase ויישום של RT-qPCR, תספיג ו RNA אלקטרופורזה לנתח שברים polysome במחקר זה.

Protocol

כל הטיפולים בעלי חיים וטיפול של רקמות שהושגו במחקר בוצעו על פי פרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועד שימוש טקסס טק האוניברסיטה למדעי הבריאות מרכז בהתאם המכונים הלאומיים הנחיות רווחת בעלי חיים בריאות, פרוטוקול מספר 96005. בבקשה להקריב בעלי חוליות והכן רקמות על פי ההנחיות טיפול בעלי חיים מוסדיים, שימוש הוועדה. אם חסר ועדה כזאת, נא לפנות ההנחיות רווחת מכוני הבריאות הלאומיים. למבוגרים (> בן 60 יום) שימשו עכברים C57BL/6. כל בעלי החיים, רקמות התקבלו על-פי פרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועד שימוש טקסס טק האוניברסיטה למדעי הבריאות מרכז בהתאם להנחיות רווחת מכוני הבריאות הלאומיים. על המתת חסד, עכבר אחת בוצעה בחדר קטן, האוויר היה שנעקרו בהדרגה כ- 30% פחמן דו-חמצני עזים ומתנגד ולצמצם את המצוקה של החיה. בעקבות הפסקת נשימה, השתמשנו נקע בצוואר הרחם כדי לאשר את מותו של החיה לפני קצירת רקמות.

שים לב: כל העבודה עם חיה לישמניה , בתרבית תאים אנושיים נעשה אבטחה ארון BSL-2 מעבדה מוסמכת.

1. הכנת Cytoplasmic Lysates מן לישמניה הגדולות , בתרבית תאים אנושיים, ורקמות העכבר

הערה: ישנם מספר הבדלים בזמן ההכנות lysate מחומרים מקור אחר. צעדים אחרים כולל הכנה הדרגתיות סוכרוז polysomal fractionation זהים, אינם תלויים מקור הדגימה.

  1. הכנה lysate cytoplasmic לישמניה הגדולות
    1. לחסן לישמניה הגדולות (זן FV1) בתאים 30 מ של 1 x M199 בינוני29 המכיל סרום שור עוברית (FBS) 10% תערובת פניצילין/סטרפטומיצין (100 יחידות, 100 μg/mL בהתאמה)-צפיפות של עונה 1 פרק 105 תאים/מ ל... .
      הערה: כל השלבים המערבים תאי לישמניה העיקריים להתבצע באבטחה ארון.
    2. המקום התאים בחממה ואגדל אותם ב 27 ° C עד השלב לוגריתמי (אמצע יומן המתאים 5 x 106 תאים/מ ל...). זה בדרך כלל לוקח כיומיים לגדול.
    3. להוסיף cycloheximide לישמניה מרכזי תרבות של ריכוז סופי של 100 μg/mL לעצור הריבוזומים על mRNAs מתורגמת. המקום התאים חזרה בחממה 10 דקות ב-27 º c
    4. לאחר השלמת הטיפול cycloheximide, להעביר תאים צינור חרוטי 50 מ ל, לסובב אותם ב- 1,800 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 8 דקות להשליך תגובת שיקוע.
    5. רחץ תאים עם 30 מ ל תמיסת פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS). צנטריפוגה ב 1,800 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות.
    6. למחוק את תגובת שיקוע. Resuspend תאים 1 מ"ל של DPBS.
    7. לקחת את aliquot של תאים ומערבבים אותו עם 3.5% פורמלדהיד פתרון.
    8. לספור תאים על-ידי hemocytometer וקבע את הריכוז שלהם. להעביר את מספר התאים הרצוי לתוך צינור microfuge. Lysate המוכן 0.5x108-2 x 108 תאים למ"ל מספיקה לטעינה מעבר צבע אחד סוכרוז.
    9. לסובב את התאים ב 1,800 x g וזורקים 4 ° C עבור 8 מינימלית של תגובת שיקוע.
    10. Resuspend בגדר תא על הקרח ב 1 מ"ל של פירוק מאגר המכיל מעכבי פרוטאז והמעכב RNase (20 מ"מ HEPES-קו, pH 7.4, 100 מ מ אשלגן כלורי, 10 מ מ MgCl2, 2 מ מ. DTT, 1% NP-40, 1 x פרוטאז מעכב קוקטייל (חינם EDTA), מעכב RNase 200 יחידות/mL).
    11. עוברים את lysate מחט בקוטר 23 שלוש פעמים. Lysate צריך להיות שקוף לאחר המעבר דרך המחט.
    12. צנטריפוגה ב 11,200 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות להבהיר lysate. להעביר את שקופה lysate טרי צינור ולשמור אותו בקרח עד ultracentrifugation הדרגתיות סוכרוז.
    13. לאסוף 400-500 μL של lysate כקלט (כדי לנתח מאוחר יותר), תקפיא מיד בחנקן נוזלי לצורך ניתוח עתידי חלבון או הוספת ריאגנט טיהור RNA לפני הקפאת לניתוח RNA.
  2. הכנה lysate cytoplasmic בתרבית תאים הלה אנושי
    1. לפצל תאים הלה, זרע אותם לתוך 20 מ"ל של המדיום DMEM המכיל 10% FBS תערובת פניצילין/סטרפטומיצין (100 יחידות, 100 μg/mL בהתאמה) עם תא לסמוך 2 x 105 תאים/מ ל צלחת 15 ס מ.
    2. לגדל תאים הלה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 עבור 20-24 ח' בצע פלסמיד DNA תרביות תאים על פי הפרוטוקולים של היצרן.
    3. הפצת התאים עבור 24 שעות לאחר תרביות תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
    4. להוסיף cycloheximide תאים בוגרים הלה הריכוז הסופי של 100 μg/mL לעצור הריבוזומים על mRNAs מתורגם, דגירה תאים עבור 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. וביופסיה בינוני. לשטוף את התאים פעמיים עם DPBS קר על קרח.
    5. להוסיף 500 μL פירוק מאגר (20 מ מ HEPES-KOH pH 7.4, 100 מ מ אשלגן כלורי, 5 מ מ MgCl2, 1 מ"מ DTT, 0.5% NP-40, 1 x מעכב פרוטאז קוקטייל (EDTA-חינם), 200 יחידות/mL של הפארין RNase מעכב או 1 מ"ג/מ"ל) לצלחת, לגרד את התאים על קרח.
    6. העבר את התאים lysed ברכבת התחתית microfuge. התאם את הריכוז של NP-40 ועד 0.5% MgCl2 ל- 5 מ מ לפי נפח מוגבר של המדגם.
    7. עוברים את lysate מחט בקוטר 23 3 - 6 פעמים.
    8. ספין ב 11,200 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות להבהיר lysate. לאחר צנטריפוגה, להעביר תגובת שיקוע צינור חדש. השתמש ספקטרופוטומטרים כדי להעריך את יעילות פירוק התא לקבוע סכום לדוגמה עבור טעינת במעבר הצבע. להוסיף 10 μL מדגם 0.5 מ של 0.1% נתרן Dodecyl סולפט (מרחביות). ריק נגד 0.1% מרחביות. למדוד את ספיגת-260 ננומטר. ערך ספיגת הצפוי הוא סביב 15-20 יחידות/mL.
    9. לדלל כל הדגימות עם פירוק מאגר לאותם הערכים ספיגת לפני צנטריפוגה הדרגתיות סוכרוז. לשמור דגימות על הקרח עד צנטריפוגה הדרגתיות סוכרוז.
  3. הכנה lysate cytoplasmic מן העכבר testis
    1. לנתח בזרמה העכבר. עושים חתך קטן ב albuginea tunica לאסוף את בקוריאנית וכמה של האשכים, להעביר אותם 15 מ"ל צינור חרוטי המכיל 5 מ של DPBS בתוספת 0.1 מ מ phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF).
    2. מערבבים היטב את הרקמה על ידי היפוך מספר פעמים. לאפשר את הרקמה להתיישב גראויטי יחידה על קרח למשך 5 דקות.
    3. להסיר ולמחוק את המאגר מעונן המכיל תאים חיבור ושברי רקמות. חזור על הפעולות 2-3 פעמים נוספות. בגדר לבנה הנותר הוא מועשר וכמה בקוריאנית, בתאי הנבט.
    4. בגדר צנורית וכמה להעביר צינור microcentrifuge 2 מ"ל וזורקים ספין-500 g x עבור מינימלית 1 את תגובת שיקוע.
    5. להוסיף 500 µL מאגר פירוק (20 מ מ טריס-HCl, pH 7.4, 100 מ מ אשלגן כלורי, 5 מ מ MgCl2, 1 מ"מ DTT, 0.5% NP-40, 1 x מעכב פרוטאז קוקטייל (חינם EDTA), 1 מ"ג/מ"ל הפארין או 200 יחידות/mL של מעכב RNase) בקוריאנית. השתמש פיפטה כדי triturate את הרקמה.
    6. להעביר את המתלים קטן (0.5-1.0 מ"ל) דאונס מהמגן. לשבש את הרקמה במשיחות שבע או שמונה של איחדו הזכוכית.
    7. להעביר את lysate אל צינור microcentrifuge 1.5 mL.
    8. Centrifuge המדגם-12,000-g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות לנקות את lysate. להעביר את תגובת שיקוע שפופרת חדשה בעלת החנות על הקרח עד טעינה במעבר הצבע סוכרוז.
    9. לאסוף 50 μL של lysate כדוגמה קלט, תקפיא מיד ב-80 מעלות צלזיוס לצורך ניתוח עתידי חלבון; או הוספת ריאגנט טיהור RNA לפני הקפאת לניתוח RNA.

2. סוכרוז הדרגתיות והכנה Ultracentrifugation

  1. להכין שני סוכרוז הדרגתיות פתרונות (20 מ מ HEPES-קו, pH 7.4, 100 מ מ אשלגן כלורי, 10 מ מ MgCl2, 1 מ"מ DTT, מעכבי פרוטאז x 1 קוקטייל), המכיל 10% סוכרוז או 50% סוכרוז. (טריס-HCl, pH 7.4, יכול לשמש במקום HEPES). להוסיף 200 יחידות/mL הפארין מעכב או 1 מ"ג/מ"ל RNase לפי הדגם ניסיוני. למקם את צינור ultracentrifuge של הרוטור SW 41 הרחוב סמן וצייר את הקו לאורך הקומה העליונה של הבניין. העברת הצינור לתוך ארון תקשורת יציבה.
  2. לקחת מזרק 10-mL עם המכשיר לקרנל המצורף ולמלא את המזרק עם פתרון 10% סוכרוז (להכין כאמור לעיל). בעדינות שחררו אותו בתחתית השפופרת ultracentrifuge עד שהוא מגיע הסימן על המרקע.
  3. ממלאים מזרק נוסף עם 50% סוכרוז פתרון ולהוסיף בזהירות את ההתקן לקרנל שלו דרך השכבה 10% סוכרוז לתחתית הצינור. משחררים בעדינות פתרון סוכרוז החל מלמטה, עד שהוא מגיע הסימן על המרקע. חותם את הצינור עם הכיפה שסופקו.
  4. כדי להכין את המילוי ההדרגתי של סוכרוז, הפעל את ההתקן יוצר מעבר צבע . רמה את הצלחת באמצעות למעלה או למטה לחצני ' ולחץ על ' סיום'. החלקת חשוב ליניאריות של מעבר הצבע.
  5. לאחר ההחלקה העיתונות צלחת גראד כדי לפתוח את תפריט מעבר צבע. עבור לרשימה בתפריט מעבר צבע ובחר הרוטור SW 41 Ti. לאחר מכן בחר את ההדרגה סוכרוז הרצוי מהרשימה של התפריט באמצעות לחצני עולה ויורד . הקש על השימוש.
  6. המקום בעל שפופרת צבע על הצלחת maker הדרגתיות. העברת הצינור לתוך למחזיק. עד 6 מעברי צבע ניתן להכין באותו זמן. לחץ על הפעל. הבורא הדרגתיות סיבוב הצינורות מהירות מתוכנתים, זוויות ויוצרים מעבר צבע ליניארי. זה ייקח רק כמה דקות כדי להכין את המילוי ההדרגתי.
  7. כאשר התהליך יושלם, למקם הצינורות בארון תקשורת. . תוריד את הפקקים. הסר באותו אמצעי אחסון אחסון הדגימה החלק העליון של הצינורות ultracentrifuge.
  8. בזהירות לטעון 400-500 μL של lysate המכיל 15-20 A260 יחידות של polysomes על גבי. למקם את הצינורות הדליים הרוטור ולאזן אותם.
  9. צנטריפוגה ב x הכולל כ-260,000 g ו- 4 ° C כבר שעתיים באמצעות SW 41 הרוטור.

3. polysome Fractionation ואוסף מדגם

הערה: בעוד ההכנות lysate יש כמה הבדלים בהתאם לסוג מקור, הפרוטוקולים fractionation ההדרגתי של הכנה ו- polysome זהים לכל סוגי lysates.

  1. לאחר השלמת ultracentrifugation, במקום את הרוטור דליים עם הצינורות על קרח. להפעיל או אספן החלקיקים הדרגתיות fractionator ON. לחץ על סרוק בתפריט fractionator. להכניס ארון תקשורת עם צינורות איסוף 24 שעות ביממה אספן שבר.
  2. למלא את מאגר שטיפה בצד fractionator עם מים יונים. הקש על המקש שטיפה עבור 10 s כדי לשטוף את המשאבה על fractionator. לחבר מתאם שטיפה עם המזרק מלא במים, זה עובד עבור הכיול.
  3. פתח את תוכנת fractionator במחשב. הקש על כיול. השתמש בהגדרות ברירת מחדל ' ולחץ על ' אישור'. תהיו מוכנים להזריק מים מן המזרק.
  4. לחץ על אישור כדי לעשות כיול. מיד להתחיל להזריק מים 5 הבא s. במהלך תקופה זו, המים יזרמו דרך התא זרימה של גלאי UV, המכשיר מכויל. הסימן אפס כיול שהושלמו יופיעו. המכשיר מוכן עבור fractionation.
  5. הסר את מתאם שטיפה עם המזרק. טיפ לצרף הבוכנה של fractionator.
  6. לפתוח את פליז אוויר שסתום ולחץ אוויר המפתח עבור 10 s כדי אבובים יבש ותא זרימה. סגור את שסתום האוויר.
  7. בעדינות להסיר את הצינור הדרגתיות מהדלי הרוטור ולמקם אותו בארון. להחיל את הצינורית מחזיק לחלק העליון של הצינור, בזהירות להזיז את הצינור לתוך בעל שפופרת ונעל אותה בעמדה.
  8. המקום בעל תחת הבוכנה של fractionator. לעתים קרובות, ניתן לראות להקות polysomal לפי העין. להציג את ההגדרות הרצויות עבור מספרים שבר ונפח (שברים 24-μL 500/שבר הן בדרך כלל מספקות). שם הקובץ כראוי. לחץ על אישור, ולאחר מכן ללכת כדי גרף לחצן. בחלון הבא, לחץ להתחיל לסרוק. הגדרות יופיע, לחץ על אישור. האספן מעביר מהמרזב אל השבר הראשון, הבוכנה יעברו לתוך הצינור. כאשר הבוכנה מגיע למעלה של מעבר הצבע זה יהיה להאט מהירות שנבחר, השברים ייאספו. כאשר הושלמה, הבוכנה עובר יצא הצינור מעבר צבע.
  9. פתח את פליז אוויר שסתום ולחץ אוויר מפתח fractionator כדי לאחזר את השבר האחרון.
  10. להעביר הצינורות המדף על קרח.
  11. להוסיף 2 כרכים של RNA ריאגנט טיהור כל שבר, פלאש להקפיא במצב חנקן נוזלי עד ה-RNA טיהור. לחלופין, אם חלבון צריך להיות מנותח, להוסיף חומצת חומץ טריכלור הריכוז הסופי של 10% לרכז אותם המערבי סופג (ראו סעיף 8).

4. הכנה של RNA מלאכותי ב חוץ גופית נרמול mRNAs רמות במהלך ניתוח נתונים RT-qPCR

הערה: ה-mRNA e. coli OmpA משמש בפרוטוקול זה עבור נרמול. RNA אחרים שאין לו זהות נרחב עם mRNAs של האורגניזם ולמד (מידע יונקים או לישמניה) יכול לשמש.

  1. להכין את השבר OmpA DNA המכיל רצף יזם SP6 כתוצאה מתגובה סטנדרטי PCR מ פלסמיד המכיל גנים OmpA30.
  2. להכין µL 100 של התערובת: 80 מ מ HEPES-קו, pH 7.5, 16 מ מ MgCl2, 2 מ מ Spermidine, 10 מ מ DTT, 3 מ מ ATP, 3 מ מ CTP, 3 מ מ UTP, 3 מ מ GTP, 0.5 U/μL RNase מעכב, μg 1 של OmpA PCR DNA, 3 μL SP6 RNA פולימראז , Pyrophosphatase U/μL 0.005.
  3. דגירה ב 40 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
  4. לטהר RNA על-ידי ערכת טיהור RNA.
  5. למדוד ריכוז על ידי ספקטרופוטומטרים, לבחון על ידי agarose בג'ל.

5. RNA בידוד מן הדרגה שברים ומספרים cDNA הכנה

הערה: להמשיך ישירות עם פרוטוקול זה לטיהור RNA אם מעכב RNase שימש מעכב ריבונוקלאז. עם זאת, כאשר הוא משמש מעכב ריבונוקלאז, הפארין ימנע טרנסקריפטאז משמש כהכנה cDNA. לכן, יהיה צורך טיהור נוסף של RNA אם הפארין שימש את פירוק מאגר ומילוי הדרגתי. ראה סעיף 6 כדי להתכונן רנ א cDNA סינתזה אם הפארין.

  1. להפשיר את הדגימות המכיל RNA טיהור ריאגנט, להוסיף 20 ng של RNA סינתטיים כמו בקרה פנימית על נורמליזציה של RT-qPCR תוצאות. להמשיך עם ה-RNA הכנה לפי הפרוטוקול של היצרן מלבד שינוי אחד. להוסיף 1 µL של רנ א כיתה גליקוגן (20 µg) אלכוהול איזופרופיל מוקדמת משקעים. להמיס RNA כדורי ב- 20-25 µL RNase ללא מים.
    הערה: גליקוגן בה כנשא ומסייע למנוע הפסדים והמחש RNA צניפה במהלך טיהור. OmpA mRNA משמש נוסף נורמליזציה בתגובות RT-qPCR.
  2. למדוד ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטרים כדי להבטיח תשואה נאותה. לשלב נפחים שווים של RNA שברים המכיל בשנות ה-40, בשנות ה-60, monosomes כמו prepolysomes. שברים המכיל 2-4 הריבוזומים לשלב כמו polysomes אור ומשלבים שברים עם 5-8 הריבוזומים כמו כבד polysomes.
  3. השתמש µL 5-10 של RNA של שברים משולבים כדי להכין cDNAs באמצעות ערכת ובעקבות המלצות היצרן.
  4. מוסיפים 80 µL של מים בחינם נוקלאז µL 20 של cDNA. להקפיא את הדגימות cDNA ב-20 ° C.

6. RNA לטיהור מפני זיהום הפרין

הערה: הפארין מעכב חומצת גרעין עיבוד אנזימים כגון רוורס טרנסקריפטאז. לכן, להשתמש בפרוטוקול זה טיהור נוסף כאשר הפרין נעשה שימוש במאגר של פירוק ו/או במעבר הצבע.

  1. להוסיף LiCl ריכוז 1 מ' סופית את הדגימות RNA מטוהרים.
  2. לערבב את הדגימות, דגירה על קרח לשעה.
  3. לסובב את הדגימות-16,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  4. הסר את תגובת שיקוע ככל הניתן באמצעות פיפטה.
  5. מילה נהדרת כדורי למשך בערך 5 דקות.
  6. מחדש להשעות את כדורי בהיקף הראשונית של מים נטולי RNase.
  7. לבצע מדידה spectrophotometric ב-260 nm כדי לקבוע ריכוז RNA. בדרך כלל, האובדן של המדגם היא מזערית.

7. RT-qPCR וניתוח נתונים של mRNA הפצה

  1. לשלב 10.2 μL של מים, μL 20 של SYBR Green, 4.8 μL של גנים ספציפיים תחל (2.5 μM בכל סט), μL 5 של cDNA, מערבבים היטב, לטעון μL 10 לכל באר triplicates לתוך צלחת 384-. טוב.
  2. מכסה צלחת עם סרט דביק בחוזקה, צנטריפוגה צלחת ב g 1,800 x למשך 5 דקות.
  3. באמצעות מכשיר PCR בזמן אמת להגדיר את התגובה qPCR בתנאים המוצגים בטבלה 1.
  4. באמצעות הסף מחזור (סיטי) שיטת CT (ΔΔCT) השוואתי31 וערכים חישוב האחוזים (%) של mRNA התפלגות prepolysomes, אור ו polysomes כבד כמו שמתואר32 בשינוי אחד. השתמש RNA סינתטי (OmpA כאן) עבור נרמול נתונים, ניתוח נתונים RT-qPCR. הרנ א סינתטי מספק פקד נורמליזציה המאפשר לחשב את רמות היחסי mRNAs ולהשוות אותם בחלקים שונים של מעבר צבע.

8. ניתוח של חלבונים בחלקים Polysomal על ידי סופג המערבי

  1. מ- 100% (w/v) מניה, להוסיף חומצת חומץ טריכלור (TCA) שברים שנבחר (500 μL) כדי ריכוז סופי של 10%, לשמור על קרח למשך 15 דקות לפחות, צנטריפוגה, microfuge במשך 5 דקות, למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף פעמיים עם אצטון קפואים, להמיס μL 25 של S DS-דף לדוגמה מאגר טעינה עבור אלקטרופורזה.
  2. לטעון על העמוד מרחביות ולנהל אלקטרופורזה סטנדרטי עם העברה הבא למוח PVDF. המשך המערבי סופג33.

תוצאות

במחקר זה, אנו מתארים את היישום של הטכניקה פרופיל polysomal על שלושה מקורות שונים: טפיל לישמניה הגדולותבתרבית תאים אנושיים, העכבר testis. לישמניה תאים לגדול באופן חופשי בתקשורת נוזלי ההשעיה, בתרבית תאים אנושיים לגדול טפט חסיד על צלחות ומייצג בזרמה העכבר דגימת רקמה. השיט...

Discussion

Polysome fractionation על ידי הדרגה סוכרוז בשילוב עם ה-RNA, אנליזת חלבונים שברים היא שיטה חזקה כדי לנתח מצב translational mRNAs בודד או כל translatome, כמו גם תפקידים של חלבון גורמי ויסות translational מכונות במהלך למצב רגיל פיזיולוגיים או מחלה. פרופיל polysomal היא טכניקה מתאים במיוחד ללמוד תקנה translational אורגניזמים כגון trypanosomat...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מודים לי צ'ינג על עזרה עם הקלטת אודיו. המחקר נתמך על ידי ראשונית של טקסס טק האוניברסיטה למדעי הבריאות מרכז, על ידי מרכז המצוינות במדעי המוח Translational ו הרפוי (CTNT) להעניק PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K.; בחלקו על ידי מענק NIH R01AI099380 ג'יימס K.Z. ג האפמן, קריסטין ר' באקה היו מלומדים CISER (מרכז עבור אינטגרציה של גזע חינוך & מחקר), נתמכו על-ידי התוכנית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Instruments:
Gradient masterBiocomp Instruments Inc.108
Piston Gradient FractionatorBiocomp Instruments Inc.152
Fraction collectorGilson, Inc.FC203B
NanoDrop OneThermo ScientificNanoDrop One
Nikon inverted microscopeNikonECLIPSE Ts2-FL/Ts2
2720 Thermal CyclerApplied Biosystems by Life Technologies4359659
CO2 incubatorPanasonic Healthcare Co.MCO-170A1CUV
HERATHERM incubatorThermo Scientific51028063
Biological Safety Cabinet, class II, type A2NuAire Inc.NU-543-400
Revco freezerRevco TechnologiesULT1386-5-D35
Beckman L8-M UltracentifugeBeckman CoulterL8M-70
CentrifugeEppendorf5810R
CentrifugeEppendorf5424
Ultracentrifuge Rotor SW41Beckman Coulter331362
Swing-bucket rotorEppendorfA-4-62
Fixed angle rotorEppendorfF-45-30-11
Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228Applied Biosystems by life technologies4470661
TC20 Automated cell counterBio-Rad145-0102
HemacytometerHausser Scientific02-671-51B
Software 
Triax software Biocomp Instruments Inc.
Materials:
Counting slides, dual chamber for cell counterBio-Rad145-0011
1.5 mL microcentrifuge tubeUSA Scientific1615-5500
Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm)Seton Scientific7030
Syringe, 5 mLBD309646
BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch NeedleBD10020439
Nunclon Delta Surface plate, 14 cmThermo Scientific168381
Nunclon Delta Surface plate, 9 cmThermo Scientific172931
Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPESThermo Scientific569-0020
BioLite 75 cm3 flasksThermo Scientific130193
Nunc 50 mL conical centrifuge tubesThermo Scientific339653
Chemicals:
Trizol LSAmbion by Life Technologies10296028
HEPESFisher ScientificBP310-500
Trizma baseSigmaT1378-5KG
Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM)SigmaD6429-500ML
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF0926-50ML
Penicillin-Streptomycin (P/S)SigmaP0781-100ML
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)SigmaD8537-500ML
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O)Acros OrganicsAC413415000
Potassium Chloride (KCl)SigmaP9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40)Fluka (Sigma-Aldrich)74385
Recombinant Rnasin Ribonuclease InhibitorPromegaN2511
Heparin sodium saltSigmaH3993-1MU
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitorsRoche Diagnostics11836170001
GlycogenThermo ScientificR0551
WaterSigmaW4502-1L
CycloheximideSigmaC7698-1G
ChloroformFisher Scientific194002
Dithiotreitol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Ethidium BromideFisher ScientificBP-1302-10
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA)Fisher ScientificS316-212
OptimemLife Technologies22600050
Puromycin dihydrochlorideSigmaP8833-100MG
SucroseFisher ScientificS5-3KG
Trypsin-EDTA solutionSigmaT4049-100ML
Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase KitApplied Biosystems by life technologies4368814
Power SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems by life technologies4367659
HClFisher ScientificA144SI-212
IsopropanolFisher ScientificBP26324
Potassium Hydroxide (KOH)Sigma221473-500G
Anti-RPL11 antibodyAbcamab79352
Ribosomal protein S6 (C-8) antibodySanta Cruz Biotechnology Inc.sc-74459
1xM199SigmaM0393-10X1L
Lithium clorideSigmaL-9650
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificD128-500
Gel Loading Buffer IIThermo ScientificAM8546G
UltraPure AgaroseThermo Scientific16500-100
Trichloracetic acid (TCA)Fisher ScientificA322-100
SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrateThermo Scientific34580
FormaldehydeFisher ScientificBP531-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)SigmaL5750-1KG
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)SigmaP7626-5G
RNeasy Mini kitQiagen74104
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)SigmaA1852-1VL
Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP)SigmaC1506-250MG
Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP)SigmaU6625-100MG
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP)SigmaG8877-250MG
SP6 RNA PolymeraseNEBM0207S
PyrophoshataseSigmaI1643-500UN
SpermidineSigmaS0266-1G

References

  1. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host. PLoS One. 8 (6), e67069 (2013).
  3. Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).
  4. Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).
  5. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  6. Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
  7. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
  8. Zuccotti, P., Modelska, A. Studying the Translatome with Polysome Profiling. Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).
  9. Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), e15 (2017).
  10. Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).
  11. Gandin, V., et al. nanoCAGE reveals 5' UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).
  12. Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
  13. Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p. Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).
  14. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  15. Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
  16. Robichaud, N., Sonenberg, N. Translational control and the cancer cell response to stress. Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).
  17. Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).
  18. Ishimura, R., et al. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration. Science. 345 (6195), 455-459 (2014).
  19. Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).
  20. Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).
  21. Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 14 (11), R128 (2013).
  22. De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. Gene expression regulation in trypanosomatids. Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).
  23. Alves, L. R., Goldenberg, S. RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).
  24. De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra. Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).
  25. Soto, M., et al. Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum. Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).
  26. McNicoll, F., et al. Distinct 3 '-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).
  27. Folgueira, C., et al. The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 '-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).
  28. Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania. Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).
  29. Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
  30. Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane. Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).
  31. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  32. Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles. Bio Protocols. 7 (3), (2017).
  33. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (1989).
  34. Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).
  35. Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
  36. van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).
  37. Morita, M., et al. mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1. Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).
  38. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

134mRNApolysomeRT qPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved